Нк п 6 ст 226: Уплата НДФЛ за счет средств налогового агента

Уплата НДФЛ за счет средств налогового агента

Кроме того, в Письме УФНС по г. Москве от 31.05.2019 №20-15/090309@ специалисты ведомства, учитывая положения п. 1 ст. 210, п. 1 ст. 41, абз. 2 п. 5 ст. 208 НК РФ, пришли к выводу: если НДФЛ уплачен юридическим лицом или индивидуальным предпринимателем, у физического лица возникает налогооблагаемый доход в виде экономической выгоды в денежной форме в размере уплаченных за него юридическим лицом соответствующих сумм налога.

Однако Федеральным законом от 29.09.2019 №325-ФЗ «О внесении изменений в части первую и вторую Налогового кодекса Российской Федерации» (далее — Федеральный закон №325-ФЗ) внесены поправки, в частности, в п. 5 ст. 208 и п. 9 ст. 226 НК РФ. Указанные новшества вступили в силу 1 января 2020 года (п. 3 ст. 3 Федерального закона №325-ФЗ).

Согласно п. 9 ст. 226 НК РФ (в редакции Федерального закона №325-ФЗ) налоговый орган вправе доначислить (взыскать) НДФЛ по итогам налоговой проверки в случае неправомерного неудержания (неполного удержания) налога налоговым агентом за счет собственных средств последнего.

При этом в соответствии с п. 5 ст. 208 НК РФ (в редакции Федерального закона №325-ФЗ) суммы НДФЛ, уплаченные налоговым агентом за налогоплательщика за счет собственных средств, при доначислении (взыскании) налоговым органом таких сумм по итогам налоговой проверки в случае их неправомерного неудержания (неполного удержания) не признаются доходами физического лица.

Исходя из системного толкования положений п. 5 ст. 208 и п. 9 ст. 226 НК РФ (в редакции Федерального закона №325-ФЗ) в случае неправомерного неудержания (неполного удержания) налога налоговым агентом налоговый орган доначисляет (взыскивает) налог по итогам налоговой проверки за счет средств налогового агента и такие суммы не признаются доходами физического лица (Письмо ФНС РФ от 10.01.2020 № БС-4-11/85@).

К сведению

Согласно пп. 9 п. 3 ст. 45 НК РФ (в редакции Федерального закона №325-ФЗ) обязанность по уплате налога считается исполненной налогоплательщиком со дня предъявления налоговым агентом в банк поручения на перечисление в бюджет в счет уплаты налога по результатам налоговой проверки в случае неправомерного неудержания (неполного удержания) соответствующих сумм налога налоговым агентом со счета налогового агента в банке при наличии на нем достаточного денежного остатка на день платежа.

Диспозиция п. 5 ст. 208 НК РФ (в редакции Федерального закона №325-ФЗ) предусматривает исключение из правил, когда в случае доначисления (взыскания) налога налоговым органом по итогам налоговой проверки за счет средств налогового агента такие суммы НДФЛ не признаются доходами физического лица.

Об изменениях в главе 23 НК РФ с 2020 года

Выбрать журналАктуальные вопросы бухгалтерского учета и налогообложенияАктуальные вопросы бухгалтерского учета и налогообложения: учет в сельском хозяйствеБухгалтер Крыма: учет в унитарных предприятияхБухгалтер Крыма: учет в сельском хозяйствеБухгалтер КрымаАптека: бухгалтерский учет и налогообложениеЖилищно-коммунальное хозяйство: бухгалтерский учет и налогообложениеНалог на прибыльНДС: проблемы и решенияОплата труда: бухгалтерский учет и налогообложениеСтроительство: акты и комментарии для бухгалтераСтроительство: бухгалтерский учет и налогообложениеТуристические и гостиничные услуги: бухгалтерский учет и налогообложениеУпрощенная система налогообложения: бухгалтерский учет и налогообложениеУслуги связи: бухгалтерский учет и налогообложениеОплата труда в государственном (муниципальном) учреждении: бухгалтерский учет и налогообложениеАвтономные учреждения: акты и комментарии для бухгалтераАвтономные учреждения: бухгалтерский учет и налогообложениеБюджетные организации: акты и комментарии для бухгалтераБюджетные организации: бухгалтерский учет и налогообложениеКазенные учреждения: акты и комментарии для бухгалтераКазенные учреждения: бухгалтерский учет и налогообложениеОплата труда в государственном (муниципальном) учреждении: акты и комментарии для бухгалтераОтдел кадров государственного (муниципального) учрежденияРазъяснения органов исполнительной власти по ведению финансово-хозяйственной деятельности в бюджетной сфереРевизии и проверки финансово-хозяйственной деятельности государственных (муниципальных) учрежденийРуководитель автономного учрежденияРуководитель бюджетной организацииСиловые министерства и ведомства: бухгалтерский учет и налогообложениеУчреждения здравоохранения: бухгалтерский учет и налогообложениеУчреждения культуры и искусства: бухгалтерский учет и налогообложениеУчреждения образования: бухгалтерский учет и налогообложениеУчреждения физической культуры и спорта: бухгалтерский учет и налогообложение

20192020

НомерЛюбой

Электронная версия

Расчет 6 – НДФЛ

8 Мая 2019

---

Вопрос — ответ

Вопрос: В 2018 год  у в организации был трудоустроен только генеральный директор, зарплата которому не начисляется и не выплачивается. Должна ли организация подавать расчеты 6-НДФЛ и справку 2-НДФЛ за 2018 год?

 Ответ:

Расчеты по форме 6-НДФЛ и справки по форме 2-НДФЛ представляют в налоговые органы организации, признаваемые налоговыми агентами по НДФЛ (п. 2 ст. 230 НК РФ). В свою очередь налоговыми агентами организации признаются, если при выплате дохода у них возникает обязанность удержать и перечислить НДФЛ (п. 1 ст. 226 НК РФ).

 

Поскольку за 2018 год организация зарплату не начисляла и не выплачивала, у нее отсутствует обязанность удерживать НДФЛ, следовательно, налоговым агентом по НДФЛ она не признается. Соответственно, у нее отсутствует обязанность сдавать за 2018 год в налоговый орган расчеты по форме 6-НДФЛ и справку по форме 2-НДФЛ.

Вопрос: Организация выплатила отпускные 13 марта 2019 года. В связи с выплатой годовой премии в апреле выплаченные отпускные были пересчитаны, в результате 12 апреля 2019 года сотруднику произведена доплата отпускных. Как отражать отпускные и доплату в 6-НДФЛ?

 Ответ:

В соответствии с пп. 1 п. 1 ст. 223 НК РФ датой фактического получения дохода в виде суммы среднего заработка, сохраняемого на период отпуска, признается день выплаты или перечисления данной суммы налогоплательщику (третьим лицам по его поручению). Удержать НДФЛ налоговый агент обязан при его фактической выплате (п. 4 ст. 226 НК РФ), а перечислить в бюджет суммы исчисленного и удержанного налога с дохода в виде отпускных налоговый агент обязан не позднее последнего дня месяца, в котором произведена выплата (п. 6 ст. 226 НК РФ).

Таким образом, НДФЛ с отпускных должен быть удержан при фактической выплате 13 марта 2019, а перечислен в бюджет не позднее 1 апреля 2019 года (с учетом переноса по п. 7 ст. 6.1 НК РФ, поскольку 31 марта – воскресенье).

Что касается доплаты отпускных, то эта выплата по своей сути также является отпускными (см. письмо УФНС России по Московской области от 21.02.2018 № 16-12/021202@), поэтому при ее выплате действуют те же правила. Таким образом, при доплате отпускных налог должен быть удержан 12 апреля 2019 года, а перечислен в бюджет не позднее 30 апреля.

Как следует из писем ФНС России от 18.03.2016 № БС-4-11/4538@ и от 16.01.2017 № БС-4-11/499, в разделе 2 расчета 6-НДФЛ (утв. приказом ФНС России от 14.10.2015 № ММВ-7-11/450@) за соответствующий отчетный период отражаются те операции, которые произведены за последние три месяца этого отчетного периода. При этом:  

В разделе 1 суммы доходов отражаются также с учетом положений ст. 223 НК РФ (ответы на вопросы 11 и 12, приведенные в приложении к письму ФНС России от 01.08.2016 № БС-4-11/13984@).

В данном случае выплата отпускных пришлась на два налоговых периода (1-й квартал 2019 года и полугодие 2019 года), поэтому должна отражаться в расчете 6-НДФЛ за 1-й квартал и полугодие 2019 года следующим образом (письмо ФНС России от 14.09.2017 № БС-4-11/18391):

Доплата, выплаченная 12 апреля, отражается в расчете 6-НДФЛ за полугодие 2019 года следующим образом:

Материал подготовлен с использованием сервиса 1С: ИТС.

Возможно, Вас так же заинтересует:

ВНИМАНИЕ! Новые формы отчетности по РСВ и 6-НДФЛ.

Расчет по страховым взносам (форма по КНД 1151111)

Все юридические лица.   ИП, главы КФХ, адвокаты, нотариусы, физические лица, не являющиеся ИП – в случае произведения выплат и иных вознаграждений физическим лицам (пп. 1 п. 1 ст. 419 НК РФ).

Отчетные периоды — первый квартал, полугодие, девять месяцев; расчетный период — год (ст. 423 НК РФ).

Не позднее 30-го числа месяца, следующего за расчетным (отчетным) периодом (п. 7 ст. 431 НК РФ).

Сумма страховых взносов, исчисленная для уплаты за календарный месяц, подлежит уплате в срок не позднее 15-го числа следующего календарного месяца (п. 3 ст. 431 НК РФ).

Расчет сумм налога на доходы физических лиц, исчисленных и удержанных налоговым агентом (форма 6-НДФЛ) (форма по КНД 1151099)

Налоговые агенты — российские организации, индивидуальные предприниматели, нотариусы, занимающиеся частной практикой, адвокаты, учредившие адвокатские кабинеты, а также обособленные подразделения иностранных организаций в Российской Федерации, от которых или в результате отношений с которыми налогоплательщик получил доходы (п. 1 ст. 226 НК РФ, абз. 2 п. 2 ст. 230 НК РФ).

Отчетные периоды — первый квартал, полугодие, девять месяцев; налоговый период — год (абз. 2 п. 2 ст. 230 НК РФ).

За первый квартал, полугодие, девять месяцев — не позднее последнего дня месяца, следующего за соответствующим периодом, за год — не позднее 1 марта года, следующего за истекшим налоговым периодом (абз. 2 п. 2 ст. 430 НК РФ).

НДФЛ с зарплаты, премий, дивидендов и иных доходов, для которых не установлены специальные сроки перечисления, нужно уплатить в бюджет не позднее дня, следующего за днем выплаты этих доходов физлицу (п. 6 ст. 226 НК РФ). НДФЛ с отпускных и больничных (включая пособие по уходу за больным ребенком) нужно перечислить не позднее последнего числа месяца, в котором выплачены отпускные и (или) пособия (п. 6 ст. 226 НК РФ).

Справка о доходах физического лица (форма 2-НДФЛ) (форма по КНД 1151078)

Налоговые агенты — российские организации, индивидуальные предприниматели, нотариусы, занимающиеся частной практикой, адвокаты, учредившие адвокатские кабинеты, а также обособленные подразделения иностранных организаций в Российской Федерации, от которых или в результате отношений с которыми налогоплательщик получил доходы (абз. 3 п. 2 ст. 230 НК РФ).

Календарный год

По общему правилу — ежегодно не позднее 1 марта года, следующего за истекшим налоговым периодом; При невозможности в течение налогового периода удержать у налогоплательщика исчисленную сумму налога — не позднее 1 марта года, следующего за истекшим налоговым периодом. (абз. 3 п. 2 ст. 230 НК РФ).

Удержание НДФЛ с пособий по временной нетрудоспособности (включая пособие по уходу за больным членом семьи) — Государственное учреждение — региональное отделение Фонда социального страхования Российской Федерации по Чувашской Республике

Государственное учреждение – региональное отделение Фонда социального страхования Российской Федерации по Чувашской Республике – Чувашии по вопросу обложения налогом на доходы физических лиц сумм пособий по временной нетрудоспособности и получения справки по форме 2-НДФЛ разъясняет.

В соответствии с п. 1 ст. 217 Налогового кодекса Российской Федерации (далее – Кодекс) пособия по временной нетрудоспособности (включая пособие по уходу за больным ребенком) подлежат обложению налогом на доходы физических лиц.

С 1 января 2019 года на территории Чувашской Республики налоговым агентом в части выплаты пособий по временной нетрудоспособности и удержания налогов с этих сумм является региональное отделение Фонда.

При выплате налогоплательщику доходов, в частности, в виде пособий по временной нетрудоспособности, налоговые агенты обязаны перечислять суммы исчисленного и удержанного налога не позднее последнего числа месяца, в котором производились такие выплаты (п. 6 ст. 226 Кодекса). При этом налоговые агенты обязаны удержать начисленную сумму налога непосредственно из доходов налогоплательщика при их фактической выплате (п. 4 ст. 226 Кодекса).

В соответствии с п. 3 ст. 218 Кодекса стандартные налоговые вычеты по налогу на доходы физических лиц предоставляются налогоплательщику одним из налоговых агентов, являющихся источниками выплаты дохода, по выбору налогоплательщика на основании его письменного заявления и документов, подтверждающих право на такие налоговые вычеты. В связи с тем, что пособия по временной нетрудоспособности не относятся к числу постоянных выплат и доходов, налоговый вычет в календарном году может быть предоставлен работающим гражданам работодателем, предоставление стандартных налоговых вычетов одновременно несколькими налоговыми агентами Кодексом не предусмотрено.

Региональное отделение Фонда производит удержание и перечисление налога на доходы физических лиц с суммы пособия по временной нетрудоспособности, выплаченного за счет средств обязательного социального страхования и выдает получателям пособий справки о доходах по форме 2-НДФЛ.

По итогам календарного года получатель пособия по временной нетрудоспособности за счет средств обязательного социального страхования может обратиться в налоговую инспекцию с налоговой декларацией по форме 3-НДФЛ и заявлением на возврат налога на доходы физических лиц для получения имущественного либо социального налогового вычета.

226 N K St, Lompoc, 93436 — MLS 21000913

Полная информация об объекте 226 N K St

General

• Цена: 499000 долларов США
• Статус: Активный
• Тип: Многосемейный
• MLS ID: 21000913
• Обновлено: Добавлено 24.04.2021 0 9000 3 дн. Назад

Комнаты

Спальни

Другие комнаты

Внешний вид

• Внешний вид: Огороженный двор

Парковка

Расположение

• Район: 60 — Lompoc
• Округ: Санта-Барбара
• Cross Streets: W.Chestnut Ave
• Схема проезда: 101 Север до Вентуры, сверните на съезд California 1 в направлении базы ВВС Ломпок / Ванденберг, налево на CA-1 N, поверните налево на E Ocean Ave, направо на NK Street

Отопление и охлаждение

• Тип охлаждения: Нет
• Тип нагрева: Настенная печь

Коммунальные услуги

• Канализация: Общественная канализация
• Канализация Основной размер: Общественная канализация
• Вода: Общественная
• Отдельные счетчики: Электричество, газ

Структурная информация

• Описание / Дизайн: Нет
• Внешний Конст.: Штукатурка
• Крыша: Плоская, Прочее
• Этажность / Уровни: 1
• Квадратные футы: 2,025
• кв. Ft. Источник: Налоговая отчетность
• Год постройки: 1958

Информация об объекте

• Квартир в здании: 3
• Двухкомнатные квартиры: 3

Квартира 1

• Всего ванных комнат: 1
• Спален: 2
• Парковка: Навес

2

• Всего ванных комнат: 1
• Спален: 2
• Парковка: навес для машины

Единица 3

• Всего ванных комнат: 1
• Спален: 2
• навес для машины

Характеристики лота

• Размер участка (соток): 0.16
• Размер участка (кв. Фут): 6,970
• Размер участка Источник: Налоговая отчетность
• Зонирование: Res Multi-Family

Финансовые соображения

• Цена за кв. Ft .: $ 246
• Расходы: Страхование, техническое обслуживание, управление, водоснабжение / канализация
• Условия: Деньги, новый заем
• Платит арендодатель: Налоги, вода
• Платит арендатора: Кабельное телевидение, Электричество, газ, вывоз мусора

Раскрытие информации и отчеты

• Документы доступны.: Нет
• Отправлено документов: 3
• APN: 091-062-015

Включено в список Village Properties, Aaron Gilles и Village Properties, Thomas Minehan

Экспрессия CD226 связана, но не требуется для образования NK-клеток

Снижение экспрессии DNAM-1 в

B2m ^{— / —} NK-клетках

Поскольку ранее предполагалось, что существует связь между DNAM-1 и Образование NK-клеток ^25,28,30 , мы исследовали экспрессию DNAM-1 на NK-клетках мышей, лишенных бета-2-микроглобулина ( B2m) , которые имеют низкую экспрессию MHC-I и не имеют MHC- Я-образованные NK-клетки. B2m ^{— / —} NK-клетки имели более низкую частоту NK-клеток, экспрессирующих DNAM-1 (40–45%), а NK-клетки DNAM-1 ⁺ имели 50% снижение экспрессии DNAM-1 (рис. 1a – c и дополнительный рис. 1) по сравнению с мышами дикого типа.

