Закрытие ип ифнс: Я хочу прекратить деятельность ИП | ФНС России

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

138. Forero A, Ozarkar S, Li H, Lee CH, Hemann EA, Nadjsombati MS, et al. Дифференциальная активация фактора транскрипции IRF1 лежит в основе различных иммунных ответов, вызываемых интерферонами типа I и типа III. Иммунитет (2019) 51 (3): 451–64.e6. doi: 10.1016 / j.immuni.2019.07.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

139. Porritt RA, Hertzog PJ. Динамическое управление сигнализацией IFN типа I с помощью интегрированной сети отрицательных регуляторов. Trends Immunol (2015) 36 (3): 150–60. doi: 10.1016 / j.it.2015.02.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

141. Francois-Newton V, Magno de Freitas Almeida G, Payelle-Brogard B, Monneron D, Pichard-Garcia L, Piehler J, et al.Контроль отрицательной обратной связи на основе USP18 индуцируется интерферонами типа I и типа III и специфически инактивирует ответ интерферона альфа. PLoS One (2011) 6 (7): e22200. doi: 10.1371 / journal.pone.0022200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Потенциальная роль интерферонов в лечении пациентов с COVID-19

Основные моменты

•

Кризисы COVID-19 возникают по распространение тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2).

•

SARS-CoV-2 может вызывать от слабых до тяжелых респираторных заболеваний и даже смерть пациентов.

•

Разработка эффективной терапии является неотложной задачей для борьбы с пандемией SARS-CoV-2.

•

IFN оказались решающими в борьбе с SARS-CoV-2 у пациентов с COVID-19.

•

Комбинированная терапия может быть более эффективной для лечения этого заболевания, чем монотерапия.

Реферат

Недавний кризис общественного здравоохранения в мире вызван распространением коронавируса 2 (SARS-CoV-2), также известного как COVID-19.Вирус происходит от летучих мышей и переносится к людям через неопределенных промежуточных животных. Этот вирус может вызывать от слабых до тяжелых респираторных заболеваний, включая острый респираторный дистресс-синдром (ARDS), синдром полиорганной недостаточности (MODS), пневмонию и даже смерть пациентов. Болезнь COVID-19 распространяется при вдыхании через зараженные капли или при контакте с зараженной средой. Время инкубации составляет от 2 до 14 дней, и симптомы обычно включают лихорадку, боль в горле, кашель, недомогание, утомляемость, одышку и другие.Следует учитывать, что многие инфицированные люди протекают бессимптомно. Несколько лабораторий поддерживают разработку различных иммунологических и вирусологических методов диагностики этого заболевания. Лечение в основном поддерживающее; однако есть несколько агентов, которые используются для лечения пациентов с COVID-19. Интерфероны (IFN) имеют решающее значение в борьбе с COVID-19 и могут быть подходящим кандидатом для лечения этих пациентов. Комбинированная терапия может быть более эффективной для лечения этого заболевания, чем монотерапия.Профилактика требует изолирования подозреваемых людей и домашнего карантина, а также оказания помощи инфицированным людям с легкой или тяжелой формой заболевания в больницах. Поскольку вспышка SARS-CoV-2 ускорилась, разработка эффективной терапии является неотложным требованием для борьбы с вирусом и предотвращения дальнейшей пандемии. В этой рукописи мы рассмотрели доступную информацию о SARS-CoV-2 и возможных методах лечения пациентов с COVID-19.

Ключевые слова

SARS-CoV-2

COVID-19

Респираторный коронавирус

Пневмония

Интерферон

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

© 2020 Elsevier B.V. Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Ротавирусная инфекция индуцирует как интерферон (IFN), так и резистентность к воспалению путем перепрограммирования передачи сигналов кишечного рецептора IFN

Введение

Ротавирусы представляют собой сегментированные вирусы дцРНК без оболочки, которые вызывают тяжелую дегидратирующую диарею у многих млекопитающих. , в результате чего ежегодно умирает около 200 000 младенцев (1). Острая инфекция RV у гомологичного хозяина (естественный вид, у которого штамм RV реплицируется с высоким титром и распространяется от человека к человеку) является чрезвычайно эффективным процессом; тяжелая диарея может быть вызвана воздействием очень маленького инфекционного инокулята (2).Ответ на врожденный интерферон хозяина (IFN) представляет собой многостороннюю линию защиты от вирусных патогенов, поскольку его индукция может активировать сотни различных антивирусных генов и запускать воспалительные сигналы, тем самым устраняя инфицированные клетки, ограничивая распространение вирусной инфекции на неинфицированные клетки-свидетели, и формирование как величины, так и качества последующего адаптивного иммунного ответа (3–5). Индукция всех трех основных типов IFN (α / β, γ и λ ) происходит во время гомологичной инфекции RV тонкой кишки (6–10), но противовирусные эффекты IFN-ответа на гомологичную репликацию RV в лучшем случае скромны (10).Несмотря на то, что IFN-опосредованные воспалительные реакции плохо изучены, они также, вероятно, уменьшаются при инфекции RV, которая связана только с легким воспалением кишечника (11, 12) по сравнению с другими острыми диарейными патогенами (13). Как RV эффективно подрывает способность различных типов IFN выполнять свои противовирусные и воспалительные функции (14), не совсем понятно.

С другой стороны, инфицирование гетерологичными RV (RV, как правило, не выделяется из инфицированных видов хозяев) обычно приводит к сильно ограниченному репликации в кишечнике и незначительной или отсутствующей устойчивой передаче неинфицированным хозяевам (11, 15, 16).У мышей-сосунков репликация некоторых гетерологичных штаммов RV в кишечнике существенно ограничена (~ 10 ⁴ раз), но может быть частично устранена удалением рецепторов IFN или нижележащего конвергентного фактора транскрипции STAT1, тем самым демаскируя ключевую роль IFN в подавлении Инфекционность RV у гетерологичных видов хозяев (7, 10, 11, 16). Истощение IFNR у грудных мышей также может привести к острому воспалительному заболеванию желчевыводящих путей (часто летальному) после инфицирования гетерологичным штаммом Rhesus RV (RRV) (11).Таким образом, определение механизмов, с помощью которых гомологичные RV подавляют противовирусные и воспалительные реакции хозяина IFN в кишечнике, имеет жизненно важное значение для разработки более эффективных стратегий борьбы с заболеваниями и смертностью, связанными с RV, и для понимания патогенного потенциала естественно циркулирующих штаммов RV.

Результаты

Гомологичная инфекция RV ограничивает ответы амплификации IFN в кишечнике

Мы сравнили репликацию вируса в кишечнике и противовирусные ответы между ограниченным репликацией, IFN-чувствительным штаммом обезьян (RRV) и компетентным к репликации, IFN-устойчивым RV мыши. штамм (EW) (10) при 12 и 72 hpi с помощью qRT-PCR (рис. 1A-B).Оба штамма RV сравнимо индуцировали три основных транскрипта IFN-типа (IFN-α / β, IFN-γ и IFN- λ , фиг. 1A) при 12 hpi. Сходная индукция путей IFN обоими штаммами RV поддерживается на уровне белка путем измерения кишечного IFN- γ , который продуцируется как у EW, так и у RRV RV-инфицированных детенышей мыши при 24 hpi (фиг. 1C). Некоторые IFN-стимулированные гены (ISG) также транскрипционно индуцировались на 12 hpi с аналогичной эффективностью как EW, так и RRV ( IRF7 , ISG15 , IFIh2 , DDX58 , IRF9 , IFIT2 909 MX2 ).

(A-B) Транскрипционный анализ кишечных транскрипционных ответов на штаммы EW мышей и RRV RV обезьян. Сосущих мышей в возрасте от трех до пяти дней (N = 4 на группу) инфицировали мышиными штаммами EW или обезьяньими штаммами RRV RV (или ложными), и через 12 часов или 72 часов тонкий кишечник собирали для транскрипционного анализа хозяина (A). и гены RV (B).(C) Кишечную секрецию IFN-γ измеряли с помощью Luminex после инфицирования RV через 24 часа на дюйм, как в (A) (N = 3 образца на группу, каждый образец объединен от 3 детенышей; ND, не обнаружено).

Несмотря на индукцию IFNs и различных транскриптов ISG с аналогичной или более низкой эффективностью, уровни транскрипта NSP5 EW RV в кишечнике были заметно выше, чем RRV при 12 hpi (более чем в 10 ⁴ раз, рис. 1B). Удивительно, но через 72 hpi индукция нескольких типов IFN и транскриптов ISG оставалась сопоставимой у мышей, инфицированных мышиным или обезьяньим RV (рис.1A и фиг. S1). Однако репликация EW RV на 72 hpi оставалась существенно выше, чем RRV RV (в ~ 10 ⁴ раз, фиг. 1B и фиг. S2). Единственным исключением из этих результатов был IL28A (кодирующий IFN- λ 2), который был значительно выше (~ 10 раз) у детенышей, инфицированных EW RV, при 72 hpi. Что касается кинетики, индукция IFNs типа I ( IFNA4 и IFNA5 ) и IRF7 транскриптов обоими штаммами RV значительно увеличивалась от 12 до 72 hpi, в то время как индукция IFN типа II ( IFNG ) и типа III ( IL28A ) снизился в течение периода инфицирования.Следует отметить, что 12-часовая индукция нескольких генов, стимулированных интерфероном, и воспалительные реакции транскрипции у детенышей, инфицированных EW RV, были практически устранены через 72 hpi ( IL6 , CXCL10 , ISG20 , IFI203 , PELI1 , IFIh2 , DDX58 , IRF9 , IFIT2 , 72 hpi, фиг. 1A), напоминающие ответы амплификации IFN на некомпетентные к репликации RRV RV. Таким образом, кишечные ответы амплификации IFN на EW и RRV не отражают заметных различий в фактической репликации вируса между этими двумя типами RV.Вероятное объяснение этих результатов состоит в том, что, несмотря на существенную продолжающуюся репликацию EW RV в кишечнике и индукцию генов IFN в течение первых 3 дней инфекции, гомологичный мышиный RV подавлял амплификацию кишечных ISG и воспалительных генов на 72 hpi.

Репликация гомологичного ротавируса подавляет расщепление нескольких каспаз в кишечнике.

Приведенные выше результаты показали, что некоторые IFN продолжают индуцироваться транскрипционно устойчиво в течение 72 часов во время гомологичной инфекции RV.Воздействие на клетки IFN (IFN-α / β и —γ ) в течение длительного времени обычно приводит к последовательному расщеплению инициаторной каспазы 8 и исполнительной каспазы 3, способствуя апоптозу (17–20). Как гомологичный RV борется с потенциалом опосредованной каспазой гибели клеток при устойчивой индукции различных кишечных типов IFN (рис. 1A, 1C), изучено недостаточно. Поэтому мы затем исследовали экспрессию предшественников (полноразмерных, FL) и расщепленных (Cl) форм инициатора каспазы 8, которая имеет решающее значение для внешней гибели клеток (21), у мышей, инфицированных EW RV.Иммуноблоттинг IEC тонкой кишки показал, что инфекция правого желудочка приводит к существенно пониженному соотношению изоформ Cl: FL каспазы 8 (2,2 в имитации по сравнению с 0,5 при инфицировании правого желудочка через 24 часа на дюйм, но не при 3 часах на дюйм) (рис. 2А). Предполагается, что дефектное расщепление каспазы 8 (фиг. 2A) нарушит последующее расщепление апоптотической каспазы 3-исполнителя, поэтому мы затем исследовали статус каспазы 3 во время инфицирования RV. Как и ожидалось, кишечник мышей-сосунков, инфицированных RV, также показал пониженное расщепление каспазы 3 (Cl.: Коэффициенты FL 1,4 и 0,4 у ложных и EW RV инфицированных, соответственно, при 24 hpi, но не 3 hpi) (рис. 2B). Эти неожиданные результаты показывают, что гомологичная инфекция RV ингибирует кишечные каспазы на стадии их активации зимогена.

(A-B) Анализ экспрессии каспазы 8 и каспазы 3. Детенышей мышей перорально инокулировали EW (R) или имитировали (M).Через 3 и 24 часа на дюйм основные кишечные клетки собирали из цельных тканей тонкого кишечника и обрабатывали для SDS-PAGE. Гели анализировали вестерн-блоттингом на предшественники (FL) и расщепленные (Cl.) Изоформы либо каспазы 8 (A), либо каспазы 3 (B), а также других белков. Нормализованные отношения Cl. к каспазам FL, определенные денситометрией, указаны ниже на отдельных панелях. (C) FACS-анализ расщепления каспазы 8 и каспазы 3. Резюме анализа проточной цитометрии CD45 ^— CD44 ^— ESA ⁺ IEC после внутриклеточного окрашивания на KI67 и расщепленной каспазы 8 или расщепленной каспазы 3 от инфицированных EW RV или контрольных детенышей при 24 hpi.(D) Процент IEC (CD45 ^— CD44 ^— ESA ⁺ ), демонстрирующих расщепленную каспазу 8 или расщепленную каспазу 3 у ложных и инфицированных EW мышей при 24 hpi, усредненный по результатам трех экспериментов; Планки погрешностей представляют собой стандартные ошибки средних значений. (E) Внутриклеточное окрашивание на структурный белок RV (VP6) и расщепленную каспазу 8 (верхняя панель) или расщепленная каспаза 3 (нижняя панель) в CD45 ^— CD44 ^— ESA ⁺ IEC после EW RV или имитационной инфекции в 24 hpi.(F) Иммуноблоттинг-анализ ткани тонкого кишечника от детенышей мышей, инфицированных EW, RRV или имитатором, и собранных в указанные моменты времени. (G) Анализ расщепления каспазой 9 в культивируемых фибробластах NIH 3T3, инфицированных IFN-стимулирующим штаммом RV, Великобритания. Клетки 3T3 инфицировали бычьим UK RV (или имитацией) в течение указанного времени, а затем анализировали с помощью иммуноблоттинга. Цифры под пятнами указывают нормализованные отношения Cl. к каспазе 9 FL. (H) IEC HT-29 человека инфицировали SB1-A RV свиньи (или имитатором) в течение указанного времени и анализировали с помощью иммуноблоттинга.Цифры под пятнами указывают нормализованные отношения Cl. к каспазе 8 FL. (I) Клетки HT-29, инфицированные указанными штаммами RV, анализировали на RIP1K, RIP3K и VP6 при 4 или 12 hpi с помощью иммуноблоттинга. (J) Клетки HT-29 были инфицированы SB1-A RV (или имитацией) или обработаны TNF-альфа (10 нг / мл) и циклогексимидом (10 мкг / мл) в течение 4 часов, а затем проанализированы на клеточную адгезию или фосфатидилсерин. маркерное выражение. Показанные данные являются репрезентативными для двух или более независимых экспериментов.

Расщепление каспаз 8 и 3 ингибируется как в инфицированных ротавирусом, так и в неинфицированных случайных ворсинчатых энтероцитах

Наблюдая, что инфекция RV in vivo приводит к нарушению процессинга каспазы-8 и -3 в IEC, мы затем исследовали, является ли этот процесс возникает, в частности, в эпителии ворсинок тонкой кишки (7).Используя проточную цитометрию, мы регистрировали живые ворсинчатые IEC, используя ранее описанную комбинацию маркеров клеточной поверхности (например, CD45 ^— ESA ⁺ CD44 ^— ) (7, 22), а затем измеряли экспрессию расщепленных форм любой из каспаз. 8 или каспаза 3 в RV инфицированных и ложных контрольных детенышах (рис. 2C). Эти эксперименты подтвердили существенное снижение расщепления каспазы 8 и каспазы 3 в ворсинчатых энтероцитах тонкого кишечника во время инфекции RV (~ 75% снижение расщепления каспазы 8 и каспазы 3 после инфекции).

Затем мы исследовали, происходит ли ингибирование расщепления каспаз только в инфицированных RV зрелых ворсинчатых IEC через 24 часа на дюйм, используя панель антител для определения типа клеток, активности каспазы и положительности VP6 RV (в качестве маркера статуса клеток в отношении инфицирования RV). (Рис. 2D). Примечательно, что эффективное подавление расщепления каспазой-8 происходит как в популяции зрелых ворсинчатых клеток VP6 ⁺ (инфицированные), так и в VP6 ^— (т.е. неинфицированные «свидетели»). Относительные соотношения клеток, положительных по расщепленной каспазе 8, в различных популяциях составляли: ~ 3.0 (имитация), 0,2 (прохожие) и 0,6 (инфицированный RV) (рис. 2D, верхние панели). Эффективный ингибирующий эффект инфекции RV на неинфицированные случайные клетки (т.е. VP6 ^—) также наблюдался после анализа расщепления каспазы 3 с использованием аналогичного подхода (рис. 2D, относительные отношения расщепления каспазой 3 составляли 4,0, 0,3 и 0,9 в псевдониме). , VP6 ^— случайных и VP6 ⁺ RV-инфицированных клеток, соответственно; рис. 2D, нижние панели).

В отличие от внешнего апоптоза, опосредованного каспазой 8, инициатор каспаза 9 расщепляется во время внутреннего апоптоза (23). Интересно, что мыши-сосунки, инфицированные EW RV, также демонстрировали нарушение расщепления каспазы 9 (рис. 2E), на что указывает накопление кишечной FL каспазы 9 на 16hpi, но не на 6hpi, по сравнению с RRV или ложно-инфицированными контролями (рис. .2E). Чтобы изучить роль IFN в этом процессе, мы определили, блокируется ли расщепление каспазы 9 в культивируемых фибробластах 3T3, инфицированных штаммом RV крупного рогатого скота UK, который, как мы ранее показали, запускает MAVS-зависимую секрецию IFN-β в этой клеточной линии (24, 25). Заражение клеток 3T3 UK RV в течение 9 часов подавляло расщепление каспазы 9 и опосредовало накопление зимогена FL-каспазы 9. Напротив, повышенная экспрессия Cl-каспазы 9 и снижение экспрессии FL-каспазы 9 происходили при 16 hpi (фиг. 2F). Эти результаты подтвердили, что ингибирующие эффекты RV на внутреннюю активность инициатора каспазы 9 не требуют ингибирования секреции IFN, и дополнительно показали, что расщепление каспазы может регулироваться во время инфекции RV.

Кинетическая регуляция каспаз с помощью RV была дополнительно исследована на линии клеток кишечного происхождения путем анализа динамики расщепления каспазы 8 в культивируемых клетках HT-29 после инфицирования штаммом свиного RV SB1-A, который, как мы ранее показали, предотвращает IFN- секреция β в этой клеточной линии (26). По сравнению с имитационно инфицированным контролем, инфицирование SB1-A RV ингибировало расщепление каспазы 8, начиная с 4 hpi, но с максимальным эффектом при 8 hpi (фиг. 2G). В совокупности эти исследования показывают, что RV в целом подавляет события инициаторного расщепления каспазы, существенные как для внешней, так и для внутренней гибели клеток, и регулирует эти процессы во времени во время инфекции.Результаты также продемонстрировали, что регуляторные эффекты RV на передачу сигналов апоптоза как in vitro, (фиг. 2F-G), так и in vivo (фиг. 2A-E) проявляются независимо от его способности подавлять индукцию IFN.

Несколько штаммов RV индуцируют расщепление регулятора клеточной гибели RIP1K

В ответ на длительное воздействие IFN расщепление каспазы 8 приводит к апоптотическому отщеплению эпителиальных клеток с обычно легкими воспалительными последствиями (20). Напротив, в клетках, дефектных по расщеплению каспазой 8 (например, IEC во время инфицирования EW RV in vivo , рис.2A-C), стимуляция IFN обычно направляет быструю и стремительную форму гибели клеток в результате некроптоза, который является острым воспалительным процессом (17, 27). Рецептор-взаимодействующая протеин-1 киназа (RIP1K) является важной адапторной киназой с двойной функцией на перекрестке решения клетки жить или умереть в ответ на апоптотические или некроптотические стимулы (28, 29). Эти противоположные функции RIP1K в основном регулируются протеолитическим механизмом (30, 31). В то время как сверхэкспрессия полноразмерного человеческого RIP1K запускает как апоптоз, так и некроптоз, опосредованное каспазой расщепление RIP1K ~ 75 кДа (p75) на нескольких сайтах в пределах киназного домена (KD) и домена взаимодействия (ID) генерирует более короткие фрагменты, полученные либо из RIP1K N-концевой (51 кДа, 37 кДа и 25 кДа) или С-концевой (39 кДа) области.Как p51, так и p39 RIP1K эффективно ингибируют функцию p75 RIP1K и расщепление каспазы 8, предотвращая апоптотическую и некроптотическую гибель клеток в ответ на устойчивые воспалительные стимулы (31).

Поскольку RV регулирует расщепление каспазы 8 во времени во время инфекции (Fig. 2F-G), мы исследовали, подвергается ли расщепление RIP1K также регуляции RV. Клетки HT-29 были инфицированы репрезентативными штаммами RV, различающимися по способам регуляции IFN in vitro (RRV обезьяны, деградирующей IRF3, SB1-A свиньи, ингибирующей NF-kB, и человеческий WI-61, и мутантный по NSP1 обезьяний SA11-5S. Штамм RV, который стимулирует секрецию IFN-β (32)) в течение 4 или 12 часов, а затем анализируется иммуноблоттингом с использованием анти- (N-концевого) антитела RIP1K (рис.2H). По сравнению с ложно инфицированными клетками HT-29 инфицирование различными штаммами RV приводило к усилению экспрессии p75 RIP1K на 4 hpi с различной эффективностью, и эта повышенная экспрессия также выявлялась позже во время инфицирования (на 12 hpi). Кроме того, инфекция RV также генерировала несколько более коротких фрагментов расщепления RIP1K p51 / p37 / p25, и в уровнях этих фрагментов расщепления были очевидны штамм-специфические различия. Примечательно, что все штаммы RV, включая SA11-5S, запускали расщепление p51-RIP1K, начинающееся на ранней стадии инфицирования, за исключением инфицирования штаммом RV человека WI-61, где повышенная экспрессия p51 RIP1K в первую очередь обнаруживается с помощью 12hpi.Более того, штаммы обезьян (RRV и SA11-5S) и человека (WI-61) RV индуцировали дополнительное расщепление RIP1K (p37 / p25 RIP1K — RRV и SA11-5S; p37 RIP1K — WI-61). Интересно, что SB1-A RV индуцирует повышенную экспрессию как (про-смерть) полноразмерной изоформы p75 RIP1K, так и более короткой (ингибирующей) изоформы p51 RIP1K (фиг. 2H, дорожки 5-6). Таким образом, мы исследовали, как функционально антагонистические фрагменты RIP1K (p75 и p51), которые экспрессируются во время инфекции SB1-A, влияют на гибель клеток. Мы обнаружили, что как адгезия клеток, так и экспрессия фосфатидилсерина (маркер апоптозных клеток) при 16 hpi в SB1-A RV-инфицированных клетках напоминают ложно инфицированные HT-29 клетки, предполагая, что повышенная экспрессия p75 RIP1K не вызывает гибель клеток.Напротив, клетки HT-29, обработанные смесью фактора некроза опухоли и циклогексимида, демонстрировали значительную потерю клеточной адгезии и повышенное апоптотическое окрашивание (фиг. 2I). Эти результаты показывают, что накопление RIP1K и его протеолиз регулируются во время инфекции RIP1K, и более короткая доминантно-отрицательная регуляторная изоформа RIP1K p51 генерируется многими RV на ранних стадиях инфекции, что потенциально может нарушать апоптоз и некроптоз.

Ротавирус ограничивает кишечные IFN-опосредованные воспалительные реакции

Помимо стимулирования IFNR-опосредованной и каспазозависимой воспалительной смерти, различные типы IFN также могут управлять выработкой воспалительных цитокинов с помощью IFNR-направленного процесса амплификации гена с положительной прямой связью ( 3, 33).Поэтому мы затем исследовали, подавляет ли гомологичная RV-инфекция грудных мышей, помимо ингибирования активации каспазы in vivo , синтез продуктов гена-мишени воспаления, стимулированного IFNR. Чтобы рассмотреть эту возможность, мы использовали экспериментальную схему, аналогичную рис. 1A, для измерения уровней продукции различных кишечных цитокинов с разрешением 1 dpi у сосущих мышей, инфицированных либо гомологичными мышиными (штамм EW), либо гетерологичными обезьянами (штамм RRV) RV (рис. 3A). ). Эти исследования показывают значительное увеличение продукции различных цитокинов в кишечнике в ответ на инфекцию гомологичных EW и / или гетерологичных RRV RV (RANTES, IP-10, IL1-A, EOTAXIN, GRO-A, MCP-3, MIP-1B). , IL-4, GM-CSF, IL-15, LIF; рис.3А). Из них набор цитокинов (MCP-3, IL-15, LIF, IL-10, MCP-1, MIP-2α и IL-18) был сравнительно повышен в ответ на репликационно-компетентные мышиные (EW) или ограниченный репликацией обезьяний (RRV) RV. Напротив, второй набор преимущественно провоспалительных цитокинов (RANTES, IP-10, IL1-α, Eotaxin, GRO-α, MIP-1b, IL-6, IL-4, GM-CSF и IL-17A) в первую очередь индуцировались у гетерологичных обезьяньих RRV-инфицированных детенышей. Эти цитокины коррелируют с плохой кишечной репликацией гетерологичных RV у мышей, хотя еще предстоит определить, вносят ли они какой-либо вклад в ограничение роста RRV.Поразительно, что несколько дифференциально секретируемых цитокинов в этом наборе, как сообщается, являются эффекторами, опосредованными IFN-α / β, IFN-, γ и / или IFN- λ (т.е. RANTES (34–36), IP-10 (35, 37), эотаксин (38), GRO-α (39, 40) и MIP-1b (36, 41, 42)). Это говорит о том, что успешная репликация в кишечнике гомологичного мышиного правого желудочка сопровождается подавлением IFNR-амплифицированных воспалительных цитокиновых ответов (14).

(A) Секреция кишечных цитокинов во время инфицирования RV мышей-сосунков. Сосущих мышей инфицировали, как показано на Фигуре 1, и гомогенаты тонкой кишки анализировали через 24 часа на дюйм на предмет указанных уровней цитокинового белка (N = 3 образца на группу, каждый образец объединяли от 3 детенышей и измеряли в двух экземплярах). (B) Схема описанного эндотоксин-опосредованного воспаления, которое стимулируется IFNR и негативно регулируется расщепленной каспазой 8. (C) Влияние гомологичной инфекции RV у мышей-сосунков на эндотоксин-опосредованное повреждение кишечника.Мыши-сосунки были ложно инфицированы или инфицированы EW RV, и через 3 дня им парентерально вводили очищенный эндотоксин (15 мкг на детеныша) в течение 6 часов перед забором тонкого кишечника для гистологического исследования путем окрашивания гематоксилином и эозином. Представленные данные являются репрезентативными для 2 детенышей.

Чтобы подтвердить, подавляет ли гомологичный мышиный RV воспаление, усиленное IFNR, мы использовали модель эндотоксемии на мышах-сосунках, в которой LPS-индуцированное воспаление и тяжелое поражение кишечника, как сообщается, возникают в основном через IFNR-опосредованную экспрессию воспалительных цитокинов (43–1). 45) и некроптотической гибели клеток (17, 27, 46).В предыдущей работе мы обнаружили, что инфицирование RV мышей тонкой кишки защищает сосущих мышей от смертности, вызванной эндотоксинами (8). Однако не оценивалось, оказывает ли репликация EW RV местный защитный эффект в тонкой кишке мышей, зараженных LPS. Здесь мы специально исследовали, предотвращает ли инфекция EW RV воспалительное повреждение тонкого кишечника во время эндотоксемии (рис. 3B). Мышам-сосункам, инфицированным перорально EW RV (или имитатором) в течение 72 часов, систематически вводили эндотоксин, и через 6 часов исследовали возникшее повреждение кишечника.У ложно инфицированных мышей парентеральное введение эндотоксина приводило к тяжелому кишечному некрозу, травмам и разрушению тканей через 6 часов, как и ожидалось (рис. 3C) (47). Напротив, мыши-сосунки, инфицированные мышиным EW RV (для 3d) перед провокацией эндотоксином, демонстрируют минимальное повреждение тонкого кишечника (фиг. 3C). Эти результаты согласуются с выводом о том, что гомологичный RV эффективно предотвращает воспалительное повреждение тонкого кишечника, усиленное рецептором IFN, из-за некроптоза или экспрессии воспалительных генов.Результаты также показывают, несколько неожиданно, что эффективное ингибирование каспазы 8 в тонком кишечнике во время EW RV-инфекции (фиг. 2, C, D) не повышает чувствительность мышей к LPS-индуцированному воспалению.

Различные штаммы RV усиливают резистентность к IFN в неинфицированных HT-29 клетках-свидетелях

Расщепленная каспаза 8 является ключевым негативным регулятором IFN (и LPS) -опосредованного некроптоза и острого воспаления (17), а делеция каспазы 8, специфичная для IEC, приводит к спонтанное воспаление кишечника (48), возможно, вызванное конститутивной тонической передачей сигналов IFN (27, 46).Таким образом, ингибирование расщепления каспазы 8 считается мощным инициирующим событием для острого IFN-направленного некроптотического воспаления в кишечнике (17, 21, 46). Хотя инфекция RV мыши снижает расщепление изоформ каспазы 8 как в инфицированных, так и в сторонних IEC (рис. 2D) и индуцирует различные кишечные IFN in vivo (7, 9) (рис. 1A), эти последствия не приводят к заметным последствиям. Амплификация ISG, воспаление кишечника или повреждение тканей (рис. 1A, 3A-C), гибель клеток (рис. S3) или ограничение роста вируса (рис.1Б) (7, 10, 11). Чтобы лучше понять этот очевидный парадокс, мы исследовали, может ли инфекция правого желудочка блокировать передачу сигналов рецептора IFN (IFNR) как в инфицированных, так и в клетках-свидетелях, чтобы эффективно предотвращать эффекторные функции IFN. Ранее мы сообщали, что в культуре клеток несколько штаммов RV опосредуют эффективную лизосомную деградацию эндогенных субъединиц IFNAR1, IFNGR1 и IFNLR1 в отдельных инфицированных RV + клетках, но не в неинфицированных клетках-свидетелях RV (8).

Мы предположили, что RV может использовать другую стратегию для отключения функций IFNR в незараженных сторонних клетках.В предыдущих исследованиях in vitro мы показали, что штамм свиного RV (SB1-A) (но не несколько других штаммов RV) ингибировал IFNR-опосредованное фосфорилирование STAT1-Y701 в клетках-свидетелях RV (26) после относительно короткого ( т.е. 30-минутная) стимуляция высокими концентрациями очищенного IFNβ (т.е. до 2000 МЕ / мл). Здесь мы более подробно исследовали, могут ли другие штаммы RV также подавлять реактивность IFN в клетках-свидетелях, но с меньшей эффективностью, чем штамм свиней SB1-A.В этом повторном исследовании использовалось увеличенное время введения для стимуляции экзогенного IFN перед анализом STAT1-pY701, таким образом, лучше учитывала возможное снижение эффективности ингибирования IFNR другими штаммами RV (фиг. 4A). Клетки HT-29 человека были инфицированы несколькими штаммами RV (обезьяний RRV и SA11, свиной SB1-A, бычий UK и монореассортант SOF обезьяны SA11, кодирующий свиной NSP1) в течение 12 часов, а затем клетки стимулировали в течение 6 часов очищенным IFN- β (500 МЕ / мл) перед анализом экспрессии STAT1-pY701 в отдельных клетках RV-VP6 ⁺ и VP6 ^— HT-29.Стимуляция ложно инфицированных клеток IFN-β активировала фосфорилирование STAT1-Y701, и эта активация была эффективно ингибирована всеми протестированными штаммами RV в инфицированных RV клетках VP6 ⁺ , как мы сообщали ранее (26). Что еще более важно, активация STAT1-Y701 также значительно ингибировалась в клетках-свидетелях RV-VP6 ^— другими штаммами RV (фиг. 4A). Таким образом, эти результаты показывают, что все испытанные штаммы RV ингибируют передачу сигналов рецептора IFN в популяции сторонних клеток in vitro , хотя их относительная эффективность, по-видимому, варьируется в зависимости от штамма.

(A) Различные штаммы RV вызывают устойчивость к IFN-опосредованному фосфорилированию STAT1-Y701 в клетках-свидетелях. Клетки HT-29 инфицировали указанными штаммами RV и через 12 часов стимулировали 500 МЕ / мл очищенного IFNβ в течение 6 часов перед анализом FACS. Цифры в красном цвете указывают на кратное увеличение STAT1-pY701 после стимуляции IFN в популяциях RV VP6 + (инфицированных) и VP6- (сторонних наблюдателей).Данные представляют два независимых эксперимента. (B-C) Влияние инфекции RV на транскрипционную активность, опосредованную dsRNA- и IFN-рецепторами. На схеме вверху показан использованный экспериментальный подход. Клетки HT-29 были инфицированы RV (штамм RRV, при MOI ~ 0,5) или ложно-инфицированы, и при 6 hpi клетки либо трансфицировали 2 мкг очищенной дцРНК, либо стимулировали 500 МЕ / мл очищенного IFNβ. При 12 hpi клетки анализировали с помощью qRT-PCR на экспрессию транскриптов хозяина (B) и RV (C).Данные представляют собой два независимых эксперимента. (D) Схематическое обобщение дифференциального ингибирования транскрипции, стимулированной дцРНК и рецептором IFN, с помощью RV. Пунктирная красная линия указывает на возможную передачу сигналов отрицательной обратной связи при эктопической стимуляции IFNR во время инфицирования RV, сплошные красные линии указывают на ингибирование IFNR в RV за счет деградации рецептора (в RV-инфицированных клетках (8)) и за счет блокирования IFNR-опосредованной активации и транскрипции STAT1 (в Прохожие на фургоне).

Поскольку разные типы IFNR, обычно экспрессируемые в клетках-свидетелях правого желудочка (8), вероятно, будут функционально нарушены (рис.4A), мы затем исследовали, как RV-ингибирование IFNR-опосредованного фосфорилирования STAT1 влияет на транскрипционные функции последующих антивирусных и воспалительных генов. Некоторые ISG и воспалительные транскрипты, активируемые стимуляцией IFNR-лигандом, также могут быть индуцированы, если клетки стимулируются внутриклеточной дцРНК, в первую очередь через сигнальные пути NF-kB и IRF3 (49). Таким образом, здесь мы сравнили способность RV регулировать клеточный ISG и воспалительную транскрипционную амплификацию после стимуляции либо экзогенным IFN-β, либо внутриклеточной длинной дцРНК (рис.4Б). Контрольные клетки HT-29, стимулированные IFN-β или дцРНК, запускали как перекрывающиеся ( TNF, TNFAIP3, HERC5, IFI6, IFIT3, IFIT1, IFNB1, RSAD2 ), так и уникальные ( TLR2, IL26, IL21, SERPING посредством IFN-β. ; IL29, IFNG только дцРНК) наборов транскрипционных ответов. Независимо от того, как осуществлялась стимуляция транскрипции, инфекция RV эффективно предотвращала дальнейшую активацию транскрипции HERC5, IFNG, IL22, IL21, IFI6, IFIT1, IFIT3 и RSAD2 .Напротив, мы идентифицировали набор провоспалительных транскриптов, которые специфически блокировались RV в ответ на экзогенный IFN-β, но не на внутриклеточную dsRNA ( TLR2, IL26, TNF, IRF8, TNFAIP3, IL29, IL1B) . Среди измеренных транскриптов только SERPING эффективно индуцировался стимуляцией IFNAR1 во время инфицирования RV, хотя и с меньшей эффективностью, чем в неинфицированных клетках HT-29. Стимулирующее ингибирование транскрипции RV не было связано с чувствительностью репликации RV, поскольку оно не изменялось ни в условиях стимуляции IFN-β, ни в условиях стимуляции дцРНК (рис.4С). Кроме того, индукция определенных транскриптов специфически подавлялась эктопической стимуляцией IFNAR1 во время инфекции RV ( HERC5, IFNG, и IL22, статистически значимо, p <0,01 ; IRF8, IL29, и IL1B, не статистически значимо. ). Эти результаты демонстрируют, что RV эффективно ингибирует опосредованную IFN-β-рецептором транскрипцию выбранных ISG и воспалительных генов. Кроме того, они указывают на то, что эктопическая стимуляция IFNAR1 во время инфекции RV может вызывать ингибирование транскрипции по отрицательной обратной связи (рис.4Б, 4Д). Такая регуляция на основе обратной связи (50), вероятно, особенно актуальна для противовирусных и воспалительных функций неинфицированных RV-клеток-свидетелей, которые, в отличие от RV + инфицированных клеток, экспрессируют IFNR (8) (рис. 4D).