Рисунок 1: Экспрессия DNAM-1 зависит от экспрессии MHC-I.

( a — c ) Экспрессия DNAM-1 на B6 дикого типа по сравнению с B2m ^{— / —} мышей. ( a ) Репрезентативные гистограммы экспрессии DNAM-1 на B6 (черная линия), B2m ^{— / —} (пунктирная линия) или контроле FMO (заштриховано серым).( b ) Компиляция частоты DNAM-1 ⁺ NK-клеток и ( c ) компиляция DNAM-1 MFI на NK-клетках, отображаемая как процент экспрессии по сравнению с контролем B6 дикого типа. b , c представляют пять экспериментов, по крайней мере, с 2 мышами на эксперимент и, по крайней мере, с 13 мышами в целом. ( d , e ) Экспрессия DNAM-1 на мышах с разными аллелями MHC-I. ( d ) Компиляция частоты DNAM-1 ⁺ NK-клеток и ( e ) компиляция DNAM-1 MFI на NK-клетках, отображенная как процент экспрессии по сравнению с контролем B6 дикого типа, оба из трех экспериментов с не менее двух мышей на группу и эксперимент.Значимые различия рассчитываются с помощью непарного теста t ( b , c ) или однофакторного дисперсионного анализа ( d , e ) и обозначаются как * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001. Планки погрешностей обозначают s.d.

Экспрессия

DNAM-1 коррелирует с обучающим воздействием MHC-I

Ранее мы продемонстрировали, что каждый отдельный аллель MHC-I оказывает определенное обучающее воздействие на NK-клетки, причем аллель D ^d оказывает сильнейшее влияние, за которым следует K ^b и очень слабый эффект D ^b (ref.31). Здесь экспрессия DNAM-1 оценивалась у мышей без гена MHC-I ( K ^{b — / —} D ^{b — / —} ) гена, единственного аллеля MHC-I ( K ^{b — / —} или D ^{b — / —} ) и B6 дикого типа ( K ^b D ^b ). Мы обнаружили, что около 45% NK-клеток из K ^{b — / —} D ^{b — / −− / —} мышей были DNAM-1 ⁺ .У мышей, экспрессирующих только слабую обучающуюся молекулу MHC-I D ^b , не было увеличенной популяции DNAM-1 ⁺ . Однако, если экспрессировалась одна из сильных образовывающих молекул MHC-I K ^b или D ^d , NK-клетки имели более высокую частоту клеток DNAM-1 ⁺ (рис. 1d). Таким образом, увеличение количества клеток DNAM-1 ⁺ следует иерархии образования аллелей MHC-I. При оценке средней интенсивности флуоресценции (MFI) DNAM-1 на NK-клетках, экспрессия только K ^b или D ^d увеличивала средние уровни DNAM-1 в пуле NK-клеток (рис.1д). В заключение мы обнаружили, что уровни экспрессии DNAM-1 и частота NK-клеток DNAM-1 ⁺ коррелировали с обучающим действием аллеля MHC-I.

Экспрессия DNAM-1 на образованных и необразованных NK-клетках

Далее мы предположили, что подмножества NK-клеток с MHC-I и без MHC-I в пределах одной линии мышей также будут иметь дифференциальную экспрессию DNAM-1. Мы исследовали экспрессию DNAM-1 на подмножествах NK-клеток, как определено их паттерном экспрессии собственного ингибитора рецептора MHC-I: Ly49A, Ly49C, Ly49G2, Ly49I и NKG2A (дополнительный рис.2а). Это позволило нам сконцентрироваться на одиночных положительных (SP) клетках и оценить влияние одного конкретного Ly49r на экспрессию DNAM-1 в отсутствие по сравнению с присутствием NKG2A (рис. 2a). Мы обнаружили, что среди NK-клеток, экспрессирующих только один ингибирующий Ly49r, Ly49C-SP и Ly49I-SP имели более высокую долю клеток DNAM-1 ⁺ , чем Ly49A-SP или Ly49G2-SP. Наблюдаемый эффект экспрессии Ly49r на DNAM-1, по-видимому, был аддитивным, поскольку двойная положительная подгруппа Ly49CI имела более высокую частоту клеток DNAM-1 ⁺ , чем Ly49C-SP или Ly49I-SP.Это также можно было увидеть среди соответствующих подмножеств, коэкспрессирующих NKG2A. Интересно, что все подмножества NKG2A ⁺ имели более высокую частоту клеток DNAM-1 ⁺ , чем подмножества NKG2A ^— , причем клетки NKG2A-SP составляли 90% DNAM-1 ⁺ . Однако при добавлении Ly49r наблюдалось небольшое, но стойкое снижение экспрессии DNAM-1 на подмножествах NK-клеток. Таким образом, чем больше ингибирующий Ly49r экспрессируется NK-клеткой в ​​дополнение к NKG2A, доля клеток DNAM-1 ⁺ была ниже по сравнению с NKG2A-SP NK-клетками.Это было более заметно, если ингибирующий Ly49r, который не связывается прочно с собственным MHC-I, был коэкспрессирован с NKG2A (Ly49A и / или Ly49G2), и менее выражен, когда самоспецифичный к MHC-I Ly49r (Ly49C и / или Ly49I) были коэкспрессированы (рис. 2а).

Рисунок 2: Экспрессия DNAM-1 коррелирует с рецепторами ингибирования собственного MHC-I.

( a , b ) Частота DNAM-1 ⁺ NK-клеток у мышей B6 ( a ) на подмножествах NK-клеток, которые экспрессируют определенную комбинацию ингибирующего Ly49r в присутствии (белые точки) или отсутствие (черные точки) NKG2A.Объединены результаты 26 мышей, взятых из семи экспериментов. ( b ) DNAM-1 MFI на одиночных Ly49r ⁺ NK-элементах в D ^{b — / —} , D ^d -трансгенный, K b / — , B6 ( K ^b D ^b ), D ^d -трансгенный ( K ^{b 9025} D ^d ) и B2m ^{— / —} мышей.Результаты представлены как процент экспрессии по сравнению с той же подгруппой NK-клеток у K ^{b — / —} D ^{b — / —} мышей, что представлено линией на 100%. относительное выражение DNAM-1. Данные взяты из трех экспериментов, по крайней мере, с шестью мышами. Значимые различия рассчитываются по отношению к соответствующему подмножеству NK-клеток в K ^{b — / —} D ^{b — / —} мышей по тесту Манна – Уитни U и обозначены как * Р <0.05, ** P <0,01, *** P <0,001. Планки погрешностей обозначают s.d.

Интересно, что когда мы исследовали TIGIT, рецептор, ингибирующий DNAM-1-лиганд CD155, мы обнаружили, что он преимущественно экспрессируется на NKG2A ^— NK-клетках (дополнительный рис. 3a), K ^{b — / —} D ^{b — / —} NK-клетки имели более высокие уровни TIGIT (дополнительный рис. 3b), а паттерн экспрессии на подмножествах NK-клеток был противоположен таковому для DNAM-1 (дополнительный рис.3c), указывая на то, что DNAM-1 и TIGIT могут регулироваться сбалансированным образом.

Более высокая экспрессия DNAM-1 на NK-клетках, экспрессирующих собственные рецепторы-ингибиторы связывания MHC-I, также может быть замечена среди других комбинаций аллелей Ly49r-MHC-I (рис. 2b). Частота и MFI клеток DNAM-1 ⁺ среди Ly49C-SP или Ly49I-SP были выше по сравнению с подмножествами NK-клеток Ly49A-SP или Ly49G2-SP у мышей D ^{b — / —} (рис. 2, дополнительный рис. 2b). У одиночных мышей D ^d также наблюдалось значительное увеличение экспрессии DNAM-1, но по другому паттерну, основанному на самообразовывающихся субпопуляциях NK-клеток у этого хозяина (рис.2б). Кроме того, подмножества NK-клеток, экспрессирующие Ly49A-SP или Ly49G-SP, имели самую высокую частоту NK-клеток DNAM-1 ⁺ среди NKG2A-отрицательных подмножеств (дополнительный рис. 2b). У мышей K ^{b — / —} ни одна из подмножеств SP не показала значительного увеличения DNAM-1 (рис. 2b), хотя в NK-клетках Ly49A-SP наблюдалась тенденция, которая могла указывать на слабое влияние образования молекулы D ^b на эту подгруппу из-за слабого связывания с MHC-I (ref.32). У трансгенных мышей D ^d ( K ^b D ^b D ^d ), как и ожидалось, подгруппы Ly49A, Ly49C и Ly49G2-более высокие экспрессия DNAM-1.

Дополнительный эффект множественного self-Ly49r на экспрессию DNAM-1

Затем мы спросили, экспрессируют ли NK-клетки с большим количеством ингибирующих рецепторов больше DNAM-1, и будет ли какой-либо паттерн зависеть от экспрессии MHC-I.Мы разделили подмножества NK-клеток B6 и B2m ^{— / —} мышей на основе количества ингибирующего Ly49r и экспрессии NKG2A, что позволило нам идентифицировать и анализировать два различных паттерна. DNAM-1 был связан с количеством Ly49r (независимо от специфичности) как в подмножествах NKG2A ⁺ , так и в NKG2A ^–, хотя и с разным влиянием. Один из компонентов этой ассоциации зависит от образования (видно в подмножествах NKG2A ^— в B6), что можно описать как «чем больше Ly49r, тем больше DNAM-1» (рис.3a), независимо от того, какие Ly49r экспрессируются, пока существует экспрессия MHC-I. Чем больше Ly49r экспрессируется, тем более вероятно, что эта конкретная клетка принадлежит к образованному пулу NK-клеток, что подтверждает наше наблюдение о том, что экспрессия DNAM-1 связана с образованием.

Фиг. 3. Корреляция экспрессии DNAM-1 с количеством ингибирующего Ly49r.

Количество ингибирующих Ly49r на подмножествах NK-клеток влияет на долю DNAM-1 ⁺ клеток в этом подмножестве.B6 или B2m ^{— / —} NK-клетки, окрашенные на ингибирующие рецепторы, как на фиг. 2a, были сгруппированы на основе количества ингибирующего Ly49r, который они экспрессируют (независимо от того, какую комбинацию ингибирующих рецепторов). Частота NK-клеток DNAM-1 ⁺ в каждой группе показана для ячеек NKG2A ^— в a и для клеток NKG2A ⁺ в b . Значимые различия рассчитываются путем сравнения соответствующей подгруппы NK-клеток мышей B6 и B2m ^{— / —} с помощью непарного t -теста и обозначаются как ** P <0.01, *** P <0,001. Планки погрешностей обозначают s.d.

Второй компонент ассоциации между количеством Ly49r и экспрессией DNAM-1 был независимым от образования (замечен в B2m ^{— / —} ), что можно описать как «чем больше Ly49r, тем меньше DNAM-1». ‘(Рис. 3б). Это было наиболее ярко выражено в подмножестве NKG2A ⁺ . Мы предполагаем, что это независимое от образования подавление DNAM-1 связано с более высокой вероятностью того, что клетки будут более зрелыми, потому что NK-клетки приобретают больше Ly49r последовательно и кумулятивно по мере созревания ^33,34,35 .Это наблюдается только в присутствии сильного обучающего аллеля MHC-I (Supplementary Fig. 4a-c) и согласуется с недавними открытиями, что DNAM-1 подавляется при созревании ²⁹ .

Недавние модели образования NK-клеток основаны на сдвигах порога активации, определяемом комбинированным входом тормозных и активирующих рецепторов ^4,36,37 , где ингибирующие рецепторы снижают порог активации, тем самым увеличивая реактивность, в то время как активирующие рецепторы влияют на образование в в противоположном направлении, то есть они снижают чувствительность отдельной NK-клетки в постоянном присутствии лиганда активирующего рецептора ^37,38,39 .Поэтому мы оценили влияние активирующего рецептора (Ly49D) в присутствии или в отсутствие родственного аллеля MHC-I (D ^d ) на экспрессию DNAM-1. Мы проанализировали NK-клетки, которые экспрессируют либо ингибирующий Ly49A, либо активирующий Ly49D, либо оба, и обнаружили, что доля клеток DNAM-1 ⁺ была выше в подмножестве Ly49A-SP у одиночных мышей D ^d по сравнению с K . ^{b — / —} D ^{b — / —} или B6 мыши.Когда Ly49D экспрессировался, частота DNAM-1 была ниже в присутствии лиганда D ^d (дополнительный рис. 4d). Как было опубликовано ранее, Ly49D и Ly49H реже встречались на клетках DNAM-1 ^{+ 28} , тогда как другие активирующие рецепторы, такие как NK1.1, NKG2D, NKp46 и 2B4, имели более высокую экспрессию DNAM-1 ⁺ NK. клеток по сравнению с DNAM-1 ^— NK-клетками у мышей B6 (дополнительный рис. 4e) или с общим количеством NK-клеток от мышей B6 по сравнению с CD226 ^{— / —} мышей (дополнительный рис.4е).

Обучающие молекулы коррелируют с экспрессией DNAM-1

Чтобы беспристрастно проанализировать наш набор данных и уменьшить размерность, мы выполнили анализ главных компонентов (PCA, рис. 4), а также дискриминантный анализ ортогональной проекции и скрытых структур ( Дополнительный рис. 5). PCA рассчитывали на основе доли клеток DNAM-1 ⁺ в данной субпопуляции NK-клеток на основе экспрессии ингибирующих Ly49r и NKG2A в линиях мышей, которые экспрессируют один определенный аллель MHC-I.PCA выявил, что частота клеток DNAM-1 ⁺ в каждом подмножестве NK-клеток разделяет эти штаммы на три кластера (рис. 4a), и идентифицировал три основных информативных компонента (ПК, два показаны первыми), которые вместе составляют 87%. дисперсии. ПК 1 (ось x ) отделяет D ^d одиночный (красный) от D ^{b — / —} (синий) и K ^{b — / —} D ^{b — / −− / —} (желтый) и K ^{b — / —} мышей (зеленый).Разница между тремя кластерами в направлении PC 1, по-видимому, заключается в наличии аллеля MHC-I с сильным обучающим воздействием. K ^{b — / —} D ^{b — / −− / —} (желтый) и K ^{b — / —} мыши (зеленые) не имеют MHC- Аллель I, который может заметно образовывать NK-клетки ³¹ . NK-клетки D ^{b — / —} мышей (синие) обучаются Ly49C / I, в то время как NK-клетки в D ^d одиночных мышей (красные) обучаются присутствием D ^d через Ly49A /ГРАММ.Взаимодействия между Ly49A и D ^d имеют более высокое сродство и обеспечивают лучшую реакцию, чем любая другая пара Ly49r-MHC-I ^14,40,41 . Для разделения на ПК 1 (ось x ) все подмножества вносят положительный вклад (дополнительный рис. 5a), в то время как ПК 2 (ось y ) разделяет D ^d одиночный и K ^{b — / —} мыши (нижние квадранты) из K ^{b — / —} D ^{b — / −− / —} мышей (кластер в 0) и D ^{b — / —} мышей (верхние квадранты).Основным отличием для ПК 2, похоже, является возможность получения образования либо через Ly49C / I, либо через Ly49A / G. Это может быть дополнительно подтверждено графиком переменных, которые вносят вклад в разделение в PC 2 (Fig. 4b), где подмножества NK-клеток, экспрессирующие Ly49C / I, показывают положительные значения, тогда как те, у которых Ly49A / G имеют отрицательные значения. Мы пришли к выводу, что частота клеток DNAM-1 ⁺ среди подмножеств NK-клеток на основе экспрессии Ly49r может кластеризовать линии мышей в соответствии с известными взаимодействиями определенных аллелей MHC-I со специфическим Ly49r.