Инфекция RV у мышей повторно направлена ​​на IFNR-направленную кишечную противовирусную и воспалительную передачу сигналов

Сообщается, что стимуляция IFNGR1 и IFNAR1 подавляет STAT1 посредством передачи сигналов отрицательной обратной связи при определенных условиях, способствуя устойчивости к IFN в контексте рака и хронической вирусной инфекции (33, 50).Мы исследовали, изменяется ли кишечная IFNR-опосредованная транскрипция гомологичным RV in vivo для подавления противовирусной и воспалительной передачи сигналов IFN (рис. 1A и 3A). После заражения мышей-сосунков мышиным EW RV в течение 12 часов мы парентерально вводили очищенный IFN-γ (или PBS) и собирали тонкий кишечник через дополнительные 12 часов для транскрипционного анализа (фиг. 5A). У ложно инфицированных контрольных детенышей стимуляция IFN- γ активировала несколько кишечных транскриптов ( STAT1, ISG15, IFI204, IL10RA, IL1RN, статистически значимо ; S100A8, BIRC5, REG3G, не значимо; фиг.5Б-5Д). Напротив, транскрипция CCL5 значительно подавлялась эктопической стимуляцией IFNGR1. Подобные транскрипционные ответы также активируются инфекцией EW RV, но с величиной, значительно большей, чем полученная при стимуляции только IFN-γ . Набор противовирусных ( DHX58, DDX58, MX2 ) и воспалительных ( TRAIL, NOS2, CXCL10 ) транскриптов значительно усиливался RV, но не стимуляцией IFN-γ . Примечательно, что эктопическая стимуляция IFNGR1 у мышей, инфицированных EW RV, либо значительно подавлялась ( STAT1, ISG15, TRAIL, и CXCL10 ), либо полностью устранялась ( DHX58, DDX58, MX2, CCL5, и NOS2 ). кишечные противовирусные и воспалительные реакции (рис. 5B-C).Напротив, стимулированные IFN-γ детеныши, инфицированные EW RV, активировали транскрипцию противовоспалительных и пролиферативных генов ( S100A8, BIRC5, ARG2, REG3G, MKI67, и IL1RN ) (фиг. 5D). Эти транскрипты не индуцировались в значительной степени ни стимуляцией IFN-γ , ни одной только инфекцией EW RV, и синергетически увеличивались, когда стимуляция IFNGR1 осуществлялась во время инфицирования EW RV. Чтобы выяснить, можно ли объяснить эффекты стимуляции IFN у крысят, инфицированных EW RV, измененными уровнями репликации RV, мы измерили РНК RV в кишечнике с помощью qRT-PCR.Результаты демонстрируют, что репликация EW RV существенно не изменилась после стимуляции IFN-γ (фиг. 5E). Эти результаты предполагают, что во время гомологичной RV-инфекции функция кишечного IFNR может быть направлена ​​на подавление противовирусных и воспалительных реакций и стимулирование противовоспалительной программы, что позволяет выявить потенциальный механизм, с помощью которого неинфицированные RV-клетки-свидетели противостоят противовирусным и воспалительным эффектам IFN, секретируемого IEC. кишечные кроветворные клетки (7, 51).

(A) Схема использованного экспериментального подхода. (B-E) Транскрипционный анализ различных категорий кишечных транскриптов после эктопической стимуляции рецептора IFN типа II. Мышей инфицировали EW RV (или имитацией) (N = 3-5 детенышей на группу) и через 12 hpi вводили очищенный мышиный IFN γ (1 мкг на детеныша или PBS, внутрибрюшинно). Двенадцать часов спустя мышей умерщвляли и РНК тонкого кишечника анализировали с помощью qRT-PCR на различные транскрипты гена NSP5 хозяина (B-D) или RV NSP5 (E).

Обсуждение

Интерфероны представляют собой плейотропные эффекторы врожденного иммунитета, которые составляют основную линию защиты от вирусных патогенов. Посредством передачи сигналов через свои родственные рецепторы различные типы IFN усиливают экспрессию многочисленных и многофункциональных противовирусных и воспалительных генов (4, 5). Кроме того, стимуляция IFNR может также вызывать апоптотические и некроптотические формы гибели клеток (17–19, 46), возможно, для ограничения репликации и распространения вируса. У гомологичных видов-хозяев репликация RV лишь незначительно ограничивается индукцией различных IFN, а надежная вирусная репликация не связана со значительным воспалением (7, 8, 10, 11, 16).Однако репликация гетерологичного RV сильно ограничена каждым из трех основных типов IFN (10). Как гомологичным RV удается избежать противовирусного и воспалительного действия IFN, до сих пор полностью не изучено.

Мы обнаружили, что у мышей-сосунков врожденный иммунный транскрипционный ответ слизистой оболочки на вирулентный и высокоинфекционный штамм EW RV мышей очень напоминал ответ на ограниченный репликацией гетерологичный штамм обезьян (рис. 1А). Сходство врожденных ответов, включая транскрипцию типа IFN, продукцию IFN-γ и амплификацию ISG или транскриптов воспалительных генов с течением времени (рис.1C) — плохо коррелировали с очень разными уровнями репликации EW и RRV (разница примерно в 10 000 раз, рис. 1B). Транскрипты различных типов IFN оставались значимо повышенными на 72 hpi у детенышей, инфицированных EW RV, что свидетельствует об устойчивом врожденном иммунном ответе на продолжающуюся репликацию RV. Однако мы не наблюдали амплификацию нескольких ISG (т.е. ISG15, ISG20, IFI203, IFIh2, DDX58, IRF9 и MX2 (рис. 1A) на более поздних стадиях заражения EW.Эти результаты показали, что, хотя гомологичная репликация RV и индукция IFN происходят устойчиво во время инфекции, это не приводит эффективно к устойчивой амплификации множества противовирусных и воспалительных генов.

В ответ на длительное воздействие IFN может происходить апоптоз за счет протеолитической активации инициатора каспазы 8 (19, 20). IFN-стимулированный апоптоз — это относительно медленный процесс, вероятно, опосредованный IFN-стимулированной экспрессией промежуточных апоптотических лигандов (например,g., FasL и TRAIL) (18–20) и обычно имеет легкие воспалительные последствия. Помимо запуска апоптоза, протеолитическое расщепление прокаспазы 8 может подавлять некроптоз — более воспалительную форму гибели клеток (17, 52). Некроптоз быстро активируется при дефиците в клетках каспазы 8 или в присутствии ингибиторов каспаз после воздействия воспалительных лигандов, таких как TNF-α или FasL (21). Стимуляция лигандом рецепторов IFN-α / β и —γ также может вызывать быстрый клеточный некроптоз, приводящий к острому воспалению (17, 21).Этот процесс опосредуется неизвестными в настоящее время, но критическими IFNR-зависимыми эффекторами (называемыми постоянно IFN-регулируемыми эффекторами некроптоза, CIREN) (46). Кроме того, IFN могут усиливать экспрессию генов воспалительных цитокинов, кодирующих IFN-чувствительные элементы промотора ответа. И IFN-опосредованный некроптоз, и экспрессия воспалительных генов требуют наличия интактного сигнального пути IFNR и являются критическими медиаторами острого кишечного воспаления в ответ на эндотоксин (17, 21, 43, 46, 53). Следует отметить, что до этой серии экспериментов регулируемая гибель клеток и воспалительные ответвления передачи сигналов рецептора IFN не были хорошо изучены в контексте инфекции RV.

Наши результаты предполагают, что гомологичная инфекция правого желудочка инициирует двойной набор событий, чтобы подорвать и задержать опосредованные IFN функции гибели клеток и потенциально предоставить больше времени для репликации правого желудочка в IEC. По оценкам, 1400 клеток на ворсинки в день обычно выделяются для поддержания гомеостаза кишечника у взрослой мыши (54). Мы обнаружили, что ключевой этап обновления эпителиальных клеток, расщепление каспаз 8 и 3, значительно ингибировался во время гомологичной инфекции RV как в инфицированных вирусом, так и в неинфицированных сторонних зрелых ворсинчатых IEC (рис.2, S3). Это блокирование активации каспаз может служить для предотвращения или уменьшения IFN-ускоренного апоптоза и, таким образом, для усиления вирусной репликации и распространения на неинфицированные IEC. Ингибирование активности каспазы 3 само по себе может быть результатом ингибируемого RV расщепления вышележащей инициаторной каспазы 8 (рис. 2A, 2C-D), которая опосредует активацию каспазы 3 внешним путем гибели и ингибируется как в RV-инфицированных, так и у сторонних наблюдателей. МЭК (рис. 2D). Кроме того, гомологичный мышиный RV также препятствует гомеостатическому расщеплению другой инициаторной каспазы (каспазы 9), которая имеет решающее значение для реализации внутренних путей клеточной смерти.Способность RV регулировать несколько типов каспаз in vivo является новой и, насколько нам известно, представляет собой оригинальную вирусную стратегию для широкой регуляции и задержки нескольких эффекторов гибели кишечных клеток. Ингибирование расщепления каспаз также происходит во время инфицирования RV in vitro и регулируется во времени (фиг. 2F, G).

Механизм, с помощью которого расщепление различных типов каспаз регулируется RV, в настоящее время неизвестен. Тем не менее, анализ ключевого эффектора передачи сигналов, регулируемого каспазой 8, RIP1K (28, 30, 53), в RV-инфицированных клетках HT-29 дает возможное понимание основных механизмов.В частности, мы обнаружили, что in vitro различных штаммов RV способствовали расщеплению полноразмерного p75 RIP1K на более короткие фрагменты (т.е. p51, p37 и p25) (рис. 2H). Расщепление RIP1K на фрагмент p51 опосредуется каспазой 8 и генерирует негативный регулятор, который может предотвращать апоптотическую и некроптотическую гибель клеток в клетках, постоянно подвергающихся действию воспалительных стимулов (31). В отличие от регуляции RIP1K каспазой 8, при определенных условиях (например, стрессе ER) RIP1K необходим для правильного расщепления каспазы 8 и апоптоза (55).Это указывает на существование регуляторной обратной связи RIP1K на активность каспазы 8. Одним из возможных объяснений наших находок может быть то, что один или несколько продуктов расщепления RIP1K, генерируемых на ранних этапах во время инфекции RV (Fig. 2H), регулируют расщепление каспазы 8 и гибель клеток во время стрессовых состояний ER, которые возникают позже при инфекции RV (56-59). Анализ динамики расщепления каспазы 8 и RIP1K во время инфицирования RV (рис. 2G-H) показал, что оба этих процесса нарушены во времени, но не опосредуют заметных уровней гибели клеток или маркеров апоптоза даже на относительно поздних сроках инфицирования (рис.2I). Будет интересно определить, происходят ли эти регуляторные процессы RIP1K в клетках-свидетелях RV, и идентифицировать вовлеченные эффекторы вируса и хозяина.

Независимо от точных лежащих в основе механизмов, нарушение расщепления каспазы 8 как в RV инфицированных, так и в сторонних IECs (Fig. 2D) создает потенциально проблемную ситуацию в кишечном эпителии (21). МЭК-специфической делеции каспазы 8 достаточно, чтобы вызвать спонтанные воспалительные поражения кишечника, приводящие к терминальному илеиту и колиту (48, 60).Как отмечалось выше, ингибирование расщепления каспазы 8 также является ключевым событием прайминга, которое запускает опосредованный рецептором IFN некроптоз, острое воспаление и повреждение тканей, вызванное эндотоксином (17-19, 27, 46, 53, 60). Парадоксально, но мы обнаружили, что инфекция EW RV у мышей значительно защищала грудных мышей от последующей летальной эндотоксемии (выживаемость 100% против 0% через 24 часа после воздействия эндотоксина) (8). Поскольку эндотоксин-опосредованное повреждение усиливается экспрессией воспалительного гена, стимулированной IFN-рецептором (44), и гибелью некроптозных клеток (27), казалось правдоподобным постулировать, что гомологичная RV-инфекция локально подавляет IFN-опосредованные воспалительные функции в тонкой кишке.Наши гистопатологические данные (рис. 3C) подтверждают, что на локальном уровне тонкой кишки мышиные детеныши, инфицированные EW RV, в значительной степени защищены от серьезного воспалительного повреждения из-за воздействия экзогенного эндотоксина. В связи с этими результатами возникает интересный вопрос, который мы в настоящее время изучаем: могут ли подобные защитные эффекты RV на воспаление проявляться вне кишечника. Гомологичная инфекция RV также блокирует программу экспрессии воспалительных генов, стимулированную рецептором IFN, на что указывает обнаружение кишечной секреции нескольких стимулированных IFN воспалительных цитокинов (RANTES (34–36), IP-10 (35, 37), Eotaxin (38) ), GRO-α (39, 40), MIP-1b (36, 41, 42)) были значительно ниже у мышиных RV-инфицированных детенышей по сравнению с ограниченным репликацией гетерологичного обезьяньего RV, несмотря на значительно более высокие уровни репликации штамм мышей (рис.3А).

Ротавирус эффективно разрушает несколько типов IFNR в инфицированных клетках (8), что, по прогнозам, напрямую ограничивает как IFN-опосредованную гибель воспалительных клеток, так и амплификацию гена за счет истощения поверхностной экспрессии IFNR. Белок (белки) RV, который опосредует деградацию IFNR, не был идентифицирован, хотя кодируемый RV неструктурный белок NSP1, по-видимому, является наиболее вероятным кандидатом из-за его способности ингибировать передачу сигналов STAT1 и вызывать деградацию как IRF3, так и bTrCP. (26, 32, 61).В этом исследовании мы исследовали, ингибируется ли функция IFNR в клетках-свидетелях также RV. Ранее мы сообщали, что штамм свиного RV (SB1-A) предотвращает фосфорилирование STAT1-Y701 в неинфицированных RV-свидетелях HT-29 клеток после относительно короткого (т.е. 30 минут) эктопического воздействия IFN (26). Предотвращают ли не свиные RV также передачу сигналов, опосредованную IFN, в клетках-свидетелях, не изучалось дополнительно с использованием измененных условий стимуляции IFN. Здесь, используя более длительную стимуляцию IFN (т.е. 6 h) в сочетании с анализом FACS, мы демонстрируем, что несколько штаммов не свиного RV, которые, как было показано ранее, опосредуют деградацию IFNR в инфицированных клетках, также индуцируют эффективную устойчивость к IFN-направленному STAT1-pY701 в клетках-свидетелях (фиг. 4A).

Способность различных штаммов RV блокировать передачу сигналов IFN в клетках-свидетелях является вторым направлением вирусной стратегии по подавлению противовирусных и воспалительных функций, опосредованных IFNR. Эффекторные функции различных IFN точно титруются чувствительным рецептор-центрированным модулирующим механизмом отрицательной обратной связи (62–64), гарантируя, что чрезмерное воспалительное повреждение хозяина не происходит из-за неконтролируемой передачи сигналов IFNR с прямой связью.Нарушение регуляции этого равновесия может привести либо к устойчивости к IFN, примером которой являются раковые клетки (65), либо к острым воспалительным патологиям (66), таким как сепсис. Ранее мы продемонстрировали, что парентеральное введение IFN γ приводит к эффективной активации STAT1-pY701 в эпителиальных клетках тонкого кишечника, процесс, который значительно подавляется во время гомологичной инфекции EW RV у грудных мышей (8). Аналогичное нарушение IFNR-опосредованной активации STAT1 мышиным EW RV происходило, если очищенный IFN-β или IFN- λ использовался для стимуляции их родственных рецепторов (8).Более ранние исследования также идентифицировали STAT1-независимый путь, который регулирует экспрессию гена, стимулированную IFN γ (67–70). Совсем недавно продукция воспалительных цитокинов в ответ на стимуляцию толл-подобных рецепторов (TLR) была значительно подавлена ​​эктопической стимуляцией IFN γ и IFNβ стимуляцией STAT1-нулевых клеток путем перенаправления передачи сигналов IFNGR1 и IFNAR1 на ингибирование обратной связи (50 ). В этом исследовании мы изучили, может ли такая альтернативная передача сигналов IFNR также узурпироваться RV для широкого подавления врожденных противовирусных и воспалительных реакций.

Несколько транскриптов, активируемых во время фазы прямой амплификации IFNR, также могут быть эффективно индуцированы внутриклеточной дцРНК посредством передачи сигнала от различных рецепторов распознавания образов, включая RIG-I-подобные рецепторы (RLR), толл-подобные рецепторы (TLR). ) и дцРНК-зависимой протеинкиназы (PKR) (3). Поэтому мы сравнили способность стимуляции dsRNA и IFNβ к усилению экспрессии противовирусных и воспалительных генов во время инфицирования RV клеток HT-29 (рис.4Б). Поскольку инфицированные RV ⁺ клетки HT-29 эффективно истощены по различным IFNR, в нашем эксперименте предполагалось, что стимулированная IFNβ транскрипция происходит через IFNR, экспрессируемые на неинфицированных RV-свидетелях, хотя мы не продемонстрировали это напрямую. Результаты ясно указывают на эффективное ингибирование транскрипционных ответов с прямой связью на стимуляцию IFNR RV по сравнению со стимуляцией внутриклеточной дцРНК (фиг. 4B). Интересно, что стимуляция IFNβ во время инфекции RV подавляла транскрипцию HERC5 , IFNG , IL22, IRF8, IL29, и IL1B , что позволяет предположить, что стимуляция IFNAR1 (предположительно неинфицированных клеток-свидетелей RV) также может запускать режим ингибиторной обратной транскрипции (рис.4С).