Рисунок 4: PCA показывает, что мыши спонтанно объединяются в три основные группы.

( a ) PCA на K ^{b — / —} D ^{b — / —} , D ^{b — / —} , K b — / — или Kb ^{— / —} Db ^{— / —} Dd ^{+ / +} в зависимости от доли DNAM-1 ⁺ ячеек (частота DNAM-1) в 32 определенных подмножествах NK-ячеек путем ингибирования экспрессии Ly49r и NKG2A.NK-клетки гейтируются на живых синглетах NK1.1 ⁺ CD3 ^— клеток. Данные объединены из восьми независимых экспериментов, по крайней мере, с восемью мышами в группе. Модель состоит из трех основных компонентов (два показаны первыми). Ось x соответствует ПК 1, ось y — ПК 2. ( b ) Переменные, участвующие в разделении в прогнозирующем ПК 2 для PCA. Планки погрешностей представляют собой доверительный интервал 95%.

DNAM-1

⁺ NK-клетки убивают MHC-I-дефицитные опухолевые клетки

Чтобы проверить гипотезу о том, что NK-клетки, экспрессирующие DNAM-1, представляют собой образованные подмножества, наделенные способностью к отсутствию самопознания, мы исследовали способность отсортированные DNAM-1 ⁺ NKG2A ⁺ , DNAM-1 ^— NKG2A ⁺ и DNAM-1 ^— NKG2A ⁺ подмножеств ^— IL-2-стимулированных NK-клеток для уничтожения MHC -экспрессирующие (RMA) и MHC-I-дефицитные (RMA-S) клетки.DNAM-1 ⁺ NKG2A ⁺ и DNAM-1 ⁺ NKG2A ^— NK-клетки могут различать клетки RMA и RMA-S (рис. 5a – c), а DNAM-1 ^— NKG2A ^— NK-клетки не могли различить две клеточные линии. Клетки RMA и RMA-S имеют схожие, но низкие уровни CD155 и CD112 (дополнительный рисунок 6), что указывает на то, что различие в обнаружении пропавшего себя обусловлено явной разницей в образовании, а не результатом разной стимуляции через DNAM-1. .Все три популяции могут одинаково хорошо убивать YAC-1 (рис. 5d) и, следовательно, способны распознавать и уничтожать опухолевые клетки в системе, которая в первую очередь зависит от распознавания NKG2D. Стимулированные IL-2 NK-клетки от CD226 ^{— / —} мышей могли различать клетки-мишени MHC-I ⁺ и MHC-I ^— (рис. 5e, f), что показывает, что наблюдаемая разница между NK-клетки DNAM-1 ⁺ и DNAM-1 ^— не являются результатом прямого взаимодействия DNAM-1 с лигандами на клетках-мишенях.Это предполагает, что присутствие DNAM-1 на NK-клетках коррелирует с их способностью к отсутствию самопознания, но не является необходимым для поддержания этой функции. В том же направлении мы наблюдали, что клетки DNAM-1 ⁺ и DNAM-1 ^— в образованных подгруппах (Ly49A-SP у D ^d одиночных мышей, Ly49C-SP у D ^{b — / —} мышей) одинаково хорошо проявили себя как в продукции IFN-γ, так и в высвобождении CD107 в ответ на перекрестное связывание NK1.1 (рис.6). Таким образом, мы заключаем, что DNAM-1 не требуется для индукции образования.

Рис. 5: DNAM-1 не требуется для отсутствия самопознания.

Способность NK-клеток убивать опухолевые мишени с дефицитом MHC-I коррелирует с экспрессией DNAM-1. ( a — d ) In vitro цитотоксичность сортированного DNAM-1 ⁺ NKG2A ⁺ (квадраты), DNAM-1 ⁺ NKG2A ^— (кружки) и DNAM 902-1 ^{NKG2A — (треугольники) NK-клетки, стимулированные IL-2.( a ) Уничтожение RMA, показано одно из трех экспериментов. ( b ) Уничтожение RMA-S, один представитель трех показанных экспериментов. ( c ) Расчет дифференциального убийства (± стандартное отклонение) между убийствами RMA-S и RMA, n = 3 эксперимента. ( d ) Уничтожение YAC-1 n = 3 эксперимента. ( e , f ) In vitro цитотоксичность в отношении RMA (кружки) и RMA-S (квадраты) стимулированными IL-2 CD226 — / — NK-клетками.( e ) Показан один из трех репрезентативных экспериментов, а ( f ) показаны различия в убийствах между RMA-S и RMA, n = 3 эксперимента. Планки погрешностей обозначают s.d.}

Рисунок 6: NK-клетки DNAM-1 ⁺ и DNAM-1 ^— отвечают на перекрестное связывание рецепторов.

( a ) Экспрессия IFN-γ и CD107a на DNAM-1 ⁺ и DNAM-1 ^— Ly49A SP NK-клеток от D ^d -трансгенная мышь на K ^{b — / —} D ^{b — / —} фон ( K ^{b — / —} D ^{b — / —} D d 9025 + / + ), после сшивания анти-NK1.1 показан один репрезентативный график. ( b ) Частота IFN-γ ⁺ NK-клеток на подмножествах Ly49r SP ( n = 6, 3 эксперимента). ( c ) Экспрессия IFN-γ и CD107a на DNAM-1 ⁺ и DNAM-1 ^— Ly49C-SP NK-клеток от D ^{b — / —} мыши ( K ^{b + / +} D ^{b — / —} ) после сшивания анти-NK1.1, показан один репрезентативный график. ( d ) Частота IFN-γ ⁺ NK-клеток на подмножествах Ly49r SP ( n = 6, 3 эксперимента).

Отсутствие DNAM-1 не влияет на отсутствие самопознания

На основе реостатной модели образования NK-клетки настраиваются посредством непрерывных взаимодействий через свои рецепторы с MHC-I и, возможно, с другими лигандами. Если DNAM-1 имеет решающее значение для достижения или поддержания образованного состояния, это можно проверить, исследуя недостающие самоответы у мышей, лишенных DNAM-1, или блокируя взаимодействие между DNAM-1 и его лигандами in vivo . CD226 ^{— / —} мышей отторгали MHC-I-дефицитные клетки селезенки, хотя немного менее эффективно по сравнению с мышами B6 дикого типа (рис.7а). Это может указывать на дефект образования в отсутствие DNAM-1 или на то, что DNAM-1 требуется для уничтожения целевых клеток. CD226 ^{— / —} мыши имели нормальный компартмент NK-клеток как по частоте, так и по абсолютному количеству ²⁰ . Тем не менее уменьшение количества клеток NKG2A-SP можно было наблюдать у мышей CD226 ^{— / —} по сравнению с мышами дикого типа B6 (фиг. 7b). Чтобы проверить, может ли блокада DNAM-1 изменить статус образования NK-клеток, мышей B6 лечили моноклональными антителами против DNAM-1 в течение 2 или 14 дней ⁴² .Обработка полностью аннулировала связывание нескольких антител DNAM-1 (клоны 10E5, 480.1 и TX-42.1; дополнительный рис. 7), тем самым подтверждая, что мы можем поддерживать полную блокаду DNAM-1 in vivo . У обработанных мышей не было изменений в частоте и количестве общих NK-клеток, и in vivo, заблокированных NK-клеток, все еще могли эффективно убивать MHC-I-дефицитные клетки-мишени селезенки (фиг. 7c). Мы наблюдали лишь небольшие изменения в репертуаре Ly49r, однако, как и у мышей CD226 ^{— / —} , частота NKG2A-SP NK-клеток была заметно снижена в оба тестируемых момента времени (рис.7г). Это демонстрирует, что DNAM-1 не является необходимым ни для достижения образования, ни для поддержания образованного состояния зрелых NK-клеток, и что DNAM-1 не является основным детерминантом для отторжения клеток селезенки MHC-I ^—.

Рис. 7: Отсутствие DNAM-1 не отменяет отсутствие самоуничтожения.

In vivo уничтожение MHC-I-дефицитных клеток селезенки было оценено у CD226 ^{— / —} мышей ( a ) или мышей дикого типа B6 после обработки mAb DNAM-1 ( c ) .CFSE-меченные B6 или MHC-I ^{— / —} суспензии клеток селезенки инокулировали внутривенно. и отторжение было оценено через 44 часа в селезенке. ( b ) Частота NK-клеток NKG2A-SP, заблокированных на живых, синглетных CD3 ^— NK1.1 ⁺ Ly49r ^— клеток у CD226 ^{— / —} мышей. Столбчатые диаграммы показывают данные шести (B6, B2m ^{— / —} ), семи (2 дня) или четырех (2 недели) мышей в группе из двух независимых экспериментов, по крайней мере, с двумя мышами в группе.( c , d ) DNAM-1 был заблокирован инъекцией 200 мкг анти-DNAM-1 (клон 3B3) в течение 2 дней или 2 недель каждые 5 дней и отторжения CFSE-меченного B6 или MHC-I ^{— / —} клеток селезенки было измерено через 44 часа после инокуляции клеток-мишеней ( d ). Частота NKG2A-SP NK-клеток, заблокированных на живых, синглетных CD3 ^— NK1.1 ⁺ Ly49r ^— клеток у мышей B6 лечили mAb против DNAM в течение 2 дней или 2 недель. Столбчатые диаграммы показывают данные от 6 (B6), 4 ( B2m ^{— / —} ) или 14 ( CD226 ^{— / —} ) мышей на группу из двух независимых экспериментов, по крайней мере, с двумя мышами на группу.Значения P вычислены с помощью теста t и отображены ** P <0,01, *** P <0,001. Планки погрешностей обозначают s.d.

Экспрессия DNAM-1 во время развития NK-клеток

Представление о том, что экспрессия DNAM-1 может быть связана с образованием, поднимает вопрос о том, на какой стадии во время развития NK-клеток экспрессия DNAM-1 происходит в первую очередь. Во время дифференцировки общие предшественники лимфоцитов (CLP, lin ^— c-kit ^— flk2 ⁺ CD27 ⁺ CD224 ⁺ IL-7Rα ⁺ CD122 ^—, дополнительный рис.8) превращаются в пре-NK-предшественники (pre-NKP, lin ^— c-kit ^— flk2 ^— CD27 ⁺ CD224 ⁺ IL-7Rα ⁺ CD122 ^—), прогресс в очищенный NKP (rNKP, lin ^— c-kit ^— flk2 ^— CD27 ⁺ CD224 ⁺ IL-7Rα ⁺ CD122 ⁺ ) и в конечном итоге приводит к NK1.1 ⁺ 9 + NK-клетки, выходящие из костного мозга (BM) ⁴³ . И DNAM-1, и NKG2A отсутствовали на CLP, несколько пре-NKP начали экспрессировать DNAM-1, в то время как rNKP были в основном положительными для DNAM-1 (рис.8а, б). Экспрессия NKG2A, самого раннего MHC-I-специфического ингибирующего рецептора ⁴⁴ , была впервые обнаружена на незрелых NK-клетках ВМ NK1.1 ⁺ .

Фигура 8: DNAM-1 экспрессируется в ранних предшественниках NK-клеток раньше ингибирующих рецепторов.

( a ) экспрессия DNAM-1, ( b ) экспрессия NKG2A на CLP, пре-NKP, R-NKP и зрелых NK-клетках. Стратегия гейтирования для CLP pre-NKP и rNKP подробно показана на дополнительном рисунке 8. Зрелые BM или NK-клетки селезенки определяли путем гейтирования по NK1.1 ⁺ CD3 ^— клеток. В этих подгруппах анализировали экспрессию NKG2A или DNAM-1. Показаны объединенные данные по крайней мере трех различных экспериментов на 14 мышах с стандартным отклонением. ( c ) Частота DNAM-1 и ( d ) DNAM-1 MFI на NK-клетках разных стадий созревания в селезенке. Объединенные данные по крайней мере трех различных экспериментов на 12 мышах показаны с s.d. Планки погрешностей обозначают s.d.

Таким образом, оказывается, что экспрессия DNAM-1 включается раньше и независимо от специфических ингибиторных рецепторов MHC-I, открывая возможность того, что она может участвовать в образовании NK-клеток уже в BM.Экспрессия DNAM-1 была аналогичной на NK-клетках селезенки, костного мозга и печени 10-дневных мышей B6 и K ^{b — / —} D ^{b — / −− / —} мышей, перед началом экспрессии Ly49r (дополнительный рис. 9), предполагая, что пониженный уровень, наблюдаемый у взрослых K ^{b — / —} D ^{b — / —} мышей, вводится позже в течение жизни. CD27 и CD11b являются маркерами, которые расчленяют NK-клетки на функционально различные субпопуляции созревания ⁴⁵ .Экспрессия DNAM-1 увеличивается, когда NK-клетки активируют CD27, а экспрессия DNAM-1 максимальна на NK-клетках CD27 ⁺ CD11b ^—, а затем снова снижается при дальнейшем созревании до CD27 ^— CD11b ⁺ клеток (рис. 8в, г).

MHC-I-зависимая пластичность экспрессии DNAM-1

Адоптивный перенос NK-клеток от мышей с экспрессией MHC-I реципиентам, у которых отсутствует MHC-I, может привести к повторному образованию NK-клеток и изменению экспрессии активирующих рецепторы и рецепторы адгезии ^36,46,47 .Поскольку мы наблюдали, что у мышей B2m ^{— / —} уровни DNAM-1 снижены, мы предположили, что экспрессия DNAM-1 будет изменяться на NK-клетках после адоптивного переноса зрелых NK-клеток в другое окружение MHC-I. Действительно, наблюдалось заметное снижение экспрессии DNAM-1 на NK-клетках B6, перенесенных B2m ^{— / —} мышам (фиг. 9b). Этот эффект был еще более выражен, когда мы окрашивали ингибирующие рецепторы и запускали Ly49C-SP или Ly49I-SP, в то время как в других подмножествах SP, включая NKG2A-SP, снижения не наблюдалось (дополнительный рис.9). Перенос зрелых NK-клеток B2m ^{— / —} мышам RAGcγ ^{— / —} (в качестве хозяев MHC-I ⁺ ) привел к положительной регуляции MFI DNAM-1 на перенесенных NK-клетках, экспрессирующих DNAM-1 ( Рис. 9б). Перенос B2m ^{— / —} NK-клеток мышам B2m ^{— / —} , однако, привел к небольшому сокращению популяции DNAM-1 ⁺ без изменения MFI на клетках, которые были DNAM. -1 ⁺ . Никаких значительных изменений в частоте NK-клеток DNAM-1 ⁺ не наблюдалось ни в одной из ситуаций переноса (рис.9в). Таким образом, хотя экспрессия DNAM-1 является ранним событием в развитии NK-клеток, ее экспрессия пластична и может зависеть от среды MHC-I.

Рисунок 9: Экспрессия DNAM-1 изменяется после переноса в среду, отличную от MHC-I.

Экспрессия DNAM-1 изменяется после адаптивного переноса от B6 к B6 ( n = 8) или B2m ^{— / —} ( n = 9) мышей или от B2m ^{— / —} до B2m ^{— / —} ( n = 7) или MHC-I ⁺ RAGcγ ( n = 8) мышей.( a ) Зрелые NK-клетки селезенки переносили, как описано ранее, ³⁶ ( b ) частота DNAM-1 и ( c ) DNAM-1 MFI на NK-клетки после адоптивного переноса. NK-клетки от перенесенных мышей попадают в клетки CD45.1 ⁺ NK1.1 ⁺ CD3 ^—. Данные объединены из трех независимых экспериментов. Значения P вычисляются с использованием t -теста для частот или теста Манна – Уитни для MFI и отображаются * P <0.05, *** P <0,001. Планки погрешностей обозначают s.d.

Продажа

SIG SAUER P226, 9-мм полноразмерный пистолет SIG P226

Продажа SIG SAUER P226, 9-мм полноразмерный пистолет SIG P226

Магазин не будет работать корректно, если куки отключены.

Похоже, в вашем браузере отключен JavaScript. Для наилучшего взаимодействия с нашим сайтом обязательно включите Javascript в своем браузере.

SIG SAUER P226 установил стандарт, по которому оцениваются все остальные боевые пистолеты. Знаменитый P226 служил вместе с морскими котиками США на протяжении десятилетий и принимал участие в боевых действиях по всему миру. Благодаря неизменной точности и надежности, а также миллионам и миллионам выстрелов, он заслужил репутацию лучшего боевого пистолета.

Фильтр П226

Действие триггера +

Соответствует государству +

Проверка почтового индекса

В некоторых штатах есть юридические ограничения на покупку товаров, поэтому нам необходимо узнать ваше местонахождение.

Проверка возраста

Некоторые продукты имеют ограничения на покупку для лиц младше 21 года. Пожалуйста, подтвердите свой возраст.

CD226 регулирует противоопухолевые ответы естественных клеток-киллеров посредством опосредованной фосфорилированием инактивации фактора транскрипции FOXO1

Значение

CD226 — важный активирующий рецептор, участвующий в опосредовании ответов естественных киллеров (NK) на опухоли, но как CD226 осуществляет контроль над функцией NK-клеток полностью не изучен.CD226 принадлежит к семейству рецепторов полиовируса (PVR) -нектинов, которое включает TIGIT и CD96, при этом TIGIT привлекает большое внимание как ключевая контрольная точка в противоопухолевых ответах Т-клеток и NK-клеток и как мишень иммунотерапии. Таким образом, крайне важно определить, как CD226 противодействует действиям TIGIT и CD96, с которыми он конкурирует за связывание со своими лигандами, такими как CD155 (PVR). Мы демонстрируем, что включение CD226 в CD155 необходимо для фосфорилирования фактора транскрипции FOXO1, что приводит к инактивации его негативного регуляторного контроля над эффекторной функцией NK-клеток.

Abstract

Распознавание опухолевых клеток естественными киллерами (NK) опосредуется активацией рецепторов, таких как CD226, с подавлением эффекторных функций, часто контролируемых негативными регуляторными факторами транскрипции, такими как FOXO1. Здесь мы показываем, что регуляция цитотоксичности NK-клеток CD226 облегчается за счет инактивации FOXO1. Анализ экспрессии генов NK-клеток, выделенных из сингенных опухолей, выращенных у мышей дикого типа или мышей с дефицитом CD226, выявил нарушение регуляции экспрессии FOXO1-регулируемых генов в отсутствие CD226.Анализы цитотоксичности и стимуляции in vitro продемонстрировали, что CD226 необходим для оптимального уничтожения опухолевых клеток-мишеней с участием его лиганда CD155, что приводит к фосфорилированию FOXO1. Дефицит CD226 или блокада анти-CD226 антител снижают цитотоксичность с сопутствующей нарушенной инактивацией FOXO1. Кроме того, ингибиторы фосфорилирования FOXO1 аннулировали опосредованную CD226 передачу сигналов и эффекторные ответы. Эти результаты определяют путь, с помощью которого CD226 осуществляет контроль ответов NK-клеток против опухолей.

Клетки естественные киллеры (NK) — это лимфоциты врожденной иммунной системы, которые играют важную роль в раннем обнаружении и уничтожении инфицированных вирусом и злокачественно трансформированных клеток (1). Активация NK-клеток зависит от интеграции активирующих и ингибирующих сигналов, полученных от ряда рецепторов (2). Ингибирующие рецепторы позволяют NK-клеткам ощущать аномальные клетки, которые подавили или утратили экспрессию MHC класса I в результате инфекции или трансформации (3).В отсутствие ингибирующей передачи сигналов активирующие рецепторы, обычно распознающие лиганды, индуцированные патогенами или стрессом, запускают эффекторные ответы. Среди активирующих рецепторов выделяются рецепторы естественной цитотоксичности NKG2D, 2B4 и CD226 (также известные как «вспомогательная молекула ДНКX-1», DNAM-1) (4).

CD226 представляет собой гликопротеин семейства Ig-подобных, экспрессируемый на большинстве иммунных клеток, включая NK-клетки и Т-клетки, который принадлежит к семейству рецепторов полиовируса (PVR) -нектинов (5-8). Другие члены этого семейства включают Т-клеточный Ig и домен ITIM (TIGIT) и CD96, которые конкурируют за связывание лиганда с CD226 (9⇓ – 11).Лигандами для CD226 являются CD155 (также известный как «PVR») и нектин CD112, при этом CD226 имеет более высокое сродство к CD155 (6, 10, 12). CD155 и CD112 широко экспрессируются на нормальных эпителиальных, эндотелиальных, нейрональных и фибробластных клетках. Экспрессия лиганда CD226 часто повышается в ответ на клеточный стресс (13). Повышенная экспрессия CD155 и CD112 наблюдается во многих линиях опухолевых клеток, особенно эпителиального или нейронального происхождения, таких как карциномы и меланомы (6, 14–18).В контексте опосредованного NK-клетками элиминации опухолевых клеток было продемонстрировано, что CD226 является важным активирующим рецептором. Было показано, что блокада CD226 антителами препятствует уничтожению человеческими NK-клетками гемопоэтических и негематопоэтических опухолевых мишеней (5). Вовлечение CD226 – CD155 может быть более важным, чем распознавание CD112, поскольку блокада CD155 снижает чувствительность опухолевых клеток к уничтожению NK-клетками, тогда как блокада CD112 не может ингибировать это уничтожение (6, 14). Создание мышей с дефицитом CD226 подтвердило роль CD226 в иммунном надзоре за опухолями, при этом мыши Cd226 ^{— / —} оказались более восприимчивыми, чем мыши WT, к множеству опухолей, включая меланому и карциному легких (7, 18+). –20).

В NK-клетках мыши стимуляция антителами к CD226 способствует активации NK-клеток через иммунорецепторный тирозиновый хвост (ITT) -подобный мотив, который связывает CD226 с адаптерным белком GRB2, тем самым вызывая фосфорилирование тирозина VAV1, PLC-γ1, и PI3K и, следовательно, активирующие киназы ERK и AKT (21). CD226-опосредованная активация AKT в NK-клетках мыши интригует, поскольку фактор транскрипции FOXO1, прямой субстрат фосфорилированного AKT, является негативным регулятором хоминга NK-клеток, поздней стадии созревания и эффекторных функций (22).FOXO1 принадлежит к подсемейству FOXO транскрипционных факторов Forkhead. Белки FOXO функционируют в широком диапазоне тканей, регулируя различные клеточные процессы, включая энергетический метаболизм, развитие клеточного цикла, репарацию ДНК, апоптоз, аутофагию и дифференцировку клеток (23–25). Контроль транскрипционной активности FOXO1, ее количество и локализация определяются посредством различных посттрансляционных модификаций, в основном фосфорилирования FOXO1 (24). FOXO1 напрямую фосфорилируется AKT и / или SGK1, вызывая транслокацию FOXO1 из ядра в цитоплазму, где он изолируется и подвергается деградации, таким образом эффективно инактивируя FOXO1 от осуществления контроля экспрессии гена-мишени.

Здесь мы демонстрируем, что взаимодействие CD226 с NK-клетками мыши посредством взаимодействия с опухолевыми клетками, экспрессирующими CD155, опосредует фосфорилирование FOXO1 и активирует NK-клетки. Используя генетически CD226-дефицитных мышей и анти-CD226-антитела, которые либо блокируют взаимодействия CD226-CD155, либо разрешают взаимодействие, мы показываем, что передача сигналов через путь AKT-FOXO1 обеспечивает CD226 механизмом для прямой регуляции цитотоксичности NK-клеток. Эти данные подчеркивают неотъемлемую роль CD226 в противоопухолевых ответах NK-клеток.

Результаты

Дефицит CD226 усиливает рост сингенной опухоли CT26 и нарушает регуляцию экспрессии генов в NK-клетках, инфильтрирующих опухоль.

Использование мышей с дефицитом CD226 подтвердило, что CD226 является важным активирующим рецептором в иммунном надзоре за опухолями, при этом мыши Cd226 ^{— / —} более восприимчивы, чем мыши WT, к множеству опухолей (7, 15, 18). № – 20, 26). Здесь мы использовали модель сингенной опухоли CT26 для оценки функциональной роли CD226 в противоопухолевых ответах у иммунокомпетентных мышей.Рост опухоли CT26 был усилен у мышей с дефицитом CD226 по сравнению с однопометными мышами дикого типа (фиг. 1 A ). Иммунные клетки CT26, инфильтрирующие опухоль, состояли из большой части NK-клеток, при этом примерно треть всех CD45 ⁺ -клеток были NK-клетками по сравнению с 10% CD8 ⁺ T-клеток и 30% CD4 ⁺ Т-клетки со скромным, но значительным снижением частот NK-клеток и CD8 ⁺ Т-клеток, наблюдаемых в опухолях мышей CD226-KO (рис.1 B и SI, приложение , рис.S1 A ). Приблизительно 30% NK-клеток экспрессировали CD226, а также CD96, тогда как большая часть CD8 ⁺ Т-клеток экспрессировала этих членов семейства PVR-нектинов; Экспрессия TIGIT была в основном ограничена Tregs (рис. 1 C ). Уровни экспрессии CD226 и CD96 также были выше на CD8 ⁺ Т-клетках (фиг. 1 D ). Учитывая преобладание NK-клеток в опухолях CT26, NK-клетки были выделены из опухолей, а также из селезенки и дренирующих лимфатических узлов через 21 день после инокуляции, как и CD8 ⁺ и CD4 ⁺ T, клетки для секвенирования РНК (RNA -seq).На основании экспрессии гена Cd226 экспрессировалось NK-клетками, CD8 ⁺ T-клетками и CD4 ⁺ T-клетками в опухолях и селезенке, как и Cd96 (рис. 1 E ), что соответствует наблюдаемая экспрессия белка. Напротив, экспрессия Tigit ограничивалась инфильтрирующими опухоль лимфоцитами. Профили экспрессии генов NK-клеток, очищенных из опухолей CT26, показали, что 799 генов были более высоко экспрессированы в WT, чем в клетках CD226-KO, в то время как 97 генов были более высоко экспрессированы в клетках CD226-KO, с использованием критерия различия в два или более раз. (Рисунок.1 F ) (полный список дифференциально экспрессируемых генов см. В наборе данных S1). Дифференциальная экспрессия генов была выражена только в NK-клетках, выделенных из опухолей, поскольку только один ген дифференциально экспрессировался в NK-клетках, выделенных из селезенки (рис. 1 G ). Кроме того, действие CD226 было в первую очередь ограничено NK-клетками, поскольку проникающие в опухоль Т-клетки CD8 ⁺ и CD4 ⁺ показали несколько генов с двукратной или большей дифференциальной экспрессией (рис. 1 H и I и Набор данных S1).Дефицит CD226 оказал явное влияние на идентичность опухолевых NK-клеток, что видно по экспрессии набора генов, используемых для определения NK-клеток в различных состояниях ( SI Приложение , рис. S1 B ) (27). Анализ обогащения набора генов (GSEA) не выявил более чем двукратного изменения любого пути среди 50 наборов отличительных генов, принадлежащих коллекции базы данных молекулярных сигнатур (MSigDB).

Рис. 1. Рост опухоли

CT26 у мышей с дефицитом CD226 и дифференциальная экспрессия генов в лимфоцитах, инфильтрирующих опухоль.( A ) Рост опухоли CT26 у мышей с дефицитом CD226 и однопометных мышей дикого типа. ( слева ) Групповой анализ со статистически значимыми различиями ( n = 10 на группу; * P <0,005). ( Центр и Справа ) Кривые роста опухоли от отдельных животных WT ( Центр ) и CD226 ( Справа ) животных. Данные представляют четыре независимых эксперимента. ( B ) Состав лимфоцитов в опухолях CT26. Частоты CD4 ⁺ Т-клеток, CD8 ⁺ Т-клеток и NK-клеток в опухолях, полученных от мышей WT (черные символы) или CD226-KO (красные символы) на 21 день ( n = 5 на группу).( C ) Частота инфильтрирующих опухоль NK-клеток, CD8 ⁺ Т-клеток, CD4 ⁺ Т-клеток и Treg, экспрессирующих CD226, CD96 или TIGIT. Опухоли собирали на 21 день и проводили окрашивание методом проточной цитометрии. ( D ) Уровни поверхностной экспрессии CD226, CD96 или TIGIT на субпопуляциях лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, измеренные с помощью проточной цитометрии. Данные проточной цитометрии показаны как среднее ± стандартное отклонение; каждый символ представляет отдельное животное ( n = 5 на группу). ( E ) Экспрессия генов CD226, CD96 и TIGIT в NK-клетках, CD8 ⁺ Т-клетках или CD4 ⁺ Т-клетках, очищенных от опухолей (черные символы) или селезенки (синие символы) несущих опухоль WT CT26 мышей.rpkm, считываний на килобазу транскриптов на миллион сопоставленных операций чтения. ( F ) Графики вулканов, демонстрирующие дифференциальную экспрессию генов в NK-клетках, очищенных из пулов опухолей. Опухоли собирали на 21 день, и три пула, состоящие из четырех опухолей каждый, обрабатывали на РНК-seq. Были нанесены гены, отвечающие критериям более чем двукратного различия, и скорректированное значение P > 0,05. Гены с более высокой экспрессией в опухолевых NK-клетках мышей WT показаны красным; гены с более высокой экспрессией у мышей CD226-KO показаны синим цветом.( G ) Дифференциальная экспрессия гена в NK-клетках, очищенных от селезенки. ( H ) Дифференциальная экспрессия гена CD8 ⁺ Т-клеток, очищенных от опухолей. ( I ) Дифференциальная экспрессия гена CD4 ⁺ Т-клеток, очищенных от опухолей. Указано количество дифференциально экспрессируемых генов. Список дифференциально экспрессируемых генов см. В наборе данных S1. N.C., без изменений.

Дефицит

CD226 влияет на экспрессию FOXO1-регулируемых генов в NK-клетках из сингенных опухолей.

Поскольку профили экспрессии генов показали, что инфильтрирующие опухоль NK-клетки от мышей WT и CD226-KO демонстрируют сильно дифференцированную экспрессию генов, мы попытались определить, может ли нарушение передачи сигналов CD226 напрямую приводить к нарушению активности NK-клеток. Поскольку FOXO1 является известным негативным регулятором созревания и эффекторной функции NK-клеток и участвует в регуляции множества клеточных процессов посредством прямого, а также косвенного транскрипционного контроля широкого спектра генов (22), мы сосредоточились на генах, которые, как известно, регулируются. с помощью FOXO1 и / или FOXO3 (25) или играть критическую роль в NK-клетках.Проникающие в опухоль NK-клетки имели активированный фенотип по сравнению с NK-клетками селезенки (фиг. 2 A ). Дефицит CD226 в опухолевых NK-клетках привел к широко распространенному нарушению регуляции FOXO-контролируемых генов, влияя на экспрессию других факторов транскрипции, участвующих в функции иммунных клеток (рис.2 B ), а также генов, участвующих в различных клеточных путях, таких как активация / эффектор функции (фиг.2 C ), апоптоза (фиг.2 D ), трафика (фиг.2 E ) и клеточного цикла (фиг.2 F ).

Рис. 2.

Анализ экспрессии генов для NK-клеток, очищенных от сингенных опухолей CT26. ( A ) Тепловая карта выбранных FOXO1-регулируемых генов или генов с известной функцией в NK-клетках. ( B ) Экспрессия генов факторов транскрипции Tbx21 , Kfl2 , Runx3 и Tcf7 . ( C ) Экспрессия генов эффекторных молекул гранзима B ( Gzmb ), гранзима A ( Gzma ), перфорина ( Prf1 ) и маркера Klrg1 .( D ) Экспрессия генов компонентов апоптоза / выживания Bcl2 , Bcl6 и FasL . ( E ) Экспрессия генов хемокиновых рецепторов Ccr5 и Ccr2 . ( F ) Экспрессия гена циклина D1 ( Ccnd1 ). Для всех анализов образцы состояли из трех или четырех пулов клеток, выделенных из тканей, собранных у четырех мышей на пул. Графики в виде столбиков и усов обозначают среднее значение ± стандартное отклонение, причем каждый символ представляет одну объединенную выборку.Статистически значимые различия между мышами дикого типа и мышами с дефицитом CD226 (KO) обозначены числами, обозначающими значения P .