В последующих экспериментах мы количественно оценили кишечную IFNR-стимулированную транскрипцию во время гомологичной EW RV (или ложной) инфекции путем эктопической стимуляции IFNGR1 у сосущих мышей (фиг. 5A). Эти результаты продемонстрировали, что, в отличие от режима транскрипции с прямой связью «прайминга» в псевдоконтроле, стимуляция IFN γ во время инфицирования EW RV потенцирует снижение ISG и воспалительных транскриптов ( STAT1, ISG15, IFI204, DHX58, DDX58, MX2, CCL5, TRAIL, NOS2, и CXCL10 ) (рис.5Б-С). Кроме того, мы обнаружили, что эктопическая стимуляция IFNGR1 во время инфицирования EW RV (но не стимуляция IFN γ или только EW RV) синергетически увеличивает транскрипцию противовоспалительных транскриптов (фиг. 5D). Интересно, что некоторые из этих генов с повышенной регуляцией (например, S100A8, BIRC5, ARG2, REG3G, и MKI67 ) являются мишенями сигнального пути STAT3, активация которого, как сообщается, подавляет опосредованные STAT1 воспалительные и противовирусные программы из-за стимуляции IFNR ( 33, 68–70).В настоящее время мы изучаем, происходит ли активация STAT3 во время инфекции RV и опосредует ли обратную связь IFNR.

В совокупности наши результаты демонстрируют, что RV эффективно перепрограммирует транскрипцию, передаваемую IFNR, в сторону подавления противовирусной и воспалительной амплификации (рис. 3, 4, 5), процесса, эффективность которого, как ожидается, будет увеличиваться за счет IFN, генерируемых в местной кишечной среде во время кишечной Инфекция правого желудочка (рис. 1). Способность RV-инфекции репрограммировать транскрипционную функцию IFNR определяет лежащий в основе механизм, с помощью которого RV также может контролировать другие функции IFNR, такие как опосредованная расщеплением каспазой гибель клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы и реагенты

Штаммы RV, адаптированные к культуре тканей (обезьяний RRV, SA11-4F, SA11-5S, человеческий WI-61, свинья SB1-A, бычий UK), были размножены на африканских зеленых мартышках. клетки почек (MA104), как описано ранее (71). Титры вирусов определяли с помощью анализа бляшек в клетках MA104. Клетки HT-29 высевали в 6-луночные или 24-луночные кластерные планшеты, и полностью конфлюэнтные монослои инфицировали через 2-3 дня, как описано. Штамм EW RV мышей, не адаптированный к тканевой культуре, получали в виде кишечного гомогената от грудных мышей BALB / C, инфицированных RV.Дозу от диареи (DD ₅₀ ) определяли, как описано ранее (16). Клетки HT29 кишечного эпителия человека и клетки HEK293 эмбриональных почек были приобретены из Американской коллекции типовых культур (ATCC) и сохранены в среде Advanced D-MEM Ham’s F12 (Cellgro) или в среде D-MEM (D-MEM, Cellgro), содержащей 10% фетальной сыворотки теленка. (Invitrogen) с добавлением заменимых аминокислот, глутамина, пенициллина и стрептомицина соответственно. Очищенный человеческий IFN-β (PBL), человеческий IFN-λ (PBL) и человеческий IFN-γ (Millipore) использовали для стимуляции клеток.Использовали очищенный без носителя IFN-β человека (PBL), IFN-γ мыши, TNF-α человека (R&D System, Миннеаполис, Миннесота), LPS (Sigma). Циклогексимид (Sigma) и высокомолекулярный LyoVec poly (I: C) (Invivogen) использовали в концентрации 10 мкг / мл и 2,5 мкг / мл соответственно.

Инфекция мышей и сбор тканей

Всех мышей содержали в отделении ветеринарной медицины VA Palo Alto Health Care System (VAPAHCS), и все эксперименты следовали протоколам, утвержденным Комитетом по уходу и использованию животных VAPAHCS.Детенышей Sv129 в возрасте 3-5 дней инфицировали через желудочный зонд 10 ⁴ DD ₅₀ мышиных EW RV, 10 ⁷ БОЕ обезьяньих RRV или ложно инфицировали 1X средой M199 (Gibco), как описано (16 ). (16). В указанные моменты времени был удален тонкий кишечник. Срезы хранили при -80 ° C или фиксировали в 4% параформальдегиде для обработки и последующих анализов. Протокол изоляции IEC, как описано ранее (72), был немного изменен. Вкратце, кишечник удаляли и продольно открывали в среде RPMI с добавлением пенициллина, стрептомицина и L-глутамина (Gibco).Кишки промывали, разрезали на более мелкие кусочки и помещали в 1X PBS, содержащий 5 мМ EDTA и 5 мМ DTT (Sigma-Aldrich). На этом этапе объединяли ткани от 3-4 детенышей (на каждую инфекционную группу). Затем ткани помещали на шейкер на 10 минут при комнатной температуре. Высвободившиеся клетки затем фильтровали через фильтр с ячейками 100 мкм в свежую среду RPMI FBS (RPMI с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, пенициллина, стрептомицина и L-глутамина) и сразу же помещали на лед. Оставшиеся ткани затем инкубировали со свежей средой RPMI FBS и встряхивали в течение дополнительных 10 минут с последующей последней промывкой в ​​среде RPMI FBS в течение часа.Клетки фильтровали, промывали и ресуспендировали в PBS для дальнейших анализов.

Стимуляция мышей и анализы Luminex

Для эктопической стимуляции IFNGR1 мышей-сосунков, инфицированных 10 ⁴ DD ₅₀ мышиных EW RV (или ложно-инфицированных), внутрибрюшинно вводили очищенный мышиный IFN-γ (1 мкг IFN-γ на pup) или IFN-λ2 через 12 hpi и умерщвляют через 12 часов для анализа транскриптов с помощью qRT-PCR. Для стимуляции эндотоксином мышей 129sv в возрасте 3-5 дней перорально инокулировали через желудочный зонд 10 ⁴ DD ₅₀ мышиных RV-EW.При 3 dpi мышам внутрибрюшинно вводили PBS или очищенный LPS (Sigma, 10 мг / кг массы тела) и умерщвляли через 6 часов для анализа срезов ткани, фиксированных параформальдегидом и залитых парафином, путем окрашивания гематоксилином и эозином. Для измерения кишечных цитокинов собирали кишечник мышей и взвешенные объединенные ткани гомогенизировали в ледяном PBS, содержащем смесь ингибиторов протеазы и фосфатазы (Sigma), с использованием ручного микропеста (Thermo Fisher). Лизаты осветляли двумя последовательными раундами центрифугирования при 10,000X G в течение 10 минут и анализировали на уровни цитокинов в Центре мониторинга иммунитета человека в Стэнфордском университете.Наборы Mouse 38-plex были приобретены у eBiosciences / Affymetrix и использовались в соответствии с рекомендациями производителя. Планшеты считывали с помощью прибора Luminex 200 с нижней границей 50 шариков на образец на цитокин. Во все лунки добавляются специальные шарики для анализа от Radix Biosolutions.

Вестерн-блоттинг

Приготовление клеточных лизатов и иммуноблоттинг in vitro выполняли, как описано. Для образцов мышей IEC, обработанные EDTA / DTT, лизировали в буфере для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA) с добавлением ингибиторов протеаз и фосфатаз (Roche).К каждому образцу добавляли равные объемы 2X буфера Лэммли (Sigma-Aldrich) и анализировали с помощью иммуноблоттинга. Блоты зондировали следующими первичными антителами: анти-каспаза 3, анти-каспаза 8, анти-каспаза 9, анти-расщепленная каспаза 3, анти-расщепленная каспаза 8, анти-расщепленная каспаза 7, анти-PARP, анти-GAPDH, анти-сурвивин, анти-STAT-3, анти-p-STAT-3 (Y705) (все от Cell Signaling Technologies) и капсидное антитело против RV (от Santa Cruz Biotechnologies). Затем блоты инкубировали с вторичными антителами против кролика или мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP), инкубировали с реагентом для обнаружения ECL и экспонировали на пленке (GE Healthcare).Все денситометрические количественные определения белковых блотов анализировали с использованием программного обеспечения ImageJ для анализа и нормализовали по полосам белка GAPDH.

Транскрипционный анализ

Для in vi v o анализ транскриптов мышей умерщвляли и срезы тонкой кишки собирали на льду в Trizol (Life Technologies). Для исследований in vitro клетки сначала промывали PBS, а затем лизировали в Trizol. Тотальную РНК экстрагировали в соответствии с инструкциями производителя и подвергали расщеплению ДНКазой перед использованием в qRT-PCR.Синтез кДНК и последующая микрофлюидная ПЦР на платформе Fluidigm проводили, как описано ранее (73). Серийные 10-кратные разведения эталонной РНК мыши или человека (Agilent) проводили в двух экземплярах для каждого цикла ПЦР.

Анализ проточной цитометрии

Для анализа проточной цитометрии экспрессии каспаз и жизнеспособности клеток in vivo кишечник мыши собирали, как описано выше, и эквивалентное количество IEC, обработанных EDTA / DTT, окрашивали на жизнеспособность клеток с помощью Invitrogen’s LIVE / DEAD Fixable Набор Aqua Dead Cell Stain Kit в соответствии с протоколом производителя.Клетки блокировали очищенным крысиным антимышиным блоком CD16 / CD32 Fc (BD Biosciences) и окрашивали на следующие мышиные поверхностные маркеры: анти-CD45 (клон 30-F11) v450 (BD Biosciences), анти-CD326 (Ep-CAM / ESA, клон G8.8) PE (Biolegend) и анти-CD44 (клон IM7) PerCP / Cy5.5 (Biolegend), как описано ранее (7). Затем клетки фиксировали и повышали проницаемость с помощью буфера BD Cytofix / Cytoperm Fixation / Permeabilization в соответствии с протоколом производителя и впоследствии использовали для окрашивания внутриклеточных белков.Для окрашивания внутриклеточного белка клетки блокировали блоком BD Fc и инкубировали с неконъюгированными антителами к расщепленной каспазе 8 (Cell Signaling Technologies) или расщепленной каспазе 3 (Cell Signaling Technologies) вместе с конъюгированными антителами к VP6 RV (1E11-Texas Red) и Ki67 (Alexa Fluor 647, BD Biosciences). Затем клетки инкубировали с вторичным козьим антителом против кроличьего Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) для обнаружения расщепленных каспаз. Все данные были получены с использованием LSRII (BD Biosciences) и проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo (Treestar Inc).Окрашивание и анализ проточной цитометрии клеток HT-29 выполняли, как описано.

TUNEL и анализы апоптоза

Для TUNEL после окрашивания поверхности эпителиальных клеток кишечника (как описано выше) клетки фиксировали и повышали проницаемость для последующего определения фрагментации ДНК с использованием набора Roche для определения гибели клеток in situ — флуоресцеин (согласно протоколу производителя. ). Вкратце, клетки фиксировали в 2% PFA и пермеабилизировали в 0,1% Triton X-100 в 0,1% натрийцитратном буфере и инкубировали с терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT) вместе с раствором для мечения флуоресцеин-dUTP в течение 1 часа при 37 ° C.В качестве положительного контроля проницаемые IECs обрабатывали ДНКазой I (Ambion) в течение 30 минут при 37 ° C (для индукции фрагментации ДНК) перед реакцией TUNEL. Также был включен дополнительный отрицательный контроль (реакции мечения проводились без фермента TdT). Включение меченого dUTP анализировали на проточном цитометре LSRII. Для анализа экспрессии маркера апоптоза в клетках HT-29 клетки промывали PBS, окрашивали Apopxin Green (разведение 1: 100, Abcam) при комнатной температуре в течение 10 минут и промывали перед исследованием с помощью флуоресцентной микроскопии.

Статистический анализ

Дисперсионный анализ (ANOVA) и двусторонний t-критерий Стьюдента были выполнены с использованием программного обеспечения GraphPad InSTAT. Подписи к рисункам указывают на конкретные использованные тесты, а значения P <0,05 считались значимыми. Все планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего.

Функциональное взаимодействие между интерферонами типа I и II необходимо для ограничения воспаления тканей, вызванного вирусом гриппа A

Abstract

Контроль хозяина вируса гриппа A (IAV) связан с обильным воспалением легких, характеризующимся притоком миелоидных клеток и производством провоспалительных цитокинов, включая интерфероны (IFN).Однако неясно, как иммунная система очищает вирус, не вызывая смертельной иммунопатологии. Здесь мы демонстрируем, что помимо известной противовирусной активности, передача сигналов STAT1 координирует воспаление хозяина во время инфекции IAV у мышей. Этот регуляторный механизм зависит от передачи сигналов рецептора IFN типа I и IFN-γ и, что важно, требует функционального взаимодействия между двумя путями. Защитная функция IFN типа I связана не только с рекрутированием классических воспалительных моноцитов Ly6C ^hi в IAV-инфицированные легкие, но также с предотвращением чрезмерной активации моноцитов IFN-γ.Неожиданно, IFN типа I предпочтительно регулируют передачу сигналов IFN-γ в популяциях мононуклеарных клеток Ly6C ^lo , а не воспалительных Ly6C ^hi . В отсутствие передачи сигналов IFN типа I моноциты / макрофаги Ly6C ^lo становятся фенотипически и функционально более провоспалительными, чем клетки Ly6C ^hi , что свидетельствует о непредвиденной функции субнабора мононуклеарных клеток Ly6C ^lo в тканевом воспалении. Кроме того, мы показываем, что IFN типа I используют разные механизмы для регуляции переноса моноцитов и нейтрофилов.Передача сигналов IFN типа I необходима, но недостаточна для предотвращения рекрутирования нейтрофилов в легкие IAV-инфицированных мышей. Вместо этого требуется взаимодействие IFN типа I и продуцируемого лимфоцитами IFN-γ, чтобы регулировать нейтрофильный ответ ткани на IAV. Наше исследование демонстрирует, что взаимодействие IFN связывает врожденный и адаптивный противовирусный иммунитет с управлением воспалением тканей и выявляет дополнительный уровень сложности для IFN-зависимых регуляторных механизмов, которые действуют для предотвращения чрезмерной иммунопатологии при сохранении антимикробных функций.

Сведения об авторе

Вирус гриппа A (IAV) является основной причиной респираторной инфекции и вызывает сильное острое воспаление, проявляющееся в привлечении моноцитов и нейтрофилов, а также в производстве провоспалительных цитокинов в инфицированных легких. Интерфероны (IFN) сильно индуцируются IAV и, как известно, опосредуют устойчивость хозяина к инфекции. Однако, в отличие от их хорошо изученного ингибирующего действия на репликацию вирусов, влияние IFN на воспалительные реакции хозяина менее изучено.В этой рукописи мы демонстрируем, что антивирусная передача сигналов IFN также необходима для организации тканевого ответа, связанного с защитой от инфекции IAV у мышей. Важно отметить, что мы идентифицируем, что IFN типа I перекрестно регулируют и взаимодействуют с IFN-γ, чтобы ингибировать активацию моноцитов и инфильтрацию нейтрофилов, соответственно. Это исследование также демонстрирует, что моноциты / макрофаги Ly6C ^lo потенциально могут опосредовать вызванное вирусом гриппа воспаление, предполагая, что IFNs диктуют гомеостаз по сравнению с воспалительной функцией мононуклеарных фагоцитов при вирусной инфекции.Наше исследование раскрывает новый IFN-зависимый регуляторный механизм, предназначенный для предотвращения чрезмерной иммунопатологии при сохранении его антимикробных функций. Более того, эти наблюдения имеют особое значение для понимания механизмов, лежащих в основе сильного воспалительного ответа, связанного с летальными штаммами IAV, и имеют значение для разработки новых иммунотерапевтических средств для лечения гриппа.

Образец цитирования: Stifter SA, Bhattacharyya N, Pillay R, Flórido M, Triccas JA, Britton WJ, et al.(2016) Функциональное взаимодействие между интерферонами типа I и II необходимо для ограничения воспаления тканей, вызванного вирусом гриппа А. PLoS Pathog 12 (1): e1005378. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005378

Редактор: Пол Г. Томас, Детская исследовательская больница Св. Джуда, США

Поступила: 28 августа 2015 г .; Дата принятия: 9 декабря 2015 г .; Опубликовано: 5 января 2016 г.

Авторские права: © 2016 Stifter et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах документ и вспомогательные информационные файлы к нему.

Финансирование: Эта работа была поддержана Национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) Австралийского гранта проекта (APP1051742).WJB поддерживается грантом Центра передового опыта исследований в области борьбы с туберкулезом NHMRC (APP1043225). NB поддерживается Австралийской премией для аспирантов. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Вирус гриппа A (IAV) является основной причиной респираторных инфекций и постоянной угрозой для здоровья людей во всем мире.Очистка хозяина от IAV, который инфицирует в первую очередь эпителиальные клетки дыхательных путей, требует развития как врожденных, так и адаптивных иммунных ответов [1,2]. Интересно, что недавние исследования показали, что иммунный ответ хозяина, а не цитопатический эффект вирусной инфекции, играет ключевую роль в развитии тканевой патологии и смертности хозяина [3-5].

IAV вызывает острое воспаление легких, связанное с привлечением воспалительных моноцитов и нейтрофилов в инфицированных легких (см. Обзор [6]).Хотя очевидно, что повышенное накопление нейтрофилов в инфицированных легких связано с повышенной смертностью после инфекции IAV [7,8], рекрутирование моноцитов может быть защитным или пагубным [9,10], предполагая, что моноциты могут играть многофакторную роль в инфекции. . Современное понимание моноцитов предполагает, что существует по крайней мере два основных подмножества: классические моноциты Ly6C ^hi и неклассические моноциты Ly6C ^lo [11]. Известно, что классические моноциты Ly6C ^hi опосредуют различные воспалительные состояния [12] и накапливаются в больших количествах в легких, инфицированных IAV [13].Напротив, неклассические клетки Ly6C ^lo , как было показано, «патрулируют» сосудистую сеть, чтобы очистить поврежденные эндотелиальные клетки и внести вклад в ремоделирование ткани во время фазы разрешения воспаления [14]. Интересно, что патрулирующие моноциты Ly6C ^lo , как было показано, дифференцируются в альтернативно активированные макрофаги во время инфекции Listeria monocytogenes [14]. Однако фенотип и функция моноцитов / макрофагов Ly6C ^lo (Mo / Mϕ) при инфекции IAV в настоящее время неизвестны.

Помимо набора миелоидных клеток, IAV индуцирует продукцию провоспалительных цитокинов, включая интерфероны I и II типа (IFN), у инфицированных животных. Семейство IFN типа I состоит из ~ 20 различных членов, которые считаются важными для противовирусного и противоракового иммунитета [15], тогда как единственный член IFN типа II, IFN-γ, играет важную роль в активации Mo / Mϕ и защите против внутриклеточных бактериальных и паразитарных инфекций (см. обзор [16]). В отличие от его широко изученной функции в инициировании клеточно-автономного антивирусного состояния, механизмы, с помощью которых передача сигналов IFN регулирует ответы тканей хозяина на инфекцию IAV, плохо изучены.Несколько недавних исследований показали, что индуцированные вирусом IFN типа I способствуют накоплению классических моноцитов Ly6C ^hi в дыхательных путях и легких мышей, инфицированных IAV [17,18]. Однако неясно, регулируют ли эти цитокины также функцию легочных моноцитов в отношении устойчивости к инфекции IAV. Более того, вклад IFN-γ в индуцированное IAV воспаление легочной ткани четко не определен.

Мы сообщаем в этом исследовании, что передача сигналов IFN и IFN-γ типа I играет плейотропную роль в воспалительной реакции легких на IAV.Важно отметить, что перекрестная регуляция и взаимодействие IFN важны для подавления воспаления тканей, вызванного моноцитами и нейтрофилами. Противодействуя передаче сигналов IFN-γ для ингибирования активации Mo / Mϕ, IFN типа I действуют синергично с IFN-γ, подавляя инфильтрацию нейтрофилов. Более того, мы демонстрируем, что в отсутствие передачи сигналов IFN типа I Ly6C ^lo Mo / Mϕ становится более провоспалительным, чем их аналоги Ly6C ^hi . Поскольку популяция Ly6C ^lo Mo / Mϕ традиционно связана с ремоделированием ткани, а не с воспалением, наши результаты также показывают нераспознанный провоспалительный потенциал Ly6C ^lo Mo / Mϕ и предполагают, что IFNs диктуют гомеостаз по сравнению с воспалительной функцией мононуклеаров. клетки при вирусной инфекции.

Результаты

Передача сигналов STAT1 контролирует воспалительную реакцию легких на инфекцию IAV

Сублетальная интраназальная (in) инфекция вирусом гриппа A / Puerto Rico / 8 (PR8) у мышей дикого типа (WT) характеризуется прогрессирующей потерей веса, достигающей пика на 10-й день, после чего мыши выздоравливают и очищаются от вируса. инфекции (рис. 1А и [19]). Чтобы исследовать функцию IFNs в формировании ответа хозяина на инфекцию IAV, мы сначала исследовали экспрессию гена IFN и наблюдали, что у мышей WT типа I IFN Ifna и Ifnb быстро повышались на 3-й день после инфицирования. (п.i.), единственный IFN типа II, Ifng , значимо не индуцировался до 7 дня p.i. (Рис. 1B). Экспрессия ИФН типа I и II снижалась до исходного уровня к 10-му дню пи. У мышей WT клеточный иммунный ответ на инфекцию IAV характеризовался сильным притоком моноцитов, который достигал пика на 7-й день и затем снижался к 10-му дню, т.е. В результате Т-клетки стали доминирующей субпопуляцией иммунных клеток в легких (рис. 1С). В отличие от контроля WT, мыши Stat1 с дефицитом , лишенные передачи сигналов как IFN, так и IFN-γ типа I, продемонстрировали клеточный ответ, обогащенный нейтрофилами (рис. 1D), что подчеркивает критическую важность передачи сигналов IFN в организации реакции защитной ткани на Инфекция IAV.Затем мы количественно оценили вирусную нагрузку на 3-й и 7-й дни p.i. с использованием как qRT-PCR, так и анализа классического образования бляшек (PFU). В то время как количество копий мРНК вирусного нуклеопротеина (NP), определенное с помощью qRT-PCR, было сопоставимым у мышей WT и Stat1 ^{— / —} , последние животные показали незначительное увеличение (0,4 log) БОЕ на 7 день (рис. 1E). . Степень дефекта вирусного контроля у мышей Stat1 ^{— / —} согласуется с данными, о которых сообщалось ранее [20,21], предполагая, что нарушение регуляции тканевого ответа у мышей Stat1 ^{— / —} невозможно полностью объяснить. повышением вирусной нагрузки.

Рис. 1. Передача сигналов STAT1 диктует воспалительный ответ клеток хозяина на IAV независимо от регуляции миелопоэза.

(A) Изменение массы тела после инфицирования IAV. Мыши были инфицированы i.n. с IAV PR8 (20 БОЕ) и ежедневным контролем массы тела. Представленные данные представляют собой средний вес ± стандартное отклонение и представляют 2 независимых эксперимента (5 мышей / эксперимент). (B) Экспрессию мРНК Ifna , Ifnb и Ifng в легких инфицированных мышей анализировали с помощью qRT-PCR в указанные моменты времени.Представленные данные представляют собой среднее кратное увеличение по сравнению с неинфицированными контролями. Данные были объединены из 2 независимых экспериментов с аналогичной тенденцией (n = 5–9 мышей на момент времени). Кружки обозначают отдельных мышей, а столбцы — средние по группе. (C) Доля лейкоцитов легких после инфекции IAV. Показанные данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (n = 4) и представляют не менее 3 независимых экспериментов. (D) Вертикальные полосы на срезах показывают относительные пропорции основных субпопуляций лейкоцитов легких, количественно определенные с использованием проточного цитометрического анализа у инфицированных мышей WT и Stat1 ^{— / —} на d7 p.i .. Представленные данные являются средними для трех мышей и представляют 3 независимых эксперимента. (E) Общее количество копий мРНК NP IAV и БОЕ в легких инфицированных мышей при d3 (светлые столбцы) и d7 (темные столбцы) p.i. как определено с помощью qRT-PCR и анализа бляшек MDCK, соответственно. Показанные данные представляют собой среднее число копий ± стандартное отклонение или среднее значение БОЕ ± стандартное отклонение и были объединены из 3 независимых экспериментов (n = 3–11 мышей на группу). (F и G) Репрезентативные графики проточной цитометрии и сводные данные, отображающие пропорции (F) гемопоэтических стволов / предшественников (Lineage ^— CD117 ⁺ ), а также (G) зрелых моноцитов (Mono, CD11b ⁺ Ly6C ⁺ Ly6G ^— ) и нейтрофилы (Neut, CD11b ⁺ Ly6G ⁺ Ly6C ^— ) в BM инфицированных WT и Stat1 ^{— / —} мышей на d7 p .i .. Кружки обозначают отдельных мышей, а столбцы — средние по группе. Данные были объединены из 2 независимых экспериментов (n = 4–6 мышей).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005378.g001

Чтобы определить, является ли измененное воспаление легких у инфицированных мышей Stat1 ^{— / —} результатом нарушения регуляции миелопоэза в костном мозге (BM) или клеточного транспорта на периферии или в обоих, мы проанализировали гемопоэтические клетки в BM инфицированных мышей WT и Stat1 ^{— / —} с помощью проточной цитометрии.Популяции стволовых / предшественников клеток обычно определяют как клетки Sca1 ⁺ cKit ⁺ (CD117 ⁺ ) (LSK), отрицательные по клону [22,23]. Однако, поскольку экспрессия Sca1 регулируется IFN (S1 фиг. И [22]), мы не включили окрашивание Sca1 в анализ. Мы не наблюдали существенной разницы в процентном отношении клон-отрицательных клеток-предшественников CD117 ⁺ (рис. 1F) или зрелых находящихся в BM CD11b ⁺ Ly6G ⁺ Ly6C ^lo нейтрофилов и CD11b ⁺ Ly6G ^— Ly6C ^hi моноцитов (рис. 1G) у инфицированных мышей WT и Stat1 ^{— / —} , что позволяет предположить, что передача сигналов IFN играет минимальную роль в регуляции центрального миелопоэза в костном мозге во время инфекции IAV.

Внутренняя передача сигналов IFN типа I способствует рекрутированию воспалительных моноцитов Ly6C

Чтобы определить относительный вклад IFN типа I и II в рекрутирование моноцитов при IAV-инфекции, мы проанализировали популяции моноцитов в легких инфицированных WT, Ifnar1 ^{— / —} , Ifngr1 ^{— / —} и Stat1 ^{— / —} мышей с использованием проточной цитометрии.По сравнению с мышами WT, мыши Ifnar1 ^{— / —} и Stat1 ^{— / —} показали значительное снижение моноцитов CD11b ⁺ Ly6C ^hi в легких на 7 день p.i. (Рис. 2A, 2B и 2C). Разница маловероятна из-за кинетических вариаций легочного ответа на IAV у мышей с достаточной и недостаточной передачей сигналов IFN, поскольку значительный приток лейкоцитов в инфицированные легкие не наблюдался до 7 дня p.i. во всех группах (рис. 2В и 2С).В отличие от Ifnar1 ^{— / —} животных, рекрутирование моноцитов у мышей Ifngr1 ^{— / —} в значительной степени не затрагивалось, что позволяет предположить, что одной передачи сигналов IFN типа I достаточно для запуска рекрутирования моноцитов в инфицированные легкие. Затем мы определили, действуют ли IFN типа I прямо или косвенно на популяции моноцитов, регулируя их доставку в легкие. Смертельно облученных мышей-реципиентов CD45.1 ⁺ WT восстанавливали равным количеством CD45.1 ⁺ WT и CD45.2 ⁺ Ifnar1 ^{— / —} КМ клетки. После полного восстановления (8–10 недель) мышей-химер инфицировали IAV и анализировали клеточный ответ на 7 день p.i. (Рис 2D). Мы обнаружили, что дефект рекрутирования воспалительных моноцитов Ly6C ^hi , наблюдаемый у мышей Ifnar1 ^{— / —} , не восстанавливался в CD45.2 ⁺ Ifnar1 ^{— / —} клеток в смешанные Ifnar1 ^{— / —} и Ifnar1 ^{+ / +} BM химерные мыши (рис. 2E).Таким образом, соотношение моноцитов Ly6C ^hi / Ly6C ^lo в компартменте CD45.2 ⁺ Ifnar1 ^{— / —} было значительно ниже, чем в компартменте CD45.1 ⁺ Ifnar1. ^{+ / +} отсек, что указывает на то, что прямая передача сигналов IFN типа I в моноцитах Ly6C ^hi необходима для их рекрутирования в инфицированные легкие (рис. 2F).

Рис. 2. IFN типа I передают сигнал непосредственно в моноциты, способствуя их миграции в легкие, инфицированные IAV.

Мышей инфицировали IAV, и анализировали суспензии единичных клеток легких через день 7 p.i. методом проточной цитометрии. Показанные данные проточной цитометрии привязаны к популяциям клеток CD4 ^— CD8 ^— B220 ^— NK1.1 ^— Ly6G ^— SiglecF ^— . (A) Типичные графики проточной цитометрии, отображающие процентное содержание Ly6C ^hi и Ly6C ^lo Mo / Mϕ в легких инфицированных WT, Ifnar1 ^{— / —} , Ifngr1 ^{— / —} или Stat1 ^{— / —} мыши. (B) Сводные данные, показывающие процент моноцитов Ly6C ^hi в инфицированных легких. Данные были объединены по крайней мере из 3 независимых экспериментов (n = 6–10 мышей / группа). (C) Сводные данные, показывающие общее количество популяций клеток Ly6C ^hi и Ly6C ^lo в инфицированных легких на d3 (красные кружки) и d7 (черные кружки) pi. Данные были объединены по крайней мере из 3 независимых экспериментов ( n = 6–10 мышей / группа). (D) Схематическое изображение стратегии, используемой для создания, инфицирования и анализа смешанных химерных мышей BM. (E) Типичные графики проточной цитометрии, демонстрирующие процентное содержание Ly6C ^hi и Ly6C ^lo Mo / Mϕ в легких в CD45.1 ⁺ (WT) и CD45.2 ⁺ ( Ifnar1 ^{— / —} ) компартменты инфицированных смешанных мышей-химер BM. (F) Сводный анализ отношения подмножеств Ly6C ^hi к Ly6C ^lo в компартментах CD45.1 ⁺ (WT) и CD45.2 ⁺ ( Ifnar1 ^{— / —} ).Данные представляют 4 независимых эксперимента (n = 7–9 мышей). В B , C и F кружки обозначают отдельных мышей, а столбцы — средние по группе.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005378.g002

IFN типа I регулируют фенотип и функцию легочных моноцитов при IAV-инфекции

Затем мы исследовали, регулирует ли передача сигналов IFN типа I фенотип и функцию основных популяций моноцитов CD11b ⁺ в IAV-инфицированных легких.В соответствии с современными знаниями о субпопуляциях мононуклеарных фагоцитов [11], мы наблюдали, что моноциты Ly6C ^hi в IAV-инфицированных легких демонстрируют более высокую экспрессию CCR2, чем их аналоги Ly6C ^lo у мышей WT и Ifnar1 ^{— / —} мышей (рис. 3А). Более того, экспрессия интегрина LFA-1 (CD11a), ключевой молекулы, ответственной за функцию моноцитов [24], не изменилась ни на Ly6C ^hi , ни на Ly6C ^lo клетках, независимо от передачи сигналов IFN I типа.Поразительно, однако, что потеря передачи сигналов IFN типа I в популяциях Ly6C ^lo , но не Ly6C ^hi привела к значительному увеличению экспрессии MHC-II (IA), CD11c, CD16 / 32 и CD64, что позволяет предположить, что в Ifnar1 ^{— / —} мыши, Ly6C ^lo Mo / Mϕ проявляют фенотип, характерный для активированных провоспалительных моноцитов. В соответствии с этой гипотезой мы обнаружили, что Nos2 , известная провоспалительная молекула, продуцируемая преимущественно моноцитами, была более высоко экспрессирована в легких Ifnar1 ^{— / —} мышей, чем животных WT (рис. 3B), несмотря на то, что снижение уровня моноцитов Ly6C ^hi у мышей Ifnar1 ^{— / —} (рис. 2В).

Рис. 3. IFN типа I регулируют фенотип и эффекторные функции Mo / Mϕ в легких, инфицированных IAV.

(A) Типичные потоковые диаграммы, демонстрирующие популяции мононуклеарных фагоцитов Ly6C ^hi или Ly6C ^lo , и гистограммы, изображающие экспрессию поверхностных молекул на Ly6C ^hi или Ly6C ^lo клеточных субпопуляциях в легких зараженных d7 WT и Ifnar1 ^{— / —} мышей (n = 7 мышей / генотип). Показанные данные проточной цитометрии привязаны к CD11b ⁺ CD4 ^— CD8 ^— B220 ^— NK1.1 ^— Ly6G ^— SiglecF ^— популяции клеток. (B) Экспрессия Nos2 в легких инфицированных мышей, определенная на d7 p.i. с использованием qRT-PCR. Показанные данные представляют собой средние кратные увеличения (по сравнению с неинфицированными контролями) ± стандартное отклонение. Данные были объединены из 3 независимых экспериментов (n = 6–9 мышей / генотип). (C) Типичные графики потока внутриклеточной экспрессии NOS2 в легких инфицированных мышей WT и Ifnar1 ^{— / —} при d7 p.i .. Показанные данные проточной цитометрии привязаны к живым синглетным клеткам.Графики потока представляют 3 независимых эксперимента с n = 6-9 мышей / генотип. (D) Процент и количество NOS2-положительных мононуклеарных клеток в легких инфицированных мышей WT и Ifnar1 ^{— / —} мышей количественно определено с помощью проточной цитометрии. Данные были объединены из 3 независимых экспериментов с аналогичной тенденцией и представляют собой средние уровни ± стандартное отклонение (n = 6–9 мышей / генотип). (E) Типичные диаграммы потока, изображающие NOS2, присутствующую в клетках Ly6C ^hi и Ly6C ^lo .Показанные данные проточной цитометрии привязаны к клеточным популяциям CD11b ⁺ CD4 ^— CD8 ^— B220 ^— NK1.1 ^— Ly6G ^— SiglecF ^— . (F) Парный анализ процента и средней интенсивности флуоресценции (MFI) NOS2 в популяциях Ly6C ^hi и Ly6C ^lo в WT и Ifnar1 ^{— / —} мышей на d7 пи. Данные были объединены с 3 независимые эксперименты, и каждый набор парных данных представляет отдельную мышь.Статистический анализ проводили с использованием парного теста Стьюдента t .

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005378.g003

В соответствии с анализом гена Nos2 , проточно-цитометрический анализ показал, что в легких инфицированных Ifnar1 наблюдалось значительное увеличение количества клеток, экспрессирующих NOS2. ^{— / —} мышей по сравнению с животными WT (рис. 3C). Дальнейший анализ показал, что множественные мононуклеарные клетки в легких, инфицированных IAV, продуцируют NOS2 (рис. 3D).Однако, в то время как моноциты Ly6C ^hi были основными клетками, продуцирующими NOS2 у животных WT, субпопуляции Ly6C ^hi и Ly6C ^lo вносили вклад в продукцию NOS2 в легких инфицированных Ifnar1 ^{— / —} мышей (Фиг.3D и 3E). Парный анализ двух субпопуляций моноцитов среди отдельных мышей показал, что у животных Ifnar1 ^{— / —} как процент клеток, экспрессирующих NOS2, так и общее количество продуцируемого NOS2 на клетку было выше у Ly6C ^lo . чем моноциты Ly6C ^hi , предполагая, что первая подгруппа более восприимчива к IFN-зависимой супрессии I типа (рис. 3F).Следовательно, IFN типа I способны регулировать не только транспорт, но также фенотип и эффекторную функцию мононуклеарных клеток в легких во время инфекции IAV.

IFN типа I подавляют IFN-γ-зависимую активацию моноцитов путем подавления рецептора IFN-γ

Поскольку исследованные выше поверхностные маркеры и NOS2, как известно, очень чувствительны к индукции IFN-γ [25–27], мы подозревали, что IFN-γ может играть роль в повышении регуляции этих молекул в инфицированных Ifnar1. ^{— / —} мыши.Действительно, на 3 день после рождения, момент времени, когда продуцируются минимальные уровни IFN-γ (рис. 1B), не было различий в экспрессии IA, CD11c или CD64 на клетках Ly6C ^hi и Ly6C ^lo ( S2 Рис). Чтобы напрямую продемонстрировать, что IFN-γ отвечает за активацию молекул, мы сравнили экспрессию IA и NOS2 в Ly6C ^lo Mo / Mϕ WT, Ifnar1 ^{— / —} , Ifngr1 ^{— / —} и Stat1 ^{— / —} мышей на 7 день после инфицирования IAV.Мы обнаружили, что повышенная экспрессия IA и NOS2, наблюдаемая в легких у животных Ifnar1 ^{— / —} , полностью исчезла у мышей Ifngr1 ^{— / —} , а также у мышей Stat 1 ^{— / —} у мышей, у которых отсутствуют сигнальные пути IFN типа I и IFN-γ (рис. 4A и 4B), что позволяет предположить, что повышающая регуляция IA и NOS2 в отсутствие передачи сигналов IFN типа I управляется IFN-γ.