Профили экспрессии генов CD8 ⁺ Т-клеток, очищенных от опухолей CT26, установленных у мышей WT или CD226-KO, показали только ограниченное количество генов с более чем двукратными различиями в экспрессии. Хотя инфильтрирующие опухоль Т-клетки CD8 ⁺ имели фенотип эффекторных клеток по сравнению с Т-клетками CD8 ⁺ , присутствующими в селезенке или дренирующих лимфатических узлах, явных различий в экспрессии генов, регулируемых FOXO1 (28-30), не наблюдалось. между клетками WT и CD226-KO ( SI Приложение , рис.S2). Однако более точный анализ сигнатур генов, используемый для определения кластеров CD8 ⁺ Т-клеток на различных стадиях ответа на инфекцию (31), показал, что CD226-KO CD8 ⁺ Т-клетки имели дисрегулируемую экспрессию генов почти во всех исследованных кластерах, особенно те, которые участвуют в эффекторной функции, такие как Klrg1 , Tbx21 , Prf1 и Ifng (рис. 3).

Рис. 3. Анализ экспрессии гена

для CD8 ⁺ Т-клеток, очищенных от сингенных опухолей CT26.( Left ) Тепловые карты генов, используемые для определения специфических кластеров CD8 ⁺ Т-клеток. Для всех анализов образцы состояли из трех или четырех пулов клеток, выделенных из тканей, собранных у четырех мышей на пул. ( Right ) Гены, показывающие статистически значимые различия в экспрессии, показаны на графиках. Графики в виде столбиков и усов обозначают среднее значение ± стандартное отклонение, причем каждый символ представляет одну объединенную выборку. Статистически значимые различия между мышами дикого типа и мышами с дефицитом CD226 (KO) обозначены числами, обозначающими значения P .

Оптимальное уничтожение NK-клеток зависит от экспрессии лигандов CD226 в клетках-мишенях.

Активация CD226 требует взаимодействия с его лигандами CD155 и / или CD112. Это было подтверждено проведением анализов цитотоксичности in vitro с использованием лимфокин-активированных клеток-киллеров (LAK), полученных из основной массы клеток селезенки дикого типа, в качестве эффекторов. В отличие от CT26, который экспрессирует многочисленные лиганды для других активирующих рецепторов или ингибиторов контрольных точек, опухоль меланомы B16F10 в значительной степени лишена этих лигандов ( SI Приложение , рис.S3 A ). Rae1 Экспрессия гена обнаруживалась в опухолях B16F10; однако белок RAE-1, лиганд для NKG2D, не обнаруживался на поверхности клетки ( SI Приложение , рис. S3 B ). Клетки B16F10 использовали в качестве сингенной мишени, поскольку они конститутивно экспрессируют CD155 и CD112 ( SI Приложение , фиг. S3 C и D ). Линия клеток с дефицитом CD155 / CD112 B16F10, обозначенная как «B16.DKO», также была получена нокаутом CRISPR как Cd155 , так и Cd112 ( SI, приложение , фиг.S3 D ). Клетки WT LAK эффективно лизировали мишени B16F10 с почти 70% цитотоксичностью (фиг. 4 A ). Однако клетки WT LAK плохо распознают мишени B16.DKO, при этом цитотоксичность снижается более чем на 40% (рис. 4 A ). Клетки LAK экспрессировали уровни CD226, CD96 и TIGIT ( SI Приложение , рис. S4 A — C ), аналогичные уровням в свежеочищенных NK-клетках селезенки или очищенных NK-клетках, активированных IL-2 (см. как клетки «IL-2 NK»). Клетки LAK не экспрессировали, или небольшая часть клеток LAK не экспрессировала низкие уровни других ингибиторов контрольных точек, таких как PD-1, CTLA-4, TIM-3 и LAG3 ( SI Приложение , рис.S4 D ). LAK-клеточное уничтожение клеток B16F10 было сравнимо с убийством NK-клеток IL-2, с существенно более высокой цитотоксичностью, чем очищенные NK-клетки ( SI, приложение , фиг. S4 E ).

Рис. 4. Включение

CD226 усиливает активность эффекторных клеток и индуцирует фосфорилирование FOXO1. ( A , Left ) Профилирование в реальном времени уничтожения клетками WT LAK мишеней B16F10 (черная линия) или мишеней B16F10 с дефицитом CD155 / CD112 (B16.DKO) (красная линия). ( Right ) Процент цитотоксичности в 4-часовой временной точке; данные представлены как среднее ± стандартное отклонение для трех повторов.Анализы цитотоксичности были выполнены пять раз с аналогичными результатами. ( B ) Клетки WT LAK стимулировали клетками B16F10 или B16.DKO в течение указанного времени (минут). Иммуноблоттинг проводился для pFOXO1 (T24) / pFOXO3a (T32), общего FOXO1 или FOXO3, pAKT (S473), общего AKT, pSGK1 (S78), общего SGK1, pGSK-3α / β (S21 / 9) и общего GSK- 3β. Числа под каждой полосой представляют собой денситометрическое количественное определение после нормализации фосфорилированного белка до общего белка. Показанные данные представляют четыре независимых эксперимента.( C ) Кинетика индукции pAKT, pFOXO1 или общего FOXO1 в цитозольной фракции ( Слева ) или индукции общего FOXO1 в ядерной фракции ( Справа ). Клетки WT или CD226-KO LAK стимулировали клетками B16F10 в течение указанного времени (минут). Клетки LAK собирали и фракционировали на цитозольные или ядерные фракции. Иммуноблоттинг для pAKT, pFOXO1 или общего FOXO1 в цитозольной или ядерной фракциях был выполнен ( SI Приложение , рис. S6). Индукцию складки определяли путем нормализации измерений денситометрии к белку домашнего хозяйства GAPDH и затем нормализации до нестимулированного состояния (t = 0 мин).Результаты являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. ( D ) Влияние ингибитора пути AKT-FOXO1 на цитотоксичность эффекторных клеток в отношении мишеней B16F10. Клетки LAK WT предварительно инкубировали с указанной концентрацией ингибитора FOXO1 (iFOXO1), ингибитора AKT1 / 2 (iAKT1 / 2) или ингибитора SGK1 (iSGK1) в течение 30 минут перед инкубацией с клетками-мишенями. Процент цитотоксичности определяли через 4 часа. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение трех измерений. Эксперименты с ингибиторами проводились как минимум дважды с аналогичными результатами.

Фосфорилирование FOXO1 индуцируется при взаимодействии NK-клеток с мишенями B16F10.

Затем мы оценили, зависит ли CD226-опосредованное уничтожение опухолевых клеток NK-клетками от передачи сигналов через FOXO1. Фосфорилирование FOXO1 необходимо для инактивации ядерного FOXO1, что приводит к освобождению функции эффекторных клеток от негативной регуляции FOXO1 (22). Фосфорилирование AKT сильно индуцировалось в клетках LAK WT уже через 2 мин после стимуляции либо B16F10, либо B16.Клетки DKO (рис. 4 B ), подтверждающие предыдущие сообщения о том, что CD226 запускает фосфорилирование AKT (21). FOXO1 является прямым субстратом фосфорилированного AKT (22), а фосфорилирование FOXO1 и FOXO3a обнаруживалось через 2 мин и увеличивалось в течение 30 мин при стимуляции клетками B16F10, но лишь слабо индуцировалось клетками B16.DKO (рис. 4 B ). . Хотя было показано, что IL-2 индуцирует фосфорилирование FOXO1 (22), мы наблюдали, что относительная сила индукции при стимуляции B16F10 была намного сильнее, чем при стимуляции IL-2 ( SI Приложение , рис.S5 A ). Аналогичные эффекты наблюдались при использовании NK-клеток IL-2 ( SI, приложение , рис. S5, B ). FOXO1 также является субстратом pSGK1 (24), но фосфорилирование SGK1 не было заметно усилено при стимуляции, независимо от экспрессии CD226 или лиганда (рис. 4 B ). Другим негативным регулятором активации NK-клеток является киназа гликогенсинтазы (GSK) -3β (32), но, в отличие от FOXO1, GSK-3β конститутивно фосфорилировался в клетках LAK WT, и дальнейшее фосфорилирование существенно не увеличивалось с помощью B16F10 или B16.ДКО стимуляция (рис. 4 В ).

При фосфорилировании FOXO1 перемещается из ядра в цитоплазму, где он убиквитинируется и впоследствии разлагается (24). Цитозольный фосфорилированный FOXO1 обнаруживался через несколько минут после стимуляции в клетках LAK WT, но не индуцировался в клетках LAK CD226-KO (фиг. 4 C и SI, приложение , фиг. S6). Кинетика фосфорилирования FOXO1 в клетках LAK дикого типа отражает фосфорилирование AKT, что согласуется с тем, что FOXO1 является прямым субстратом фосфор-AKT (рис.4 С ). Постепенное снижение общего FOXO1 наблюдалось в ядерной фракции клеток WT LAK, тогда как увеличение наблюдалось в клетках CD226-KO LAK (фиг. 4 C ). Ни фосфорилированный FOXO1, ни фосфорилированный AKT не были обнаружены в ядерной фракции клеток WT или CD226 LAK ( SI, приложение , фиг. S6). Эти данные согласуются с транслокацией ядерного FOXO1 в цитоплазму после фосфорилирования, индуцированного при передаче сигнала CD226.

Ингибирование фосфорилирования FOXO1 отменяет опосредованное CD226 убийство.

Анализы цитотоксичности проводили в присутствии ингибитора FOXO1, который предотвращает фосфорилирование (33), чтобы подтвердить, что опосредованное CD226 фосфорилирование FOXO1 необходимо для усиления эффекторной активности. Ядерный FOXO1 не перемещается в цитоплазму в присутствии ингибитора, таким образом поддерживая FOXO1 в активном состоянии. Ингибитор FOXO1 отменял способность клеток WT LAK убивать мишени B16F10 дозозависимым образом, в то время как уничтожение мишеней с дефицитом CD155 / CD112 не затрагивалось (рис.4 D и SI Приложение , рис. S4 F ), что указывает на то, что передача сигнала CD226 не может индуцировать фосфорилирование FOXO1 в присутствии ингибитора. Ингибиторы AKT и SGK1 были использованы для подтверждения сигнальной роли этих киназ в CD226-опосредованной инактивации FOXO1. Ингибитор AKT сильно снижает цитотоксичность клеток LAK WT против клеток-мишеней B16F10, тогда как ингибирование SKG1 не влияет на цитотоксичность (рис. 4 D и SI, приложение , рис.S4 F ). Ни один из ингибиторов не влиял ни на эффекторную, ни на жизнеспособность клеток-мишеней ( SI Приложение , рис. S4 G ). Ингибиторы FOXO1 и AKT снижали цитотоксичность почти на 80%, подтверждая прямую связь между фосфорилированием AKT и FOXO1. Однако фосфорилирование AKT наблюдалось без сопутствующего фосфорилирования FOXO1, как в случае стимуляции клетками B16.DKO (рис. 4 B ), что указывает на то, что пути AKT может быть недостаточно для индукции фосфорилирования FOXO1 и что другие пути могут также участвовать в передаче сигналов CD226.

Фосфорилирование FOXO1 конкретно регулируется CD226.

Хотя эффекторные клетки экспрессируют мишени CD226 и B16F10, экспрессируют CD155 и CD112, также могут присутствовать другие пары активирующий рецептор / лиганд. Чтобы оценить потребность в CD226 для индукции фосфорилирования FOXO1, мы использовали эффекторные клетки, полученные от мышей с дефицитом CD226. У CD226-дефицитных клеток LAK была нарушена их способность лизировать мишени B16F10 с почти 30% снижением цитотоксичности по сравнению с клетками LAK WT; отсутствие CD226 не уменьшало убийство B16.Клетки-мишени DKO (рис. 5 A ). Фосфорилирование FOXO1 было сильно нарушено, когда клетки CD226 KO LAK стимулировали клетками-мишенями B16F10, и было дополнительно снижено с использованием клеток B16.DKO (фиг. 5 B ). Однако AKT фосфорилировался, когда CD226-дефицитные клетки LAK стимулировали клетками B16F10 или B16.DKO. Необходимость взаимодействия CD226 с его лигандами для индукции передачи сигнала была дополнительно подтверждена обработкой клеток WT LAK анти-CD226 mAb, способных блокировать взаимодействие с CD155 ( SI, приложение , рис.S7 А ). MAb против CD226 ингибировало уничтожение клетками WT LAK клеток-мишеней B16F10 дозозависимым образом, снижая цитотоксичность на ∼30% при наивысшей протестированной концентрации (рис. 5 C и SI, приложение , рис. S7 B ). ) и, таким образом, оказывает влияние на уничтожение клеток LAK, сравнимое с действием дефицита CD226 (фиг. 5 A ). MAb против CD226 не влияло на уничтожение CD226-дефицитными клетками LAK мишеней B16F10 или B16.DKO ( SI Приложение , фиг. S7 C и D ).Блокада CD226 нарушала фосфорилирование FOXO1 в клетках WT LAK, стимулированных B16F10, фенокопируя сигнальные ответы в клетках CD226-KO LAK (фиг. 5 D ).

Рис. 5.

Влияние дефицита CD226 или блокирования анти-CD226 mAb на цитотоксичность и фосфорилирование FOXO1. ( A , Left ) Профилирование в реальном времени уничтожения клетками CD226-KO LAK клеток-мишеней B16F10 (красная кривая) или B16.DKO (синяя кривая); Убийство WT LAK мишеней B16F10 (черный след) использовали в качестве компаратора для оптимальной цитотоксичности.( Right ) Процент цитотоксичности в 4-часовой временной точке; данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение для трех повторов. ( B ) Клетки CD226-KO LAK стимулировали клетками B16F10 или B16.DKO в течение указанного времени (минут). Иммуноблоттинг проводили для pFOXO1 (T24) / pFOXO3a (T32), общего FOXO1 или FOXO3, pAKT (S473) и общего AKT. Числа под каждой полосой представляют собой денситометрическое количественное определение после нормализации фосфорилированного белка до общего белка. ( C , Left ) Цитотоксичность против мишеней B16F10 клетками WT LAK, предварительно инкубированными с 50 мкг / мл mAb против CD226 (красная пунктирная линия) или изотипическим контролем (черная сплошная линия) в течение 30 минут перед инкубацией с мишенями.( Right ) Процент цитотоксичности в 4-часовой временной точке; данные представлены как среднее ± стандартное отклонение для трех повторов. ( D ) Иммуноблоттинг выполняли на клетках WT LAK, предварительно инкубированных в течение 30 минут с изотипическим контролем или mAb против CD226 перед стимуляцией клетками B16F10 в течение указанного времени (минут). Все эксперименты по цитотоксичности и передаче сигналов были выполнены не менее трех раз с аналогичными результатами. ( E ) Влияние ингибитора FOXO1 (iFOXO1) ( слева ) или ингибитора AKT1 / 2 (iAKT1 / 2) ( справа ) на CD226-KO (красная сплошная линия) или эффекторные клетки, обработанные mAb против CD226 цитотоксичность в отношении мишеней B16F10.Для блокады антителами клетки LAK WT предварительно инкубировали с указанной концентрацией iFOXO1 вместе с либо изотипическим контролем (черная сплошная линия), либо с mAb против CD226 (красная пунктирная линия) в концентрации 50 мкг / мл в течение 30 минут перед инкубацией с мишенью. клеток, и процент цитотоксичности рассчитывали на 4-часовой временной точке; каждая точка данных представляет собой среднее значение ± стандартное отклонение трех измерений. Дважды были проведены эксперименты с аналогичными результатами.

Ингибирование FOXO1 не приводило к дальнейшему ухудшению цитотоксичности, опосредованной клетками CD226-KO LAK или клетками WT LAK, обработанными mAb против CD226 (фиг.5 E ), что указывает на то, что отсутствие передачи сигнала CD226 достаточно для полного предотвращения фосфорилирования FOXO1. Напротив, ингибитор AKT дополнительно снижает цитотоксичность клеток CD226-KO LAK или обработанных анти-CD226 клеток WT LAK на ~ 20% (рис. 5 E ), что позволяет предположить, что другие пары активирующий / лиганд также могут присутствовать и передавать сигнал через путь AKT.