Рис. 4. IFN типа I защищают Ly6C ^lo Mo / Mϕ от IFN-γ-индуцированной активации путем подавления рецептора IFN-γ.

(A) Типичные графики проточной цитометрии и (B) сводная статистика экспрессии I-A и NOS2 в Ly6C ^lo Mo / Mϕ. Показанные данные проточной цитометрии привязаны к клеточным популяциям CD11b ⁺ CD4 ^— CD8 ^— B220 ^— NK1.1 ^— Ly6G ^— SiglecF ^— . Кружки в (B) обозначают отдельных мышей, а столбцы представляют средние значения для группы. Данные были объединены из 3 независимых экспериментов с общим количеством 4–9 мышей в группе. (C) Типичные диаграммы потока, показывающие процентное содержание NOS2 и IA положительных CD45.1 ⁺ (WT) и CD45.2 ⁺ ( Ifnar1 ^{— / —} ) Ly6C ^lo Mo / Mϕ инфицированных смешанных мышей-химер BM в d7 пи.Показанные данные проточной цитометрии привязаны к CD11b ⁺ CD4 ^— CD8 ^— B220 ^— NK1.1 ^— Ly6G ^— SiglecF ^— популяциям клеток. Смешанные химерные мыши BM были созданы, инфицированы и проанализированы, как описано на фиг. 2D.Данные представляют 2 независимых эксперимента (n = 5). (D) Ifng и Ifngr1 экспрессия мРНК в легких инфицированных мышей на d7 p.i. были проанализированы с помощью qRT-PCR. Показанные данные представляют собой средние кратные увеличения (по сравнению с неинфицированными контролями) ± стандартное отклонение. Данные были объединены из 3 независимых экспериментов (n = 6–9 мышей / генотип). (E) Типичная проточная цитометрическая гистограмма экспрессии IFN-γ рецептора 1 (CD119) на Ly6C ^lo Mo / Mϕ и (F) средняя интенсивность флуоресценции экспрессии CD119 (± SD) на Ly6C ^lo Mo / Mϕ инфицированных мышей WT и Ifnar1 ^{— / —} мышей на d7 p.i .. Данные были объединены из 2 независимых экспериментов с участием 5–6 мышей на каждый генотип.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005378.g004

Чтобы определить, действуют ли интерфероны I типа непосредственно на моноциты, оказывая подавляющее действие, мы проанализировали продукцию NOS2 в смешанных, инфицированных IAV Ifnar1 ^{+ / +} и Ifnar1 ^{— / —} Химерные мыши BM и обнаружили, что IFN типа I передают сигнал непосредственно на подавление продукции NOS2 как в Ly6C ^lo (рис. 4C), так и в Ly6C ^hi (рис. S3A). мононуклеарные клетки.Более того, как мы наблюдали ранее у мышей Ifnar1 ^{— / —} (рис. 3F), Ly6C ^lo Mo / Mϕ у химерных мышей BM экспрессировали более высокие уровни NOS2, чем их аналоги Ly6C ^hi (рис. S3B). , подтверждая, что повышенная чувствительность к ингибированию IFN типа I присуща этой подгруппе Mo / Mϕ. Затем мы определили, был ли усиленный IFN-γ-индуцируемый ответ у мышей Ifnar1 ^{— / —} , инфицированных IAV, следствием повышенной продукции или передачи сигналов IFN-γ, путем исследования экспрессии Ifng и Ifngr1 в инфицированных легких.Мы обнаружили, что, хотя экспрессия Ifng была сопоставима в легких инфицированных мышей WT и Ifnar1 ^{— / —} мышей, уровни Ifngr1 были значительно выше у Ifnar1 ^{— / —} животных (рис. 4D). , предполагая, что усиленная передача сигналов IFN-γ, а не продукция IFN-γ, ответственна за усиление IFN-γ-индуцируемого ответа у мышей Ifnar1 ^{— / —} . Чтобы проверить эту гипотезу, мы проанализировали экспрессию на клеточной поверхности рецептора 1 IFN-γ (CD119) с помощью проточной цитометрии и обнаружили, что экспрессия CD119 была значительно увеличена на Ly6C ^lo Mo / Mϕ мышей Ifnar1 ^{— / —} по сравнению с мышами. Мыши WT (рис. 4E и 4F).Следовательно, внутренняя регуляция уровней рецептора IFN-γ с помощью IFN типа I, по-видимому, является механизмом, с помощью которого активация Mo / Mϕ подавляется в присутствии IFN типа I.

Передача сигналов IFN типа I необходима, но недостаточна для ингибирования миграции нейтрофилов в легкие мышей, инфицированных IAV

Наши данные выше предполагают, что передача сигналов IFN типа I доминирует над IFN-γ в рекрутировании моноцитов Ly6C ^hi в легкие IAV-инфицированных мышей (рис. 2).Чтобы исследовать относительный вклад IFN типа I и типа II в STAT1-зависимое подавление миграции нейтрофилов (рис. 1D), WT, Ifnar1 ^{— / —} , Ifngr1 ^{— / —} и Stat1 ^{— / —} мышей инфицировали IAV, и относительное количество нейтрофилов в каждой линии мышей определяли с помощью проточной цитометрии. Интересно, что мы наблюдали, что как процент, так и количество нейтрофилов CD11b ⁺ Ly6G ⁺ были значительно повышены в легких Ifnar1 ^{— / —} , а также Ifngr1 ^{— / —} мышей. по сравнению с животными WT на 7 день, но не на 3 день p.я. (Рис. 5A, 5B и 5C). Важно отметить, что этот дефект был дополнительно преувеличен у мышей Stat1 ^{— / —} , что указывает на синергетическую функцию IFN типа I и II в подавлении рекрутирования нейтрофилов во время инфекции гриппа. Более того, в отличие от внутренней функции клеток IFN типа I в миграции моноцитов, описанной выше (рис. 2D), мы обнаружили, что процент нейтрофилов CD11b ⁺ Ly6C ^lo Ly6G ⁺ среди CD45.1 ^{сопоставим. +} WT и CD45.2 ⁺ Ifnar1 ^{— / —} отсеков до (S4, фиг.) И после (фиг. 5D) инфекции, что позволяет предположить, что IFN типа I регулируют миграцию нейтрофилов внешними клетками. Таким образом, IFN типа I используют различные механизмы для регуляции переноса моноцитов и нейтрофилов при IAV-инфекции и действуют совместно с IFN-γ для предотвращения накопления повреждающих ткань нейтрофилов в месте инфекции. Чтобы исследовать потенциальные внешние клеточные механизмы, ответственные за повышенное накопление нейтрофилов, мы измерили экспрессию генов известного привлекающего нейтрофилы хемокина Cxcl1 и цитокина Il1b у животных с дефицитом сигналов WT и IFN. Stat1 ^{— / —} мыши показали значительно более высокую экспрессию Cxcl1 и Il1b , чем в Ifnar1 ^{— / —} или Ifngr1 ^{54 — / — Fig. 5E), что согласуется с мнением о том, что IFNs синергетически подавляют продукцию хемотаксических хемокинов / цитокинов нейтрофилами при IAV-инфекции.}

Рис. 5. Передача сигналов IFN и IFN-γ типа I действует синергетически, подавляя перенос нейтрофилов в легкие, инфицированные IAV.

(A) Репрезентативные графики потока, изображающие популяции нейтрофилов Ly6G ⁺ легких. Показанные данные проточной цитометрии привязаны к популяциям клеток CD11b ⁺ CD4 ^— CD8 ^— B220 ^— NK1.1 ^— SiglecF ^— . (B) Процент нейтрофилов в мышах WT, Ifnar1 ^{— / —} , Ifngr1 ^{— / —} или Stat1 ^{— / —} , определяемый методом проточной цитометрии на d7 p.i .. (C) Число нейтрофилов в WT, Ifnar1 ^{— / —} , Ifngr1 ^{— / —} или Stat1 ^{— / —} мышей, определенных методом проточной цитометрии в d3 (красный кружки) и d7 (черные кружки) пи. Данные были объединены из 2 независимых экспериментов. (D) Процент нейтрофилов Ly6G ⁺ в крови и легких инфицированных смешанных химерных мышей BM. Смешанные химерные мыши CD45.1 ⁺ (WT) и CD45.2 ⁺ ( Ifnar1 ^{— / —} ) BM были созданы, инфицированы и проанализированы с использованием проточной цитометрии, как описано на фиг. 2D.Данные показывают процент нейтрофилов Ly6G ⁺ среди клеток CD45.1 ⁺ (WT) или CD45.2 ⁺ ( Ifnar1 ^{— / —} ) в крови или легких инфицированных смешанных химерных мышей BM. на d7 пи. Данные представляют 2 независимых эксперимента (n = 10–14 мышей / исследование). (E) Экспрессия мРНК Cxcl1 и Il1b в легких, проанализированная с помощью qRT-PCR при d7 p.i. Показанные данные представляют собой средние кратные увеличения (относительно неинфицированных контролей) ± стандартное отклонение.Данные были объединены из 3 независимых экспериментов с аналогичной тенденцией. В B , C и D кружки обозначают отдельных мышей, а столбцы — средние по группе.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005378.g005

Адаптивный IFN-γ и IFN типа I взаимодействуют для подавления переноса нейтрофилов в легкие мышей, инфицированных IAV

STAT1 является одним из многих факторов транскрипции, которые могут передавать сигналы рецептора IFN и IFN-γ типа I, но он также может опосредовать IFN-независимые функции [28–30].Следовательно, возможно, что повышенный приток нейтрофилов у мышей Stat1 ^{— / —} , инфицированных IAV, по сравнению с мышами Ifnar1 ^{— / —} , не зависит от передачи сигналов IFN-γ. Более того, неясно, требует ли IFN-γ-зависимое подавление нейтрофилов интактной передачи сигналов IFN I типа. IFN типа I, как известно, регулируют рекрутирование нейтрофилов путем передачи сигналов непосредственно в воспалительные моноциты, чтобы подавить их продукцию хемоаттрактивного хемокина нейтрофилов Cxcl2 [31].Чтобы ответить на эти вопросы, мы сгенерировали Ifnar1 ^{— / —} BM реконструированных химерных мышей WT, у которых отсутствует передача сигналов IFN типа I только в гематопоэтических клетках. Подобно мышам Ifnar1 ^{— / —} , эти химерные мыши также демонстрировали дефектное накопление моноцитов Ly6C ^hi в легких после инфекции IAV (S5 фиг.). Ifnar1 ^{— / —} Химерные мыши BM, обработанные антителом против IFN-γ на 2 и 6 день p.я. показали заметное снижение экспрессии I-A на моноцитах при анализе на 7 день (фиг. 6A). Это согласуется с нашим предыдущим наблюдением, что IFN-γ увеличивает экспрессию MHC класса II (фиг. 4), и подтверждает, что введение mAb успешно блокирует активность IFN-γ. Важно отметить, что в соответствии с результатами, представленными на фиг. 5, мы обнаружили, что как пропорция, так и количество нейтрофилов были значительно повышены у мышей, получавших анти-IFN-γ, по сравнению с необработанными животными (фиг. 6B). Мы также подсчитали нейтрофилы в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) и наблюдали аналогичное увеличение количества нейтрофилов в дыхательных путях мышей, получавших анти-IFN-γ, по сравнению с необработанным контролем (рис. 6C), что указывает на то, что IFN-γ регулирует миграцию нейтрофилов в оба. паренхима легких и бронхоавеолярные воздушные пространства не зависят от передачи сигналов IFN типа I в воспалительных моноцитах.Эти результаты предполагают, что IFN-γ, продуцируемый адаптивным иммунным ответом на инфекцию IAV, регулирует воспалительный ответ ткани в дополнение к его противовирусной активности [1]. Чтобы проверить эту гипотезу, мы заразили мышей WT и Rag2 ^{— / —} , у которых отсутствуют В- и Т-клетки, и проанализировали IFN-γ и ответ нейтрофилов на d7 pi. Как и ожидалось, Rag2 ^{— / — Мыши} показали значительно сниженную экспрессию IFN-γ (фиг. 6D) и увеличенное накопление нейтрофилов Ly6G ⁺ в легких по сравнению с животными дикого типа (фиг. 6E).Вместе наши результаты раскрывают механизм, с помощью которого IFNs связывают врожденную и адаптивную иммунные системы, чтобы управлять легочным воспалением для устойчивости к инфекции IAV.

Рис. 6. Передача сигналов IFN-γ ингибирует перенос нейтрофилов в легкие, инфицированные IAV, независимо от IFN типа I и воспалительных моноцитов.

(A – C) Летально облученные мыши CD45.1 ⁺ WT были восстановлены клетками ВМ из мышей CD45.2 ⁺ Ifnar1 ^{— / —} и инфицированы IAV.Мышам вводили внутрибрюшинно. с 500 мкг нейтрализующего mAb против IFN-γ на d2 и d6 инфекции IAV или оставленные без лечения. Ткани легких и суспензии отдельных клеток анализировали при d7 p.i. с помощью проточной цитометрии. (A) Процент IA ⁺ Mo / Mϕ, (B и C) Процент и общее количество нейтрофилов Ly6G ⁺ в (B) легких и (C) BAL необработанных или антибактериальных -IFN-γ mAb, обработанные химерными мышами. Данные представляют 2 независимых эксперимента.Кружки обозначают отдельных мышей, а столбцы — средние по группе. (D – F) WT и Rag2 ^{— / —} мышей инфицировали IAV и проанализировали d7 pi. (D) экспрессию мРНК Ifng в легких анализировали с помощью qRT-PCR на d7 pi. Показанные данные представляют собой средние кратные увеличения (по сравнению с неинфицированными контролями) ± стандартное отклонение. Данные были объединены из 3 независимых экспериментов (n = 6-7 мышей / генотип). (E) Типичные графики проточной цитометрии и сводные данные, изображающие процентное содержание нейтрофилов Ly6G ⁺ в легких IAV-инфицированных WT и Rag2 ^{— / —} мышей d7 p.я. Данные были объединены из 2 независимых экспериментов с участием 5-8 мышей на каждый генотип. Кружки обозначают отдельных мышей, а столбцы — средние по группе. Показанные данные проточной цитометрии привязаны к популяциям клеток CD11b ⁺ CD4 ^— CD8 ^— B220 ^— NK1.1 ^— SiglecF ^— . (F) Схематическая диаграмма, иллюстрирующая функциональные точки пересечения между сигнальными путями IFN типа I и IFN-γ при инфекции IAV. IFN типа I взаимодействуют с IFN-γ, подавляя накопление нейтрофилов в месте инфекции (красные линии).IFN типа I противодействуют передаче сигналов IFN-γ, подавляя активацию Mo / Mϕ (черные линии).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005378.g006

Обсуждение

Хотя установлено, что IFN-опосредованная устойчивость к вирусной инфекции in vitro зависит от ингибирования репликации вируса [32], механизмы, с помощью которых IFNs защищают от инфекции in vivo , менее изучены. Тем не менее, недавние исследования показали, что передача сигналов IFN типа I важна для регуляции миграции миелоидных клеток во время вирусных инфекций [17,31,33], утверждая, что IFNs могут играть более широкую роль в противовирусном иммунитете, помимо их хорошо установленной присущей клетке. противовирусная активность.В этом исследовании мы сообщаем, что передача сигналов IFN типа I необходима, но не достаточна для контроля всей шкалы врожденных реакций легких на IAV. С этой целью функциональное взаимодействие между сигнальными путями IFN и IFN-γ типа I необходимо для регуляции легочного воспаления, управляемого как моноцитами, так и нейтрофилами (рис. 6F). Открытие того, что в отсутствие передачи сигналов IFN типа I IFN-γ способствует воспалительным функциям Ly6C ^lo Mo / Mϕ, предполагает, что взаимодействие между врожденными и адаптивными IFN определяет исход воспаления ткани для устойчивости к инфекции IAV.

Нарушенная миграция моноцитов Ly6C ^hi , наблюдаемая у инфицированных мышей Ifnar1 ^{— / —} , имеет сходство с мышами Ccr2 ^{— / —} [10,18,34,35]. Действительно, все лиганды CCR2 CCL2, CCL7 и CCL12 являются IFN-индуцируемыми I типа и влияют на рекрутирование моноцитов в модели хронического воспаления [36]. Ключевое различие между мышами Ccr2 ^{— / —} и Ifnar1 ^{— / —} состоит в том, что дефицит CCR2 благоприятен для исхода инфекции [10,18], тогда как Ifnar1 ^{— / — Дефицит} приводит к повышенной смертности по сравнению с животными дикого типа [17].Следовательно, IFN типа I должны опосредовать другие защитные механизмы помимо рекрутирования Ly6C ^hi CCR2 ⁺ воспалительных моноцитов при IAV-инфекции.

Неожиданно мы обнаружили, что передача сигналов IFN типа I играет важную роль в подавлении активации мононуклеарных клеток после инфекции IAV. Интересно, что это ингибирование особенно эффективно при подавлении провоспалительного потенциала Ly6C ^lo Mo / Mϕ. Наше наблюдение, что Ifnar1 ^{— / —} Ly6C ^lo Mo / Mϕ экспрессируют более высокие уровни CD11c, MHC класса II и NOS2, чем их аналоги Ly6C ^hi (WT или Ifnar1 ^{— / —} ). неожиданно.Эти клетки Ly6C ^lo напоминают как фенотипически, так и функционально воспалительные моноциты или дендритные клетки, продуцирующие TNF / iNOS (Tip-DC), описанные при других воспалительных состояниях (обзор в [12]). Хотя моноциты Ly6C ^hi и Ly6C ^lo считаются фенотипически разными линиями, и их созревание в процессе развития все еще вызывает споры [37,38], наши данные демонстрируют, что оба подмножества могут быть активированы IFN-γ, чтобы опосредовать пролиферацию. воспалительные действия.Принимая во внимание эти результаты, остается установить, представляют ли CD11b ⁺ Ly6C ^lo Mo / Mϕ в легких IAV-инфицированных мышей отдельную линию или развились из моноцитов Ly6C ^hi в результате подавления регуляции Экспрессия Ly6C при проникновении в воспаленные ткани легких, как описано в других моделях [33,36]. Однако последний сценарий вряд ли будет основным механизмом, объясняющим накопление Ly6C ^lo Mo / Mϕ в отсутствие передачи сигналов IFN типа I в нашем исследовании из-за значительной разницы в количестве общих CD11b ⁺ Mo / Mϕ в легких инфицированных мышей WT и Ifnar1 ^{— / —} .

Наш вывод о том, что IFN типа I по-разному регулирует перенос нейтрофилов и моноцитов при IAV-инфекции, согласуется с предыдущим сообщением [17]. Однако, в то время как в предыдущем исследовании анализировались исключительно клетки ЖБАЛ, в нашем исследовании изучались миелоидные популяции как в ЖБАЛ, так и в тканях легких. Кроме того, в отличие от Seo et al, мы не наблюдали каких-либо серьезных изменений в клетках-предшественниках или зрелых миелоидных клетках в BM и крови инфицированных IAV Ifnar1 ^{— / —} или смешанных химерных мышей BM, что позволяет предположить, что IFN играют играет важную роль в координации регионального иммунитета, а не центрального миелопоэза, как было предложено Seo и коллегами [17].Это несоответствие может быть объяснено тем фактом, что в предыдущем исследовании были проанализированы популяции миелоидных предшественников после инфицирования BM IAV in vitro , события, которое обычно не происходит при естественной инфекции [39].

Важно отметить, что в дополнение к определению функции IFN типа I мы обнаружили две новые функции IFN-γ в легочном ответе на инфекцию IAV; ингибирование миграции нейтрофилов и индукция активации моноцитов. Интересно, что хотя известно, что IFN-γ вызывает прямую противовирусную активность в инфицированных клетках [16] и вырабатывается в больших количествах после инфицирования гриппом, его функция при инфекции IAV остается неуловимой.Многочисленные исследования, изучающие функцию лимфоцитов, вирусный клиренс или выживаемость мышей, дефицитных по IFN-γ или IFN-γR1, сообщают об отсутствии заметных различий по сравнению с животными дикого типа [20,40–42]. Таким образом, настоящее исследование выявляет функциональную роль IFN-γ в инфекции гриппа и предполагает, что некоторые функции IFN-γ маскируются IFN-зависимыми регуляторными механизмами I типа. Роль интерферонов типа III в легочном воспалении не рассматривалась в этом отчете, возможно, что цитокины также играют роль в контроле врожденного переноса клеток и активации во время инфекции IAV.Действительно, недавнее исследование показало, что IFN типа III могут регулировать миграцию и функцию нейтрофилов в экспериментальной модели артрита [43]. Интересно, что хотя показано, что IFN типа III опосредуют иммунитет к вирусным инфекциям, существует большая степень дублирования с IFN типа I [44–46]. Будущие исследования, посвященные вовлечению IFN типа III в этот процесс, могут дать дальнейшее понимание регуляторных функций системы IFN.

Ранее сообщалось, что продукция IFN типа I подавляет иммунные ответы, вызванные IFN-γ, и устойчивость к внутриклеточным бактериям [25,26], но неизвестно, активируется ли аналогичный механизм при вирусной инфекции.В этом исследовании мы демонстрируем, что регуляторная цепь IFN также играет ключевую роль в ответе хозяина на инфекцию IAV, особенно в предотвращении Ly6C ^lo Mo / Mϕ от IFN-γ-индуцированной активации путем регулирования экспрессии IFN-γR1. Жестко контролируемая передача сигналов IFN-γ в Ly6C ^lo Mo / Mϕ может объяснить, почему при некоторых обстоятельствах эта популяция моноцитов дифференцируется в альтернативно активированные макрофаги [24], процесс, который, как известно, чувствителен к супрессии IFN-γ [47].Интересно, что описанный здесь механизм перекрестной регуляции IFN типа I, по-видимому, действует более активно в некоторых компонентах иммунного ответа на инфекцию IAV, чем в других, поскольку ингибирующий эффект IFN-γ на миграцию нейтрофилов не подавляется во время инфекции IAV. Тем не менее, это и предыдущие исследования в совокупности предполагают, что ингибирование функции IFN-γ посредством передачи сигналов IFN типа I является важным регуляторным механизмом, действующим при некоторых инфекционных и воспалительных условиях, когда продуцируются IFN как I, так и II типа [48].Мы предполагаем, что в отличие от внутриклеточной бактериальной инфекции, когда активация инфицированных моноцитов IFN-γ важна для выведения патогенов, ингибирование IFN-γ IFN типа I во время инфекции гриппа выполняет защитную роль для хозяина. Действительно, IFN-γ-индуцируемый оксид азота (NO), как было показано, играет важную роль в опосредовании легочной патологии при инфекции IAV [13,49–51] и, как таковой, должен строго контролироваться, чтобы ограничить иммуноопосредованное повреждение тканей. .

IFNs сильно индуцируются вирусными патогенами и опосредуют иммунитет хозяина к инфекциям.В этом исследовании мы демонстрируем взаимодействие и перекрестную регуляцию между сигнальными путями IFN I и II типов, координирующими многогранный воспалительный ответ легких на инфекцию IAV. Интересно, что известно, что у вирусов появились механизмы противодействия системе IFN хозяина [52]. Таким образом, наши результаты показывают, что в дополнение к нарушению внутренних противовирусных эффекторных функций клетки, как предполагалось ранее [53], блокада продукции IFN типа I или передачи сигналов вирусными продуктами может привести к нарушению регуляции воспаления, тем самым способствуя снижению устойчивости к болезням и, возможно, повышенная передача вируса.Эта гипотеза может объяснить, почему некоторые высоковирулентные штаммы IAV связаны с гипервоспалительными реакциями [54,55], и предполагает, что целенаправленное манипулирование сигнальными путями IFN может открыть новые терапевтические возможности.

Материалы и методы

Мыши

мышей C57Bl / 6 (CD45.2 ⁺ ) и CD45.1 ⁺ (B6.SJL-Ptprca) были получены из Центра ресурсов животных (ARC, Перт). Rag2 ^{— / —} , Ifnar1 ^{— / —} , Ifngr1 ^{— / —} и Stat1 ^{— / —} Bl (все background) были выведены и содержались в лаборатории Bosch Rodent Facility Сиднейского университета.

Заявление об этике

Вся работа с мышами выполнялась в соответствии с этическими принципами, установленными Комитетом по этике животных Сиднейского университета. Все эксперименты в этой рукописи были одобрены под номерами протоколов 2013/5847 и 2013/5848. Руководящие принципы Комитета по этике животных Сиднейского университета соответствуют Австралийскому кодексу ухода за животными и их использования в научных целях (2013 г.), установленного Национальным советом Австралии по здравоохранению и медицинским исследованиям.

Инфекция, вызванная вирусом гриппа A

Мышей анестезировали внутрибрюшинно (т.е.p.) инъекция 2% 2-2-трибромэтанола (авертин) и инокулирование интраназально (в) 20 бляшкообразующими единицами (БОЕ) вируса гриппа A штамма PR8 (A / Puerto Rico / 8/1934 h2N1) в объеме 50 мкл. Вирус PR8 был любезным подарком от профессора Джона Стамбаса (Университет Дикин, Виктория, Австралия).

Анализ бляшек вируса гриппа A

IAV определяли количественно с помощью анализов бляшек с клетками MDCK с использованием стандартных методов. Вкратце, 0,9 × 10 ⁶ клеток MDCK высевали в каждую лунку 6-луночного культурального планшета.Легкие гомогенизировали в RPMI и осветляли центрифугированием в течение 5 минут при 2000 g. Гомогенаты серийно разводили в RPMI и добавляли к монослоям клеток MDCK. После инкубации в течение 45 минут при 37 ° C клетки покрывали 1% мас. / Об. Avicel (FMC Biopolymer) в среде L15 (Sigma Aldrich), содержащей 2 мкг / мл трипсина, обработанного TPCK (Worthington Biochemicals), и инкубировали при 37 ° C. , 5% СО2 в течение 3 дней. Затем клетки промывали, фиксировали метанолом и окрашивали кристаллическим фиолетовым перед подсчетом бляшек.

Изоляция ячеек

Эвтаназии животных перфузировали 10 мл PBS и легкие удаляли в 1 мл холодного 2% FCS / RPMI. Суспензии отдельных клеток получали путем диссоциации легких лезвием скальпеля и затем инкубировали в 2% FCS / RPMI с добавлением 2 мг / мл ДНКазы I (Sigma Aldrich) и коллагеназы IV (Sigma Aldrich) в течение 30 минут при 37 ° C. Затем переваренные легкие диссоциировали через сетчатый фильтр для клеток 70 мкм (Falcon) и эритроциты лизировали буфером для лизиса ACK (Life Technologies).Клетки подсчитывали с использованием исключения трипанового синего.

Что касается клеток костного мозга, бедренные и большеберцовые кости удаляли и очищали от плоти перед вымыванием костного мозга с помощью 2% FCS / RPMI. Клетки осаждали при 300 г в течение 5 минут и ресуспендировали в буфере для лизиса ACK (Life Technologies) в течение 1 минуты для лизиса эритроцитов. Клетки промывали и ресуспендировали в 2% FCS / RPMI перед подсчетом по исключению трипанового синего.

Для сбора БАЛ катетер, прикрепленный к трехходовому запорному крану, и шприц объемом 5 мл вводили в трахею, и легкие промывали 5 x 1 мл холодного PBS с добавлением 2 мМ EDTA.Клетки осаждали при 300 г в течение 5 минут, и клетки ресуспендировали в 250 мкл 2% FCS / RPMI и хранили при 4 ° C до использования для проточного цитометрического анализа.

Генерация химерных мышей костного мозга

BM были получены путем смертельного облучения мышей-реципиентов CD45.1 ⁺ дозой 10 Гр с последующим внутривенным переносом 2 × 10 ⁶ BM клеток от Ifnar1 ^{— / —} мышей в хвостовую часть. Для смешанных химер BM, облученных CD45.1 ⁺ реципиентных мышей WT восстановили с использованием всего 2 x 10 ⁶ ВМ клеток из WT (CD45.1 ⁺ ) и Ifnar1 ^{— / —} (CD45.2 ⁺ ) мышей в соотношении 1: 1. Мыши получали питьевую воду с добавлением антибиотиков (триметоприм сульфата) в течение 3 недель после облучения. Мышей использовали по крайней мере через 8 недель после восстановления костного мозга.

Для нейтрализации in vivo IFN-γ мыши получали 500 мкг моноклонального антитела XMG1 против IFN-γ.2 внутривенно на 2 и 6 дни после инфицирования IAV. Гибридома анти-IFN-γ клона XMG1.2 была размножена в 10% FCS / RPMI с добавлением Pen / Strep (Gibco) и аффинно очищена с использованием гранул протеина G (GE Healthcare). Очищенные антитела диализовали в PBS и стерилизовали фильтрованием перед инъекцией мышам.

Проточная цитометрия

Клетки легких (1 × 10 ⁶ ), крови (200 мкл цельной крови) или BM (4 × 10 ⁶ ) окрашивали в соответствии со стандартными процедурами. Вкратце, клетки инкубировали в течение 30 минут с УФ-красителем Live / Dead в соответствии с инструкциями производителя (Life Technologies).Клетки окрашивали следующими антителами в отмывке FACS (2% FCS / PBS): CD4 (клон GK1.5), CD8 (53–6,7), B220 (RA3-6B2), IA / IE (M5-114.15.2). , Ly6G (1A8), Ly6C (HK1.4), CD11b (M1 / 70), CD45.1 (A20), CD45.2 (104), NK1.1 (PK136), Siglec-F (E50-2440), CCR2 (475301), LFA-1 (M17 / 4), CD119 (2E2), CD11c (N418), CD16 / 32 (93), CD64 (X54-5 / 7.1), CD45 (30-F11), коктейль Lineage, CD117 (2B8), Sca1 (D7), CD48 (HM48-1), CD150 (Q38-480). Стратегия стробирования, используемая для идентификации популяций клеток, показана на S6 Рис.Популяции моноцитов и макрофагов были идентифицированы как CD4 ^— CD8 ^— B220 ^— NK1.1 ^— SiglecF ^— Ly6G ^— CD11b ⁺ и затем классифицированы на Ly6C ^hi и Ly6C ^lo . популяции на основе экспрессии Ly6C. Нейтрофилы были идентифицированы как CD4 ^— CD8 ^— B220 ^— NK1.1 ^— SiglecF ^— CD11b ⁺ Ly6G ⁺ .

Для внутриклеточного окрашивания NOS2 суспензии отдельных клеток инкубировали при 37 ° C в течение 3 часов перед окрашиванием антителами к поверхностным маркерам.Внутриклеточное окрашивание проводили с использованием набора BD Cytofix / Cytoperm в соответствии с инструкциями производителя (BD). Внутриклеточное окрашивание проводили с использованием антитела NOS2 (клон CXNFT). Сбор всех данных проточной цитометрии выполнялся на LSRII с использованием программного обеспечения FACSDiva (BD Biosciences), а весь анализ проводился с использованием FlowJo X v0.7 (TreeStar).

Подготовка мРНК ткани и qRT-PCR

После перфузии ткань легких мыши собирали и погружали в RNAlater (Ambion) на 24 часа перед длительным хранением при -80 ° C.РНК получали из легких мышей с использованием Trisure (Bioline) в соответствии с инструкциями производителя (Bioline). Общую РНК (2 мкг) подвергали обратной транскрипции с использованием набора для синтеза кДНК Tetro со случайными праймерами в соответствии с инструкциями производителя (Bioline). Данные выражены в виде кратного увеличения по сравнению с неинфицированным контролем и рассчитаны методом ΔΔCT с использованием 18S в качестве контрольного гена.

Для абсолютного количественного определения вирусных нуклеопротеинов РНК экстрагировали из 1 x 10 ⁷ PFU PR8 с использованием набора ISOLATEII RNA согласно инструкциям производителя (Bioline) и 100 нг подвергали обратной транскрипции с помощью набора для синтеза кДНК Tetro с использованием нуклеопротеин-специфичных праймеров IAV [ 39].После амплификации продукт кДНК размером 216 п.н. очищали на геле с использованием набора для экстракции геля (Sigma Aldrich) и определяли общее количество копий на основании размера и выхода продукта. Стандартная кривая была построена для определения абсолютного числа копий мРНК вирусного нуклеопротеина среди мРНК образца.

Все количественные ПЦР с обратной транскриптазой (qRT-PCR) выполняли с использованием мастер-микса SYBR NoROX (Bioline) на Roche LightCycler480. Прямые и обратные праймеры для qRT-PCR перечислены в таблице 1.

Статистика

Все статистические анализы были выполнены в Prism 6 (программное обеспечение GraphPad).Достоверность определялась с помощью теста Стьюдента t при сравнении двух экспериментальных групп или однофакторного дисперсионного анализа с последующей поправкой Тьюки для более чем двух групп. Статистически значимыми считались результаты с p <0,05. * <0,05, ** <0,01, *** <0,001, **** <0,0001.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Экспрессия Sca1 регулируется передачей сигналов IFN.

Типичные графики проточной цитометрии, изображающие долю клеток Sca1 ⁺ в BM мышей WT и Stat1 ^{— / —} на d7 p.i .. Данные представляют 2 независимых эксперимента (n = 4–6 мышей).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005378.s001

(TIF)

S2 Рис. WT и

Типичные гистограммы потока, изображающие экспрессию поверхностных молекул на субпопуляциях клеток Ly6C ^hi и Ly6C ^lo в легких инфицированных d3 мышей WT и Ifnar1 ^{— / —} мышей (n = 3 мыши / генотип).Показанные данные проточной цитометрии привязаны к клеточным популяциям CD11b ⁺ CD4 ^— CD8 ^— B220 ^— NK1.1 ^— Ly6G ^— SiglecF ^— .

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005378.s002

(TIF)

S3 Рис.

(A) Типичные графики потока, показывающие процентное содержание NOS2 и I-A CD45.1 ⁺ (WT) и CD45.2 ⁺ ( Ifnar1 ^{— / —} ) Ly6C ^hi моноцитов в легких смешанных химерных мышей BM на d7 пи. Показанные данные проточной цитометрии привязаны к CD11b ⁺ CD4 ^— CD8 ^— B220 ^— NK1.1 ^— Ly6G ^— SiglecF ^— популяции клеток. Смешанные химерные мыши BM были созданы, инфицированы и проанализированы, как описано на фиг. 2D. Данные представляют 2 независимых эксперимента (n = 5). (B) Парный анализ средней интенсивности флуоресценции (MFI) NOS2 в популяциях Ly6C ^hi и Ly6C ^lo инфицированных смешанных мышей-химер BM на d7 p.i .. Данные были объединены из 2 независимых экспериментов. Статистический анализ проводили с использованием парного теста Стьюдента t .

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005378.s003

(TIF)

S4 Рис. Процент нейтрофилов Ly6G

Смешанные CD45.1 ⁺ (WT) и CD45.2 ⁺ ( Ifnar1 ^{— / —} ) BM химерных мышей были созданы, инфицированы и проанализированы с использованием проточной цитометрии, как описано на фиг. 2D.Данные показывают процент нейтрофилов CD45.1 ⁺ (WT) и CD45.2 ⁺ ( Ifnar1 ^{— / —} ) Ly6G ⁺ нейтрофилов в крови наивных смешанных химерных мышей BM. Данные являются репрезентативными для 2 независимых экспериментов (n = 10–14 мышей / исследование).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005378.s004

(TIF)

S5 Рис. Нарушение миграции моноцитов в инфицированных IAV

Сводные данные, отражающие процентное содержание мононуклеарных клеток Ly6C ^hi и Ly6C ^lo в легких IAV-инфицированных WT, Ifnar1 ^{— / —} и CD45.1 ⁺ WT / CD45.2 ⁺ Ifnar1 ^{— / —} химерных мышей d7 pi. Восстановленные химерные мыши Ifnar1 ^{— / —} BM были получены, инфицированы и проанализированы, как описано на рис. Данные представляют 2 независимых эксперимента.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005378.s005

(TIF)

S6 Рис. Стратегия стробирования, используемая для идентификации популяций клеток легких.