Обсуждение

Здесь мы показываем, что взаимодействие CD226 с его лигандами CD155 и / или CD112 приводит к фосфорилированию FOXO1, обеспечивая путь, с помощью которого этот негативный регулятор эффекторной функции и развития NK-клеток может быть инактивирован.CD226, по-видимому, является первичным активирующим рецептором, ответственным за фосфорилирование FOXO1, при отсутствии либо CD226 на эффекторных клетках, либо лигандов CD226 на клетках-стимуляторах, серьезно снижающих фосфорилирование FOXO1. Кроме того, вмешательство во взаимодействие эффектор-мишень CD226 / CD155 с mAb против CD226 предотвращает инактивацию FOXO1, которая приводит к субоптимальной цитотоксичности NK-клеток против опухолевых мишеней. Роль CD226 в активации NK-клеток была тщательно изучена, но механизм, с помощью которого этот важный рецептор активации регулирует эффекторную функцию NK-клеток, оставался неуловимым.В этом исследовании установлена ​​прямая связь между передачей сигналов CD226 и регуляцией фактора транскрипции FOXO1, обеспечивая путь, с помощью которого CD226 независимо опосредует цитотоксическую активность против клеток-мишеней. Используя системы in vitro, мы демонстрируем, что взаимодействие CD226 с его родственными лигандами CD155 и / или CD112 необходимо для оптимальной эффективности цитотоксичности LAK-клеток мыши. Генетическое устранение экспрессии CD226 или блокада антителом CD226 нарушает гибель клеток-мишеней. Что еще более важно, взаимодействия эффектор-мишень показали, что фосфорилирование FOXO1 является конечным следствием передачи сигналов CD226, что приводит к удалению критического негативного регулятора функции NK-клеток.

Работа in vitro сосредоточена в первую очередь на опосредованном LAK мышином распознавании и уничтожении опухолевых клеток меланомы B16F10, поскольку клетки B16F10 избирательно экспрессируют лиганды CD226 CD155 и CD112. Преимуществом штамма B16F10 является отсутствие поверхностной экспрессии ICAM-1 (лиганд для LFA-1), RAE-1, MULT-1 и H-2K ^b (лиганды для NKG2D), CD48 (лиганд для 2B4), CD70 (лиганд для CD27) и CD80 (лиганд для CD28), что позволяет изучать CD226 в относительной изоляции от других известных активирующих рецепторов (18–20).Эта система также использовалась другими: недавнее исследование показало, что CD226 ^— IL-2-активированные NK-клетки мыши обладают нарушенной способностью формировать длительные стабильные контакты с клетками B16F10, что способствовало их пониженной способности к устранить эту опухоль как in vitro, так и in vivo (19). Хотя клетки B16F10 лишены многих активирующих лигандов рецепторов, некоторая степень уничтожения мишеней B16.DKO наблюдалась даже с клетками WT LAK, а также с клетками CD226-KO LAK. Клетки B16F10 действительно экспрессируют лиганды для рецептора естественной цитотоксичности NKp46 (18), что может объяснять некоторую не-CD226-опосредованную цитотоксичность (34).Поскольку наша экспериментальная система позволяла специфический опрос только передачи сигналов CD226, это не исключает возможности того, что другие активирующие рецепторы, такие как NKG2D, могут аналогичным образом фосфорилировать FOXO1. Ограничен ли этот путь CD226 или является общим для активирующих рецепторов, еще предстоит определить.

FOXO1 принадлежит к семейству факторов транскрипции FOXO и наиболее высоко экспрессируется в В-клетках и Т-клетках в дополнение к NK-клеткам (24). Экспрессия фактора транскрипции FOXO1 не определяет клеточную функциональность или состояние дифференцировки; скорее, это позволяет увеличить клеточный потенциал.Инактивация FOXO1 происходит в результате его фосфорилирования в ядре с последующей транслокацией в цитоплазму, где он убиквитинируется, а затем деградирует (23). Примечательно, что фосфорилирование FOXO1 было обнаружено только в условиях, в которых специфически задействован CD226. Фосфорилирование FOXO1 не наблюдалось, когда клетки LAK были дефицитными по CD226 или когда взаимодействия CD226-CD155 блокировались с помощью Ab, или когда клетки-мишени не имели лигандов CD226. В то время как клетки LAK с дефицитом CD226 могут экспрессировать CD96, который также связывается с CD155 (11), FOXO1 не фосфорилируется в значительной степени, когда клетки LAK с дефицитом CD226 находятся в контакте с клетками B16F10.TIGIT — это ингибирующий рецептор, который также распознает CD155 и CD112 (9, 10). Однако клетки LAK с дефицитом WT и CD226 не экспрессировали TIGIT, что исключает любой возможный вклад передачи сигналов TIGIT в фосфорилирование FOXO1.

TIGIT и CD96 обладают более высоким сродством к CD155 и могут превосходить CD226 по связыванию (9). Кроме того, было показано, что TIGIT взаимодействует с CD226 в цис-, нарушая гомодимеризацию CD226 (35). В условиях опухоли было обнаружено, что экспрессия TIGIT связана с истощением инфильтрирующих опухоль NK-клеток, а блокада TIGIT напрямую обращает истощение NK-клеток независимым от Т-клеток образом (36).Блокада TIGIT может также усиливать хелперную функцию NK-клеток в отношении Т-клеточного иммунитета против CD8 ⁺ . Было показано, что как лечение mAb против CD226, так и истощение NK-клеток снижает терапевтический эффект комбинированной терапии антителами против TIGIT и PD-L1 (35, 36). Точно так же mAb против CD96, независимо от того, блокируют ли они взаимодействие с CD155, могут подавлять образование метастазов зависимым от NK-клеток способом, который требует CD226 (37). Наши результаты предполагают, что эффекты блокады TIGIT или лечения CD96 mAb могут быть связаны с инактивацией негативного регулятора NK-клеток FOXO1, опосредованного CD226, либо за счет образования рецептора CD226, либо за счет удаления первичного конкурента связывания CD226 с его лигандами, тем самым обеспечивая механизм, с помощью которого CD226 может усиливать эффекторную функцию и предотвращать истощение.

Специфичность инактивации FOXO1 посредством передачи сигналов CD226 может позволить CD226 модулировать функцию NK-клеток независимым образом, позволяя этому единственному рецептору преодолевать ключевые контрольные точки ингибирования. В дополнение к контрольным точкам SLP-76 и NF-κB для активации NK-клеток, которые требуют передачи сигналов через несколько активирующих рецепторов (38⇓⇓ – 41), недавно было сообщено, что GSK-3β также действует как негативный регулятор множественных активирующих сигналов. (32). GSK-3β конститутивно активен в покоящихся клетках, но ингибируется после клеточной стимуляции посредством фосфорилирования Ser9, опосредованного PI3K / AKT или MEK / ERK; он служит точкой схождения различных сигнальных путей, участвующих в метаболизме, дифференцировке, пролиферации и иммунных ответах клеток (42).В NK-клетках GSK-3β является общим для активирующих рецепторов независимо от того, содержат ли они ITAM, и передача сигналов через отдельные рецепторы может индуцировать фосфорилирование GSK-3β. Однако для полного ингибирования GSK-3β требуется запуск нескольких рецепторов, таких как NKG2D и 2B4 (32). Наши данные подтверждают мнение, что GSK-3β может модулироваться посредством ряда различных рецепторов, поскольку фосфорилирование GSK-3β очевидно независимо от того, экспрессируется ли CD226 в передаче сигналов между клетками. Таким образом, CD226, по-видимому, однозначно ответственен за инактивацию FOXO1, что отличает CD226 от парадигмы, в которой требуется задействование множества активирующих рецепторов для преодоления ингибирующих контрольных точек в NK-клетках.

Сообщалось, что FOXO1 является отрицательным регулятором функции NK-клеток, противодействуя функции положительного регулятора TBET (22). Мы обнаружили, что экспрессия TBET снижена в CD226-дефицитных опухолевых NK-клетках, что согласуется с мнением о том, что передача сигнала CD226 необходима для инактивации FOXO1, тем самым высвобождая супрессию TBET. Точно так же уровень экспрессии Klf2 и Runx3 ниже в CD226-дефицитных опухолевых NK-клетках. KLF2 является ключевым фактором транскрипции для размножения и выживания NK-клеток (43), а RUNX3 важен для чувствительности NK-клеток к IL-15 (44), что указывает на то, что FOXO1 является потенциальным негативным регулятором многих важных факторов транскрипции NK-клеток.TCF7 является фактором транскрипции, важным для памяти Т-клеток CD8 ⁺ , и сообщалось, что дефицит FOXO1 предотвращает экспрессию TCF7 (45), что позволяет предположить, что передача сигналов CD226 также может играть роль в генерации памяти NK-клеток, как это было ранее. вовлечены в контекст вирусной инфекции (46). Наши данные также показывают, что дефицит CD226 влияет на регулируемые FOXO1 гены, участвующие в апоптозе / выживании, клеточном цикле и перемещении, что может полностью или частично способствовать относительной малочисленности NK-клеток в опухолях мышей с дефицитом CD226.Таким образом, CD226 является не просто медиатором цитотоксичности эффекторных клеток, но может участвовать практически во всех аспектах биологии NK-клеток.

Эффекты CD226 в значительной степени ограничивались опухолевыми NK-клетками. Большое количество дифференциально экспрессируемых генов было обнаружено между опухолевыми NK-клетками WT и CD226-KO, в отличие от NK-клеток селезенки, в которых практически не наблюдали генных различий. Возможно, что в селезенке мириады сигналов, принимаемых как ингибирующими, так и активирующими рецепторами, включая CD226, могут удерживать покоящиеся NK-клетки в состоянии готовности к ответу, тогда как опухолевые NK-клетки, по-видимому, находятся в эффекторном состоянии, а CD226 усиливает эффекторный статус.Дифференциальная экспрессия генов, наблюдаемая между опухолевыми NK-клетками WT и CD226-KO, отражает важность CD226 как активирующего рецептора. В опухолевой среде CD226 может подвергаться воздействию более высоких уровней CD155 и / или CD112, экспрессируемых на опухолевых клетках, чем те, которые встречаются в нормальных тканях, вызывая опосредованную CD226 инактивацию FOXO1.

Роль CD226-опосредованной регуляции FOXO1 в инфильтрирующих опухоль CD8 ⁺ Т-клетках также была очевидна, хотя функциональные последствия могут быть более тонкими, чем наблюдаемые для NK-клеток.В то время как как WT, так и CD226-дефицитные Т-клетки CD8 ⁺ проявляли эффекторный фенотип в опухолях, экспрессия эффекторных генов отличительных признаков, а также продукция эффекторных молекул, таких как гранзим B и IFN-γ, были более выражены, когда CD226-FOXO1 сигнальный путь не был нарушен. Интересно, что путь CD226-FOXO1 влияет на экспрессию ключевых факторов транскрипции, участвующих в дифференцировке памяти. TBET репрессируется FOXO1 с инактивацией FOXO1, необходимой для дифференцировки эффекторных клеток (47).Активация CD226 приводит к фосфорилированию FOXO1, тем самым позволяя TBET осуществлять контроль над эффекторными механизмами. Напротив, EOMES и TCF7, два фактора транскрипции, участвующие в установлении Т-клеточной памяти, напрямую нацелены на FOXO1, тем самым обеспечивая FOXO1 средство воздействия на континуум от эффектора к памяти, смещая Т-клетки CD8 ⁺ в сторону программирования памяти ( 48, 49). Передача сигналов CD226 снижает активный FOXO1 с предполагаемым эффектом нарушения способности дифференцировки клеток памяти.Влияние CD226 на генерацию Т-клеток памяти CD8 ⁺ в условиях опухоли еще предстоит изучить и может быть лучше выяснено на моделях вирусной инфекции.

Дальнейшие исследования определят, применимы ли наши результаты к человеческим NK-клеткам. Хотя NK-клетки мыши и человека имеют схожие функции и некоторые пути развития, существуют различия, особенно с точки зрения фенотипа. Почти все NK-клетки периферической крови человека экспрессируют CD226 по сравнению с примерно 50–80% NK-клеток селезенки мыши.В контексте рака человека воздействие CD155 может подавлять экспрессию CD226 на NK-клетках, инфильтрирующих опухоль (50). Еще предстоит выяснить, связаны ли потеря экспрессии CD226 и сопутствующее нарушение функции NK-клеток в опухолях человека с активностью FOXO1.

В целом, наши результаты демонстрируют, что участие CD226 в NK-клетках мыши запускает инактивацию FOXO1, ключевого фактора транскрипции, участвующего в негативной регуляции NK-клеток. Экспериментальная система, использованная в этих исследованиях, демонстрирует, что регуляция FOXO1 независимо опосредуется CD226 без синергизма, обеспечиваемого другими активирующими рецепторами, такими как 2B4, подтверждая важность CD226 для полной эффекторной функции NK-клеток и идентифицируя CD226 как ключевой регулятор разнообразных клеточных пути в NK-клетках.Важно отметить, что мы определили механизм, с помощью которого CD226 оказывает сильное влияние на NK-клетки, отвечающие против опухолей. Наши результаты дают обоснование для запуска передачи сигнала CD226, возможно, через агонистическое антитело, как средства обеспечения повышенной противоопухолевой активности NK-клеток, которая может быть терапевтически полезной.

Методы

Генерация мышей

Cd226 -KO.

Конструкция, использованная для создания аллеля C57BL / 6N Cd226 -KO в ES-клетках, была получена с использованием комбинации методов рекомбинации и стандартных методов молекулярного клонирования.В частности, мы использовали подход CoSBR, как описано ранее (51), для создания вектора таргетинга с условным нокаутом. В полученном векторе плечо 5′-гомологии длиной 2,431 п.н. соответствует GRCm38 / mm10 chr18: 89,203,889–89,206,319, а плечо 3′-гомологии из 2535 п.н. соответствует chr18: 89,207,509–89,210,043. Область длиной 1,189 п.н., фланкированная сайтами loxP (экзоны 2 и 3), соответствует chr18: 89,206,320–89,207,508. Конечный вектор подтверждали секвенированием ДНК, линеаризовали и использовали для нацеливания на ES-клетки C2 (C57BL / 6N) с использованием стандартных методов (G418-положительный и ганцикловир-отрицательный отбор).Положительные клоны идентифицировали с помощью ПЦР с дальним диапазоном с последующим подтверждением последовательности. Затем правильно нацеленные ES-клетки инфицировали Adeno-Cre для удаления флоксованного экзона и получения клонов с аллелем Cd226 exon2-3 – KO. Затем нокаутные ES-клетки инъецировали в бластоцисты, и передачу по зародышевой линии получали после скрещивания с самками C57BL / 6N, в результате чего получали химеры. Подход CRISPR (52) был использован для создания мышей с дефицитом CD226 на фоне BALB / cAnN. Используемая однонаправляющая РНК представляет собой 5′-GCTATTCTTCATGTGCACAA-3 ‘(расположенный на 3’-конце экзона 2 Cd226 ), а аллель KO представляет собой делецию 6 п.н. в сочетании с 2-п.н. (CA ) вставка: GCTATTCTTCATGTGC-CA — gtaaagc, что приводит к сдвигу рамки и преждевременному стоп-кодону в экзоне 3.Комплексное иммунофенотипирование не выявило каких-либо серьезных аномалий в NK-клетках, Т-клетках или миелоидных компартментах в селезенке или других различных лимфоидных органах, что согласуется с мышами CD226-KO, описанными другими (53).

Всех мышей содержали в Genentech в соответствии с рекомендациями Американской ассоциации по уходу за лабораторными животными. Все экспериментальные исследования на животных проводились с одобрения институциональных комитетов по уходу и использованию животных Genentech Lab Animal Research и проводились в учреждении, аккредитованном Ассоциацией по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными.

Сотовые линии.

Клеточные линии B16-F10 и CT26 (полученные от внешних поставщиков, таких как ATCC) содержались в специализированном помещении для внутренних линий клеток и тестировались на отсутствие микоплазм. Клетки CT26 культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и 100 ед. / Мл пенициллина / 100 мкг / мл стрептомицина. Клетки B16-F10 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS и 100 ед. / Мл пенициллина / 100 мкг / мл стрептомицина. Обе клеточные линии выращивали в увлажненном при 37 ° C инкубаторе с 5% CO ₂ .Нокаут экспрессии CD155 и CD112 в клетках B16-F10 выполняли путем котрансфекции плазмидами, содержащими направляющие РНК, нацеленные на Cd155 или Cd112 , и Cas9 (Integrated DNA Technologies) с использованием липофектамина LTX с реагентом PLUS (Life Technologies) в Opti- МЕМ (Life Technologies). Клетки были размножены в течение 4 дней, а затем были отсортированы по одной клетке на двойные отрицательные клетки CD155 / CD112 для создания линии двойного нокаута B16-F10 CD155 / CD112 (называемой здесь «B16.DKO»).