Типичные графики проточной цитометрии суспензий единичных клеток легких с указанием стробирования, используемого для идентификации основных популяций лейкоцитов легких.Показанные графики потока были получены с 7-го дня в день. Мышь WT.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005378.s006

(TIF)

Благодарности

Мы благодарим Анхеля Панга за техническую помощь, A / Prof. Джон Стамбас за предоставление IAV и докторов. Эндрю Митчеллу и Фредерику Сьерро за критическое прочтение рукописи.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: SAS CGF. Проведены эксперименты: САС НБ РП МФ.Проанализированы данные: SAS JAT WJB CGF. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: MF JAT WJB CGF. Написал статью: SAS JAT WJB CGF.

Ссылки

1. 1. Braciale TJ, Sun J, Kim TS (2012) Регулирование адаптивного иммунного ответа на респираторную вирусную инфекцию. Нат Рев Иммунол 12: 295–305. pmid: 22402670
2. 2. Ивасаки А., Пиллаи П.С. (2014) Врожденный иммунитет к инфекции вируса гриппа. Nat Rev Immunol 14: 315–328. pmid: 24762827
3. 3.Кобаса Д., Джонс С.М., Шинья К., Каш Дж. К., Коппс Дж. И др. (2007) Аберрантный врожденный иммунный ответ при летальном инфицировании макак вирусом гриппа 1918 г. Природа 445: 319–323. pmid: 17230189
4. 4. Каш Дж. К., Баслер К.Ф., Гарсия-Састре А., Картер В., Биллхарц Р. и др. (2004) Глобальный иммунный ответ хозяина: патогенез и транскрипционное профилирование вирусов гриппа типа А, экспрессирующих гены гемагглютинина и нейраминидазы из пандемического вируса 1918 года. J Virol 78: 9499–9511.pmid: 15308742
5. 5. Kash JC, Tumpey TM, Proll SC, Carter V, Perwitasari O и др. (2006) Геномный анализ повышенной иммунной реакции хозяина и реакции гибели клеток, вызванной вирусом гриппа 1918 года. Природа 443: 578–581. pmid: 17006449
6. 6. La Gruta NL, Kedzierska K, Stambas J, Doherty PC (2007) Вопрос самосохранения: иммунопатология при инфекции вируса гриппа. Immunol Cell Biol 85: 85–92. pmid: 17213831
7. 7. Brandes M, Klauschen F, Kuchen S, Germain RN (2013) Системный анализ выявляет прямую воспалительную цепь, ведущую к летальной инфекции гриппа.Cell 154: 197–212. pmid: 23827683
8. 8. Нарасараджу Т., Ян Э., Сами Р.П., Нг Х.Х., Пох В.П. и др. (2011) Избыточные нейтрофилы и внеклеточные ловушки нейтрофилов способствуют острому повреждению легких при гриппозном пневмоните. Am J Pathol 179: 199–210. pmid: 21703402
9. 9. Narasaraju T, Ng HH, Phoon MC, Chow VT (2010) Лечение антителом MCP-1 усиливает повреждение и препятствует восстановлению альвеолярного эпителия при гриппозном пневмоните. Am J Respir Cell Mol Biol 42: 732–743.pmid: 19617401
10. 10. Lin KL, Suzuki Y, Nakano H, Ramsburg E, Gunn MD (2008) Дендритные клетки, полученные из моноцитов CCR2 +, и макрофаги экссудата вызывают индуцированную гриппом легочную иммунную патологию и смертность. J Immunol 180: 2562–2572. pmid: 18250467
11. 11. Гейссманн Ф., Манц М.Г., Юнг С., Сивеке М.Х., Мерад М. и др. (2010) Развитие моноцитов, макрофагов и дендритных клеток. Наука 327: 656–661. pmid: 20133564
12. 12. Shi C, Pamer EG (2011) Рекрутирование моноцитов во время инфекции и воспаления.Nat Rev Immunol 11: 762–774. pmid: 21984070
13. 13. Олдридж-младший, Мозли К.Э., Больц Д.А., Неговетич Н.Дж., Рейнольдс С. и др. (2009) Дендритные клетки, продуцирующие TNF / iNOS, являются неизбежным злом смертельной инфекции вируса гриппа. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 5306–5311. pmid: 1
09
14. 14. Auffray C, Sieweke MH, Geissmann F (2009) Моноциты крови: развитие, гетерогенность и взаимосвязь с дендритными клетками. Анну Рев Иммунол 27: 669–692. pmid: 1
    17
15. 15.Пестка С. (2007) Интерфероны: через 50 лет после их открытия предстоит еще многое узнать. J Biol Chem 282: 20047–20051. pmid: 17502369
16. 16. Schroder K, Hertzog PJ, Ravasi T, Hume DA (2004) Интерферон-гамма: обзор сигналов, механизмов и функций. Журнал биологии лейкоцитов 75: 163–189. pmid: 14525967
17. 17. Сео СУ, Квон Х.Дж., Ко Х.Дж., Бюн Й.Х., Сеонг Б.Л. и др. (2011) Передача сигналов интерферона типа I регулирует моноциты и нейтрофилы Ly6C (hi) во время острой вирусной пневмонии у мышей.PLoS Pathog 7: e1001304. pmid: 21383977
18. 18. Lin SJ, Lo M, Kuo RL, Shih SR, Ojcius DM, et al. (2014) Патологические эффекты воспалительных моноцитов CCR2 + усиливаются петлей обратной связи хемокинов, запускаемой IFNAR1, при высокопатогенной инфекции гриппа. J Biomed Sci 21: 99. pmid: 25407417
19. 19. Marois I, Cloutier A, Garneau E, Richter MV (2012) Начальная инфекционная доза определяет врожденную, адаптивную реакцию и реакцию памяти на грипп в дыхательных путях.J Leukoc Biol 92: 107–121. pmid: 22504848
20. 20. Гарсия-Састре А., Дурбин Р.К., Чжэн Х., Палезе П., Гертнер Р. и др. (1998) Роль интерферона в тропизме тканей вируса гриппа. J Virol 72: 8550–8558. pmid: 9765393
21. 21. Дурбин Дж. Э., Фернандес-Сесма А., Ли С. К., Рао Т. Д., Фрей А. Б. и др. (2000) IFN типа I модулирует врожденный и специфический противовирусный иммунитет. J Immunol 164: 4220–4228. pmid: 10754318
22. 22. Essers MAG, Offner S, Blanco-Bose WE, Waibler Z, Kalinke U, et al.(2009) IFN-альфа активирует спящие гемопоэтические стволовые клетки in vivo. Nature 458: 904 – U911. pmid: 121
23. 23. Oguro H, Ding L, Morrison SJ (2013) Маркеры семейства SLAM разрешают функционально разные субпопуляции гемопоэтических стволовых клеток и мультипотентных предшественников. Стволовые клетки клетки 13: 102–116. pmid: 23827712
24. 24. Auffray C, Fogg D, Garfa M, Elain G, Join-Lambert O и др. (2007) Мониторинг кровеносных сосудов и тканей популяцией моноцитов с патрулирующим поведением.Наука 317: 666–670. pmid: 17673663
25. 25. Антонелли Л. Р., Джильотти Ротфукс А., Гонсалвес Р., Роффе Е., Чивер А. В. и др. (2010) Интраназальное лечение Poly-IC обостряет туберкулез у мышей из-за рекрутирования в легкие популяции моноцитов / макрофагов, допускающих патогенез. Дж. Клин Инвест 120: 1674–1682. pmid: 20389020
26. 26. Rayamajhi M, Humann J, Penheiter K, Andreasen K, Lenz LL (2010) Индукция IFN-алфавита позволяет Listeria monocytogenes подавлять активацию макрофагов IFN-гамма.J Exp Med 207: 327–337. pmid: 20123961
27. 27. Кирни С.Дж., Дельгадо С., Эшлеман Э.М., Хилл К.К., О’Коннор Б.П. и др. (2013) IFN типа I подавляют рецептор IFN-гамма миелоидных клеток, вызывая рекрутирование комплекса 3 / NGFI-A-связывающий белок 1, который подавляет транскрипцию ifngr1. J Immunol 191: 3384–3392. pmid: 237
28. 28. Silvennoinen O, Schindler C, Schlessinger J, Levy DE (1993) Ras-независимая передача сигналов фактора роста посредством фосфорилирования тирозина транскрипционного фактора.Наука 261: 1736–1739. pmid: 8378775
29. 29. Lee CK, Gimeno R, Levy DE (1999) Дифференциальная регуляция экспрессии конститутивного главного комплекса гистосовместимости класса I в T- и B-лимфоцитах. J Exp Med 190: 1451–1464. pmid: 10562320
30. 30. Heinrich PC, Behrmann I, Muller-Newen G, Schaper F, Graeve L (1998) Передача сигналов цитокина типа интерлейкина-6 через путь gp130 / Jak / STAT. Biochem J 334 (Pt 2): 297–314. pmid: 9716487
31. 31. Stock AT, Smith JM, Carbone FR (2014) IFN типа I подавляет рекрутирование нейтрофилов, вызванное Cxcr2, в сенсорные ганглии во время вирусной инфекции.J Exp Med 211: 751–759. pmid: 24752295
32. 32. Samuel CE (2001) Противовирусное действие интерферонов. Clin Microbiol Rev 14: 778–809, содержание. pmid: 11585785
33. 33. Горицка М., Макрис С., Каусар Ф., Дюрант Л. Р., Перейра С. и др. (2015) Интерфероны I типа, происходящие из альвеолярных макрофагов, организуют врожденный иммунитет к RSV за счет привлечения противовирусных моноцитов. J Exp Med 212: 699–714. pmid: 25897172
34. 34. Wareing MD, Lyon A, Inglis C, Giannoni F, Charo I, et al.(2007) Хемокиновая регуляция воспалительного ответа на низкую дозу инфекции гриппа у мышей CCR2 — / -. J Leukoc Biol 81: 793–801. pmid: 17179466
35. 35. Dawson TC, Beck MA, Kuziel WA, Henderson F, Maeda N (2000) Контрастные эффекты дефицита CCR5 и CCR2 в воспалительной реакции легких на вирус гриппа А. Am J Pathol 156: 1951–1959. pmid: 10854218
36. 36. Ли ПЙ, Ли Й, Кумагаи И, Сюй И, Вайнштейн Дж. С. и др. (2009) Интерферон типа I модулирует рекрутирование и созревание моноцитов при хроническом воспалении.Am J Pathol 175: 2023–2033. pmid: 19808647
37. 37. Ханна Р.Н., Карлин Л.М., Хаббелинг Х.Г., Нацкевич Д., Грин А.М. и др. (2011) Фактор транскрипции NR4A1 (Nur77) контролирует дифференцировку костного мозга и выживание моноцитов Ly6C-. Nat Immunol 12: 778–785. pmid: 21725321
38. 38. Йона С., Ким К.В., Вольф Ю., Милднер А., Варол Д. и др. (2013) Картирование судьбы показывает происхождение и динамику моноцитов и тканевых макрофагов в условиях гомеостаза. Иммунитет 38: 79–91.pmid: 23273845
39. 39. Hermesh T, Moltedo B, Moran TM, Lopez CB (2010) Противовирусная инструкция лейкоцитов костного мозга во время респираторных вирусных инфекций. Клеточный микроб-хозяин 7: 343–353. pmid: 20478536
40. 40. Грэм МБ, Далтон Д.К., Гилтинан Д., Брасиале В.Л., Стюарт Т.А. и др. (1993) Ответ на инфекцию гриппа у мышей с направленным нарушением гена интерферона гамма. J Exp Med 178: 1725–1732. pmid: 8228818
41. 41. Price GE, Gaszewska-Mastarlarz A, Moskophidis D (2000) Роль альфа / бета- и гамма-интерферонов в развитии иммунитета к вирусу гриппа A у мышей.J Virol 74: 3996–4003. pmid: 10756011
42. 42. Нгуен Х.Х., ван Гинкель Ф.В., Ву Х.Л., Новак М.Дж., МакГи Дж.Р. и др. (2000) Гамма-интерферон не требуется для цитотоксических Т-лимфоцитов слизистой оболочки или гетеросубтипического иммунитета к инфекции вируса гриппа А у мышей. J Virol 74: 5495–5501. pmid: 10823854
43. 43. Блазек К., Имс Х.Л., Вайс М., Бирн А.Дж., Перошо Д. и др. (2015) IFN-lambda устраняет воспаление за счет подавления инфильтрации нейтрофилов и выработки IL-1beta.J Exp Med 212: 845–853. pmid: 255
44. 44. Mordstein M, Kochs G, Dumoutier L, Renauld JC, Paludan SR, et al. (2008) Интерферон-лямбда способствует врожденному иммунитету мышей против вируса гриппа A, но не против гепатотропных вирусов. PLoS Pathog 4: e1000151. pmid: 18787692
45. 45. Wack A, Terczynska-Dyla E, Hartmann R (2015) На страже границ: биология интерферонов типа III. Нат Иммунол 16: 802–809. pmid: 261
46. 46. Lazear HM, Nice TJ, Diamond MS (2015) Интерферон-лямбда: иммунные функции на барьерных поверхностях и за их пределами.Иммунитет 43: 15–28. pmid: 26200010
47. 47. Гордон С., Мартинес Ф.О. (2010) Альтернативная активация макрофагов: механизм и функции. Иммунитет 32: 593–604. pmid: 20510870
48. 48. Stifter SA, Feng CG (2015) Вмешательство в иммунитет: пагубная роль IFN типа I во время инфекции. J Immunol 194: 2455–2465. pmid: 25747907
49. 49. Karupiah G, Chen JH, Mahalingam S, Nathan CF, MacMicking JD (1998) Быстрый интерферон-гамма-зависимый клиренс вируса гриппа A и защита от консолидации пневмонита у мышей с дефицитом синтазы оксида азота 2.J Exp Med 188: 1541–1546. pmid: 9782132
50. 50. Акаике Т., Ногучи Ю., Иджири С., Сетогучи К., Суга М. и др. (1996) Патогенез пневмонии, вызванной вирусом гриппа: участие как оксида азота, так и кислородных радикалов. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 2448–2453. pmid: 8637894
51. 51. Perrone LA, Belser JA, Wadford DA, Katz JM, Tumpey TM (2013) Индуцируемый оксид азота способствует вирусному патогенезу после инфицирования мышей высокопатогенным вирусом гриппа.J Infect Dis 207: 1576–1584. pmid: 23420903
52. 52. Гарсия-Састре А., Бирон CA (2006) Интерфероны типа 1 и отношения вирус-хозяин: урок разрядки. Наука 312: 879–882. pmid: 166

53. 53. Kochs G, Garcia-Sastre A, Martinez-Sobrido L (2007) Множественные антиинтерфероновые действия белка NS1 вируса гриппа А. J Virol 81: 7011–7021. pmid: 17442719
54. 54. Perrone LA, Plowden JK, Garcia-Sastre A, Katz JM, Tumpey TM (2008) Инфекция вируса пандемического гриппа H5N1 и 1918 года приводит к ранней и чрезмерной инфильтрации макрофагов и нейтрофилов в легкие мышей.PLoS Pathog 4: e1000115. pmid: 18670648
55. 55. Cilloniz C, Shinya K, Peng X, Korth MJ, Proll SC и др. (2009) Смертельная инфекция вирусом гриппа у макак связана с ранним нарушением регуляции генов, связанных с воспалением. PLoS Pathog 5: e1000604. pmid: 19798428

Противовирусная и иммунорегуляторная активность IFN-γ зависит от конститутивно экспрессируемого IL-1α

Аннотация

IFN-γ индуцирует свою иммунорегуляторную активность, активируя гены, главным образом, через сигнальный путь Jak-STAT.Здесь мы показываем, что то, что считалось внутренней активностью IFN-γ, в значительной степени зависит от базального уровня NF-κB, который поддерживается конститутивно экспрессируемым IL-1α. Антагонист рецептора IL-1 и антитела к IL-1α, но не к IL-1β, ингибировали противовирусную активность IFN-γ на 90%, тогда как ингибирования активности IFN типа I не наблюдалось. Точно так же индукция многих генов IFN-γ, включая HLA-DR , ICAM-1 , IL-18BP и гены, опосредующие его противовирусную активность, в значительной степени зависела от базального IL-1α.Кроме того, IFN-γ индуцировал сывороточный белок, связывающий IL-18, у мышей дикого типа, но не у мышей с двойным дефицитом IL-1α / β. Таким образом, конститутивно экспрессируемый IL-1α имеет решающее значение для многих активностей IFN-γ.

Первоначально идентифицированный по своей противовирусной активности в неиммунных клетках (1), IFN-γ, как было позже обнаружено, регулирует значительный диапазон иммунных ответов и является главным регулятором ответа Th2 (2–4). Большинство типов клеток экспрессируют рецептор IFN-γ (5), и его связывание активирует STAT1, который перемещается в виде димера в ядро, активируя гены, промотор которых содержит γ-активированную последовательность (GAS) (6).Некоторые из этих IFN-γ-индуцированных генов являются регуляторами транскрипции, такими как IFN-регуляторный фактор (IRF) -1, который индуцирует другие гены, в том числе те, которые опосредуют противовирусное действие IFN-γ (7).

TNF и IL-1 усиливают транскрипционную активность IFN-γ. Сообщалось об аддитивной или даже синергической индукции нескольких провоспалительных генов, включая ICAM-1 , iNOS , различные гены хемокинов и фактор роста гепатоцитов (8-15). Аддитивная и синергическая индукция генов IFN-γ и IL-1 / TNF в значительной степени объясняется независимой активацией ответных элементов GAS и κB соответственно.Эти два элемента ответа противопоставлены во многих промоторах вышеупомянутых генов (16).

Роль базального NF-κB в действии IFN-γ изучена в ограниченной степени. Индукция генов хемокинов CXCL9 и CXCL10 с помощью IFN-γ зависит от конститутивной активации NF-κB, однако триггер этой базовой активации не был идентифицирован (17). Поскольку большинство типов клеток экспрессируют конститутивно низкие уровни IL-1α (18), мы изучили здесь его роль в индукции генов IFN-γ.

Результаты