Антитела и рекомбинантные белки.

Клон 37F6 mAb против CD226, используемый для исследований опухолей in vivo и исследований цитотоксичности in vitro, был описан ранее (35). Следующие Abs использовали для окрашивания клеток B16-F10 методом проточной цитометрии: Alexa-Fluor 488-мышиный Nectin-2 / CD112 (829038; R&D Systems) и APC-мышиный CD155 (TX56; BioLegend). Следующие Abs использовали для окрашивания и сортировки иммунных клеток мышей методом проточной цитометрии: PE-DX5 (BD Biosciences), PerCP-Cy5.5 CD226 (10E5; BioLegend), PE-Cy-7 TIGIT (GIGD7; eBioscience), BV421 CD96. (6A6; BD Biosciences), PE-Cy7 CD8a (53-6.7; eBioscience), Alexa-Fluor 700 CD8a (RPA-T8; BD Biosciences), BV650 CD4 (RM4-5; BioLegend), BV711-NKp46 (29A1.4; BioLegend), BV785-CD3 (145-2C11; BD Biosciences), BUV395 CD45 (30-F11; BD Biosciences) и краситель для фиксации жизнеспособности eFluor780 (eBioscience). Мышиный CD155.Fc для блокирования был описан ранее (35).

Проточная цитометрия и сортировка клеток.

Проточная цитометрия выполнялась с использованием стандартных протоколов. Для окрашивания иммунных клеток из опухолей суспензии единичных клеток готовили осторожным механическим разрушением ткани сначала измельчением с последующей диссоциацией с использованием мягкого диссоциатора MACS (Miltenyi Biotec) и расщепления 2 мг / мл коллагеназы D (Roche) и 40 ед. мл ДНКазы (Roche).Суспензии одноклеточных клеток селезенки и дренирующих лимфатических узлов получали механическим расщеплением путем измельчения между двумя концами замороженных предметных стекол в холодном PBS с добавлением 2% FBS. Все образцы собирали на приборах LSR-II, LSR-Fortessa или BD Symphony (BD Biosciences) и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo v9.4.4 (Tree Star, Inc.). Сортировку клеток проводили с использованием инструментов FACS Aria или FACS Aria Fusion (BD Biosciences).

Выделение NK-клеток и создание эффекторных клеток.

NK-клетки

выделяли из селезенки мышей WT с использованием набора для выделения NK-клеток EasySep Mouse (STEMCELL Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. NK-клетки культивировали в полной среде RPMI (RPMI 1640 с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 2 мкМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ пирувата натрия, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) с добавлением 1000 мкг / мл. Ед / мл рекомбинантного мышиного IL-2 (Akron Biotech) в инкубаторе с влажностью 37 ° C и 5% CO ₂ . NK-клетки, созданные таким образом, называются «NK-клетками IL-2».Альтернативно, объемные клетки селезенки культивировали в полной среде RPMI с добавлением 1000 Ед / мл рекомбинантного мышиного IL-2 в течение 4 дней. Неприкрепленные клетки осторожно удаляли и добавляли свежую среду, содержащую IL-2, еще на 3 дня для образования клеток LAK.

Тесты цитотоксичности in vitro.

Электронное зондирование клеток в реальном времени с использованием системы xCELLigence RTCA MP (ACEA Biosciences) было выполнено для оценки цитотоксичности. Клетки-мишени A-427, B16-F10 или B16.DKO (0,5–1 × 10 ⁵ в 100 мкл полной среды RPMI) высевали в 96-луночный E-планшет и культивировали в течение 4–16 ч в среде xCELLigence. система установлена ​​в инкубаторе 37 ° C, 5% CO ₂ .Оптимальные условия засева были установлены путем мониторинга индекса клеток (CI), значения, непосредственно отражающего силу адгезии клеток и количество клеток, измеренное по значениям электрического импеданса на массиве электродов высокой плотности, покрывающих дно каждой лунки E-планшета. . После того, как клеткам-мишеням дали возможность прилипнуть и CI стабилизировался в линейном диапазоне, 5 × 10 ⁵ эффекторных клеток в 100 мкл полной среды RPMI были добавлены в соответствующие лунки. Для блокады Ab клетки LAK предварительно инкубировали с клоном 37F6 mAb против CD226 или с изотипическим контролем в течение 30 минут на льду перед добавлением в E-планшет.Ab присутствовал на протяжении всего теста на умерщвление. Для исследований ингибитора FOXO1 клетки LAK предварительно инкубировали с ингибитором FOXO1 (Calbiochem) в течение 30 минут при 37 ° C перед добавлением в E-планшет. Лунки с клетками-мишенями без эффекторных клеток служили отрицательным контролем. После добавления эффекторных клеток CI измеряли каждые 10 мин в реальном времени. ДИ в каждый момент времени нормализовали по отношению к ДИ во время добавления клеток LAK, а цитотоксичность рассчитывали как% цитолиза = (нормализованный ДИ _{, № эффектор} — нормализованный ДИ _{эффектор} ) / нормализованный ДИ _{№ эффектор} × 100.

Вестерн-блоттинг.

Клетки-мишени B16-F10 или B16.DKO использовали для стимуляции эффекторных клеток. Сливающиеся слои клеток-мишеней помещали в шестилуночные планшеты, среду удаляли и клетки дважды промывали PBS. Эффекторные клетки собирали, дважды промывали, а затем инкубировали в бессывороточной среде в течение 2 ч перед стимуляцией. Эффекторные клетки (5 × 10 ⁶ в объеме 1 мл бессывороточной среды) осторожно добавляли в лунки, содержащие клетки-мишени, и инкубировали при 37 ° C в течение 2, 10 или 30 мин.Эффекторные клетки осторожно собирали, чтобы избежать загрязнения прилипшими клетками-мишенями, центрифугировали и осаждали, промывали ледяным PBS, затем лизировали в буфере RIPA (EMD Millipore) с добавлением смеси ингибиторов фосфатазы (Roche) и полной смеси ингибиторов протеазы (Roche). Лизаты очищали от нерастворимых материалов центрифугированием. Концентрацию белка измеряли с использованием анализа бицинхониновой кислоты. Десять микрограммов общего белка ресуспендировали в уменьшенном буфере для образцов и подвергали электрофорезу в 4–12% геле Бис-Трис.Для субклеточного фракционирования ядерные и цитоплазматические фракции получали с использованием реагентов NE-PER для ядерной и цитоплазматической экстракции (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, 5 × 10 ⁶ клеток инкубировали в 50 мкл цитоплазматического буфера для экстракции (Thermo Scientific) над льдом в течение 3 мин; затем препарат центрифугировали при 20,800 × г в течение 4 мин для выделения цитоплазматических белков. Ядерные белки выделяли, добавляя к осадкам 50 мкл буфера для ядерной экстракции (Thermo Scientific).Равные количества белка загружали в каждую дорожку, разделяли на 4–12% геле Bis-Tris NuPAGE (Invitrogen), а затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Вестерн-блоттинг выполняли со специфическими антителами к pAKT Ser473 [каталожный № 4048; Cell Signaling Technology (CST)], AKT (№ 9722; CST), p-FOXO1 (Thr24) / FOXO3a (Thr32) / FOXO4 (Thr28) (№ 2599; CST), FOXO1 (№ 2880; CST), FOXO3 (№ 2497; CST), pSGK1 Ser78 (№ 5599; CST), SGK1 (№ 12103; CST), pGSK-3α / β Ser21 / 9 (№8566; CST), GSK-3β (№ 12456; CST). Блоты визуализировали с использованием хемилюминесцентного субстрата (Pierce ECL Plus; Thermo).

Модель опухоли CT26, анализ РНК-Seq и биоинформатика.

клеток CT26 (1 × 10 ⁵ ) подкожно. вводили сопоставимым по возрасту самкам мышей WT и CD226-KO BALB / c в возрасте 6-8 недель. Через 21 день после инокуляции опухоли мышей умерщвляли и объединяли в три группы по четыре человека для каждого генотипа. Объемы опухолей измеряли и рассчитывали дважды в неделю с использованием модифицированной формулы эллипсоида: 1/2 × (длина × ширина ² ).Животных с опухолями размером более 2000 мм ³ или с изъязвлениями умерщвляли, если они были очевидны до 21 дня. Селезенки и дренирующие лимфатические узлы диссоциировали на суспензии отдельных клеток, а эритроциты лизировали с использованием буфера для лизиса ACK. Опухоли измельчали, а затем диссоциировали с использованием диссоциатора мягкого действия MACS (Miltenyi Biotec) в присутствии буфера для переваривания, состоящего из 2 мг / мл коллагеназы D (Roche) и 40 ед / мл ДНКазы (Roche).

NK-клетки

, Т-клетки CD4 ⁺ и Т-клетки CD8 ⁺ (1 × 10 ⁵ ) были отсортированы из каждого объединенного образца селезенки, лимфатического узла и опухоли.РНК экстрагировали с помощью набора RNeasy Micro Kit (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Профили экспрессии генов с помощью RNA-seq проводили с использованием трех пулов WT и трех пулов образцов KO для каждого типа клеток и типа ткани. Контроль качества каждого образца был определен для обеспечения количества и качества РНК перед обработкой для RNA-seq. Целостность РНК определяли с помощью биоанализатора Agilent 2100 (Agilent Genomics), а концентрацию определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop 8000 (Thermo Scientific).Один микрограмм общей РНК использовали в качестве исходного материала для подготовки библиотеки с использованием набора TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2 (Illumina). Размер библиотек подтверждали с помощью анализатора фрагментов (Advanced Analytical Technologies), а концентрации определяли с помощью набора для количественного определения библиотек (KAPA). Библиотеки были мультиплексированы, а затем секвенированы на секвенаторе Illumina HiSeq 2500 (Illumina), генерируя около 25 миллионов уникальных считываний карт на образец. Считывания были сопоставлены с геномом мыши mm9 с помощью GSNAP (research-pub.gene.com/gmap/).

Дифференциальный анализ экспрессии проводили с использованием методологии voom-limma. Данные подсчета на уровне гена обрабатывались в R с использованием пакета limma. Применялась линейная модель, содержащая термины для типа ткани (опухоль, селезенка, лимфатический узел), а также взаимодействия между типом ткани и типом клеток (NK-клетки, CD8 ⁺ Т-клетки и CD4 ⁺ Т-клетки) и между тип ткани, тип клеток и статус нокаута. Гены с низкой экспрессией были удалены, оставив только гены, которые были экспрессированы с двумя значениями на миллион или более, а отфильтрованная матрица подсчета затем была пропущена через функцию voom в limma для моделирования тенденции средней дисперсии количества считываний перед анализом дифференциальной экспрессии. .Все статистические данные, полученные на основе данных RNA-seq, представляют собой значения P с поправкой на частоту ложных открытий. Анализ генов производился с использованием пакета multiGSEA в R с использованием метода камеры. Наборы генов из коллекций MSigDB для наборов отличительных, курируемых, мотивных, генных онтологий и иммунологических генов были включены и отфильтрованы для скорректированного значения P , равного 0,05 или меньше, и по крайней мере двукратного изменения.

Статистика.

Данные анализировали с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 6 (GraphPad).Измерения между двумя группами проводились с помощью двустороннего теста Стьюдента t . Группы из трех и более человек анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим посттестом Тьюки. P Значения <0,05 считались значимыми.

Благодарности

Мы благодарим основной центр FACS Genentech за вклад в их знания и выполнение сортировки ячеек; Роберт Дж. Ньюман, Тим Соукуп и Мероне Руз-Гирма за создание нацеленного вектора Cd226 и нацеленных на ES-клетки C57BL / 6N; Основные группы лабораторных животных Genentech для микроинъекций, ухода за животными и поддержки генотипирования; Зора Модрусан в лаборатории микрочипов для проведения анализа RNA-seq; и Роберта Бургона за вклад в биоинформатический анализ.

Сноски

• Авторы: J.S., R.C., J.L.G. и E.Y.C. спланированное исследование; X.D., P.d.A., N.M., D.d.A.N., K.H.B., V.A., S.M., V.J. и E.Y.C. проведенное исследование; K.R.A. и С. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; Т.Д.У. и E.Y.C. проанализированные данные; и J.L.G. и E.Y.C. написал газету.

• Заявление о конфликте интересов: Все авторы являются сотрудниками Genentech, члена группы Roche, которая разрабатывает и продает лекарства с целью получения прибыли.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1814052115/-/DCSupplemental.

• Авторские права © 2018 Автор (ы). Опубликовано PNAS.

Последствия для метастатического каскада

Abstract

Уклонение опухолевых клеток от иммунитета является основным признаком успешного метастазирования. Опухолевые клетки в сосудистой сети принимают покров из тромбоцитов, который эффективно подавляет врожденную иммунную систему, напрямую подавляя естественные клетки-киллеры (NK), которые обычно действуют для нейтрализации распространения рака.Здесь мы описываем два новых механизма уклонения опухолевых клеток от противоопухолевых функций NK-клеток. Первый — это механизм «иммунной ловушки», при котором тромбоциты индуцируют высвобождение растворимых лигандов NKG2D из опухолевой клетки для маскировки обнаружения и одновременно активно подавляют дегрануляцию NK-клеток и выработку воспалительных цитокинов (IFNγ). Это представляет собой двойной удар по иммунному очищению от злокачественных клеток во время метастазирования. Второй механизм, опосредованное TGFβ тромбоцитами подавление оси CD226 / CD96-CD112 / CD155, представляет собой новый путь с плохо изученными противораковыми функциями.Мы продемонстрировали, что тромбоциты надежно подавляют поверхностную экспрессию CD226 и CD96 на поверхности NK-клеток и связанных с ними лигандов на опухолевой клетке, чтобы дополнительно усилить подавление NK-клеток. Эти высокоразвитые механизмы способствуют успешному уклонению опухоли от иммунитета во время метастазирования и предоставляют уникальную возможность для изучения сложности клеточных взаимодействий в метастатическом каскаде и, таким образом, новых мишеней для иммунотерапии рака.

Образец цитирования: Cluxton CD, Spillane C, O’Toole SA, Sheils O, Gardiner CM, O’Leary JJ (2019) Подавление противоопухолевых каскадов естественных клеток-киллеров NKG2D и CD226 с помощью раковых клеток, покрытых тромбоцитами: последствия для метастатический каскад.PLoS ONE 14 (3): e0211538. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211538

Редактор: Сальваторе В. Пиццо, Медицинский факультет Университета Дьюка, США

Поступила: 13 августа 2018 г .; Принята к печати: 16 января 2019 г .; Опубликовано: 25 марта 2019 г.

Авторские права: © 2019 Cluxton et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта работа финансировалась SFI (SFI CSET [10 / CE / B1821]; JOL получил эту награду; www.sfi.ie), Friends of the Coombe (грант Friends of the Coombe — номер гранта не указан; JOL; http://www.friendsofthecoombe.ie) и Фонд Эмер Кейси (гранд Фонда Эмер Кейси — номер гранта отсутствует; JOL; http://www.emercaseyfoundation.com). В проекте не участвовали коммерческие компании.Авторы не получали зарплату. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Рак является ведущей причиной смерти в развитом мире, уступая только сердечно-сосудистым заболеваниям [1]. Более 90% всех смертей, связанных с раком, вызваны метастазами [1], и, в более широком смысле, метастазирующий рак является неизлечимым заболеванием.Первичные опухолевые клетки, которые проникают в периферическое кровообращение, называются циркулирующими опухолевыми клетками (ЦКО). ЦКО представляют собой многообещающую мишень для противоопухолевого скрининга и лечения. Однако для эффективного обнаружения и нацеливания на ЦОК необходимо более глубокое понимание их биологии, особенно в том, что касается их уклонения от иммунной системы. Таким образом, наше исследование пытается понять биологию ЦОК путем изучения того, как тромбоциты функционируют, чтобы способствовать их уклонению от иммунной системы, с использованием in vitro моделей установленных линий опухолевых клеток и естественных клеток-киллеров.

В обращении раковые клетки должны преодолевать физиологические барьеры. Раковые клетки подвергаются механическому сдвиговому напряжению, иммунологическому контролю со стороны иммунных клеток в периферическом кровообращении и клеточных контрольных точках на предмет апоптоза и старения. Один из механизмов, с помощью которого они преодолевают эти проблемы, — это внедрение тромбоцитов на их клеточные поверхности [2]. Раковые клетки связываются с тромбоцитами за счет связывания GPIIb-IIIa-фибриногена и активируют P-селектин на активированных тромбоцитах [3].Это вызывает каскад активации тромбоцитов, в результате чего образуются кластеры раковые клетки-тромбоциты, которые защищают раковые клетки от механического и биологического клиренса [4]. Однако сложные молекулярные процессы защиты до конца не изучены. Считается, что эта защита частично обеспечивается физическим барьером тромбоцитарной оболочки, поскольку многие противоопухолевые действия требуют прямого контакта между иммунной клеткой и раковой клеткой-мишенью [5]. Однако недавние данные показывают, что активированные тромбоциты могут передавать свой главный комплекс гистосовместимости (MHC) класса I раковым клеткам посредством трогоцитоза, что позволяет раковой клетке избегать иммунного обнаружения посредством вновь приобретенного «собственного» сигнала [6].Более того, раковые клетки активируют тромбоциты, вызывая дегрануляцию и высвобождение множества иммуномодуляторов, включая мощные иммуносупрессивные цитокины, такие как трансформирующий фактор роста β (TGFβ) [7].

Природные киллеры (NK) — это иммунные клетки, которые лизируют опухолевые клетки без предварительной сенсибилизации [8]. Они играют важную роль в иммунном надзоре за опухолями, распознавая и устраняя злокачественные клетки, тем самым предотвращая как локальное прогрессирование опухоли, так и метастатическое распространение [8].Реактивность NK-клеток регулируется принципами «пропавшего себя» и «индуцированного себя», которые утверждают, что клетки с низкой или отсутствующей экспрессией MHC класса I (отсутствующее «я») и / или вызванной стрессом экспрессией лигандов для активации Рецепторы NK (индуцированные самими) преимущественно распознаются и устраняются [9]. Эти функции NK-клеток сложны и регулируются рядом активирующих и ингибирующих рецепторов, экспрессируемых на поверхности NK-клеток [9], и именно баланс активирующих и ингибирующих сигналов, опосредованных этими рецепторами, определяет, будут ли продолжаться ответы NK-клеток.В контексте наблюдения и очистки раковых клеток, группа естественных киллеров 2, член D (NKG2D), CD226 (DNAM-1) и CD96 (TACTILE) связываются с лигандами клеточного стресса, часто сверхэкспрессируемыми на злокачественно трансформированных клетках [9]. В ответ NK-клетки дегранулируют и продуцируют провоспалительные цитокины, чтобы стимулировать инклюзивный иммунный ответ на транзитные опухолевые клетки [10].

В этом исследовании мы сообщаем, что тромбоцитарная маскировка опухолевых клеток способствует потере лигандов NKG2D, MICA и MICB, с поверхности опухолевых клеток, вызывая их секрецию в микроокружение опухоли, где они подавляют экспрессию рецептора NKG2D на NK-клетках.Это представляет собой сложный механизм двойного удара для опосредованного тромбоцитами уклонения опухолевых клеток от иммунной защиты и раскрывает важную терапевтическую мишень для нарушения функций раковых клеток во время метастазирования. Кроме того, мы описываем новый механизм тромбоцитов и их растворимых молекул, подавляющих рецепторы и лиганды оси CD226 / CD96-CD155 / CD112, дополнительно подавляя функции NK-клеток и способствуя выживанию опухолевых клеток. Это представляет собой мощный механизм уклонения от иммунитета при раке.Поэтому мы предполагаем, что лучшее понимание молекулярной основы уклонения NK-клеток от иммунитета опухолевыми клетками в кровотоке позволит разработать будущие терапевтические средства, направленные на метастатический каскад у пациентов с поздней стадией заболевания.

Материалы и методы

Заявление о соблюдении этических норм

Набор доноров крови для этого исследования был одобрен Школой биохимии и иммунологии, REC уровня 1 в Тринити-колледже Дублина, и письменное информированное согласие было получено от всех доноров до проведения флеботомии.Кроме того, все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими инструкциями и правилами.

Реагенты

Anti-CD3-PerCP, CD56-PE, CD107a-FITC и CD42B-APC, включая их контрольные IgG, были получены от BD Pharmingen (Сан-Диего, Калифорния). Анти-IFNgamma-PE-Cy7, NKG2D-APC были получены от eBioscience (Сан-Диего, Калифорния). Анти-MICA (AMO1) и MICB (BMO2) были получены от BAMOMAB (Германия). Антимышиный alexa-fluor-488 был получен от Life Technologies (Калифорния, США).Анти-CD226-FITC, анти-CD96-PE, анти-CD155-FITC и анти-CD112-APC были получены от Biolegend (Калифорния, США). Нейтрализующие антитела к TGF-β-1 и рекомбинантный TGF-β-1 были получены от R&D systems (Миннесота, США). Рекомбинантные MICA и MICB были получены от R&D systems (Миннесота, США). Рекомбинантный человеческий белок Fc IgG1, CF от R&D systems (Миннесота, США). Пептид, активируемый рецептором тромбина (TRAP), был получен от Sigma-Aldrich (США).

Клеточные линии

Клетки яичников 59M и SKOV3 и клетки меланомы SK-Mel-28 использовали в качестве модельной системы и культивировали, как описано ранее [11, 12].Контрольные клетки K562 были созданы и культивированы, как описано ранее [13].

Препарат мононуклеарных клеток периферической крови

Для каждого эксперимента использовали мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) от здоровых доноров. Каждая экспериментальная копия является представителем разных доноров. PBMC были выделены из периферической крови. Вкратце, цельную кровь наслаивали на LymphoPrep (Axis-Shield) и центрифугировали при 600 x g в течение 30 минут. PBMC, которые образовывали слой лейкоцитов, отбирали и промывали PBS.Эритроциты удаляли путем инкубации клеток в буфере для лизиса эритроцитов (Life Technologies) в течение 5 минут при комнатной температуре и снова промывали PBS. Промытые РВМС подсчитывали и высевали в соответствии со спецификациями каждого анализа.

Приготовление промытых тромбоцитов

Тромбоциты были пожертвованы здоровыми донорами. Каждая экспериментальная копия представляет отдельного здорового донора. Кровь собирали у доноров путем венепункции через иглу-бабочка калибра 19 без жгута, чтобы избежать активации тромбоцитов.Тромбоциты получали, как описано ранее [11].

Маскировка тромбоцитов

Анализ адгезии тромбоцитов выполняли, как описано ранее [11]. Вкратце, промытые тромбоциты совместно инкубировали с опухолевыми клетками в соотношении 1000: 1 в среде RPMI при комнатной температуре и осторожном покачивании в течение 1 часа для получения опухолевых клеток, покрытых тромбоцитами. Для устранения растворимых факторов скрытые опухолевые клетки промывали (3 раза) PBS и инкубировали совместно с PMBC. Для получения растворимого рилизата опухолевых клеток, покрытых тромбоцитами, скрытые опухолевые клетки центрифугировали при 1000g в течение 5 минут, и супернатанты использовали с PBMC для функционального анализа.

Окрашивание молекул клеточной поверхности для проточного цитометрического анализа

NK-клетки инкубировали с оптимальными концентрациями следующих антител против человека: CD56-PE, CD3-PerCP, NKG2D-APC, CD226-FITC, CD96-PE или соответствующих контрольных антител изотипа (все от BD Pharmingen) в 100 мкл. 1% FCS / PBS при 4 ° C в течение 20 мин.

Опухолевые клетки с тромбоцитами и без них инкубировали с античеловеческими MICA, неконъюгированными антителами MICB и вторичным антителом alexa-fluor-488.Окрашивание опухолевых клеток с использованием первичных и вторичных антител проводили в течение 1 часа при 4 ° C. Опухолевые клетки также окрашивали антителами CD112-APC и CD155-FITC и изотипическими контролями в 100 мкл 1% FCS / PBS при 4 ° C в течение 20 мин.

Клетки дважды промывали PBS и собирали на проточном цитометре Cyan (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). События сохранялись и анализировались с помощью программного обеспечения FlowJo (TreeStar). NK-клетки были выделены из популяций PBMC как отдельные клетки CD3-CD56 + (S1 фиг.).

Окрашивание CD107a

Всего 1 × 10 ⁶ PBMC стимулировали 500U hrIL-2 в течение 18 ч в 96-луночных планшетах с круглым дном.Затем добавляли свежевывешенные опухолевые клетки (2 × 10 ⁶ ) и анти-CD107a-FITC (2 мкл / лунку) или IgG1-FITC (2 мкл / лунку) в качестве контроля. Планшеты инкубировали в течение 1 ч перед добавлением GolgiStop (BD Pharmingen). Планшеты инкубировали еще 3 ч перед внеклеточным окрашиванием и проточно-цитометрическим анализом. Все инкубации проводили при 37 ° C.

Внутриклеточное окрашивание IFN-γ для проточного цитометрического анализа

Клетки

стимулировали 500U hrIL-2 в течение 18 часов, последние 4 часа в присутствии Golgi-Plug (BD Pharmingen).Клетки промывали один раз в PBS, и FcR блокировали путем инкубации с 10% сывороткой AB человека в 1% FCS / PBS. Окрашивание клеточной поверхности выполняли, как указано выше, с последующим внутриклеточным окрашиванием IFN-γ-PE-Cy7 или IgG2a / b-PE-Cy7 (оба от BD Pharmingen) в качестве контроля с использованием набора Cytofix / Cytoperm Plus (BD Pharmingen) в соответствии с инструкции производителя.

Функциональные анализы

Анализы активации

NK-клеток проводили с PBMC при соотношении PBMC к клеткам-мишеням 5: 1. PBMC давали в среднем 10% NK-клеток.Функциональные исследования проводили в присутствии и в отсутствие блокирующих антител к NKG2D, CD226 или CD96 на NK-клетках и на поверхности опухолевых клеток MICA, MICB, CD155, CD112 соответственно. Здесь клетки инкубировали в растворах 1 мкг / мл либо анти-NKG2D (клон R&D # 149810), либо анти-MICA (клон R&D # 159227), анти-MICB (клон R&D # 236511), анти-CD226 (клон BioLegend # 11A8. ), анти-CD96 (клон BioLegend # 92.39), анти-CD155 (клон BioLegend # SKII.4) и анти-CD112 (клон BioLegend # TX.31) в течение 1 часа при комнатной температуре и промывают для удаления избытка растворимого антитела.Рекомбинантные MICA и MICB использовали в конечной концентрации 10 мкг / мл в течение 30 минут с PBMC. Для каждого эксперимента использовали контроль IgG.

Рекомбинантный TGFbeta использовали для предварительной обработки PBMC в течение 1 часа при комнатной температуре перед функциональным анализом в соответствующих экспериментах.

Активированные тромбоциты получали путем инкубации промытых тромбоцитов со 125 мкг / мл пептида, активированного рецептором тромбина (TRAP), в течение 30 минут при комнатной температуре в мягких условиях покачивания. Активированные тромбоциты и их рилизат затем использовали в функциональных анализах, как указано в тексте.

ELISA

Обнаружение растворимых MICA и MICB выполняли с использованием системы разработки DuoSet ELISA от R&D Systems в соответствии с инструкциями производителя. Все концентрации выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для трех повторов.

ПЦР в реальном времени

Раковые клетки инкубировали в течение 24 часов в стандартных условиях культивирования клеток только со средой или со средой, содержащей промытые тромбоциты, с конечным соотношением раковых клеток и тромбоцитов 1: 1000. Суммарную РНК экстрагировали из образцов с использованием набора miRVana (Life Technologies, Фостер-Сити, Калифорния, США) в соответствии с протоколом производителя.Уровни экспрессии мРНК ADAM10, ADAM17, ADAM19 и GAPDH оценивали с помощью TaqMan RT-PCR. Данные были проанализированы с использованием сравнительного метода Ct; где экспрессия мРНК ADAM10, ADAM17 и ADAM19 была нормализована по отношению к экспрессии GAPDH и откалибрована по отношению к необработанным клеткам, чтобы установить относительный уровень экспрессии мРНК.

Результаты

Маскировка тромбоцитов способствует уклонению раковых клеток яичников и меланомы от противоопухолевой активности NK-клеток

Чтобы установить маскировку опухолевых клеток, линии клеток яичников 59M и SKOV3 и опухолевые клетки меланомы SK-Mel-28 инкубировали с тромбоцитами, а антиген тромбоцитов CD42b измеряли в популяциях опухолевых клеток.Клеточная линия K562, устоявшаяся клетка-мишень для NK-клеток, была выбрана в качестве положительного контроля. Антиген CD42b был обнаружен в популяциях опухолевых клеток, что указывает на эффективную маскировку тромбоцитов для каждой клеточной линии (фиг. 1A и 1B; S1 фиг.). Впоследствии мы продемонстрировали устойчивые противоопухолевые функции NK-клеток CD3-CD56 + (S1 фиг.) При заражении каждой линией опухолевых клеток, количественно определяемые по экспрессии CD107a на поверхности NK-клеток и продукции внутриклеточного IFNγ (фиг. 1C и 1D). Опухолевые клетки яичников и меланомы индуцировали сильную продукцию гамма-интерферона NK, тогда как клетки меланомы слабо индуцировали ответ CD107a (рис. 1C и 1D).Присутствие тромбоцитарной оболочки значительно снижает противоопухолевую активность NK-клеток по отношению к опухолевым клеткам яичников и меланомы (рис. 1C и 1D). Эти результаты предполагают, что тромбоцитарная маскировка опухолевых клеток сильно ингибирует эффекторные функции NK-клеток в моделях эпителиального рака in vitro .

Рис. 1. Маскировка тромбоцитов подавляет функции NK-клеток.

(A, B) Количественная оценка маскировки тромбоцитами опухолевых клеток яичников и меланомы, а также линии контрольных клеток миелогенного лейкоза K562.Линии опухолевых клеток совместно инкубировали с тромбоцитами и без них и анализировали на поверхностную экспрессию специфического маркера тромбоцитов CD42b. Данные экспрессии представлены гистограммой (A) в процентах от общего числа клеток и средней интенсивностью флуоресценции (MFI; B). (C-F) Анализ функциональных последствий маскировки тромбоцитов на функции NK-клеток. Противоопухолевые анализы NK-клеток выполняли путем совместной инкубации PBMC с опухолевыми клетками (скрытыми и незакрытыми) в течение 4 часов и измерения CD107a (C, E) и продукции IFNgamma (D, F) в качестве маркеров активации.(E, F) Чтобы проанализировать соответствующие роли факторов контакта с тромбоцитами (скрытые (за вычетом рилизата)) и растворимые факторы (рилизат (без покрытия тромбоцитов)), тромбоциты и рилизат были выделены и использованы для обработки NK-клеток в анализах активации NK как описано ранее. (C-F) Данные, проанализированные с помощью ANOVA — каждый эксперимент представляет собой среднее значение ± S.E.M. минимум трех независимых экспериментов. * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211538.g001

Иммунная модуляция опосредуется как растворимыми, так и контактными факторами

Поскольку известно, что как факторы контакта с клеткой, такие как HLA класса I, так и растворимые молекулы тромбоцитов, такие как TGFβ, изменяют эффекторные функции NK-клеток, мы рассмотрели соответствующие роли растворимых и контактных факторов в опухолевых клетках яичников и меланомы. иммунное уклонение. Для изучения контактных факторов PBMC инкубировали с опухолевыми клетками яичников и меланомы, покрытыми тромбоцитами, а также с контрольными клетками K562, которые промывали для удаления факторов, растворимых в тромбоцитах.Промывка опухолевых клеток яичников, покрытых тромбоцитами, для удаления высвобождения тромбоцитов частично восстанавливала активность NK-клеток и продукцию IFNγ (рис. 1E и 1F). Для опухолевых клеток меланомы активность CD107a полностью восстанавливалась в отсутствие рилизата тромбоцитов, в то время как IFNγ не влиял (рис. 1E и 1F). Это предполагает роль мембраносвязанных факторов контакта с клетками для линий опухолевых клеток яичников и меланомы. Для исследования растворимых факторов РВМС инкубировали с опухолевыми клетками, суспендированными в рилизате тромбоцитов (супернатанты опухолевых клеток, покрытые тромбоцитами) в отсутствие тромбоцитов.Растворимые факторы сильно подавляют функции NK-клеток для всех клеточных линий. Эти данные демонстрируют, что как факторы контакта с клетками, так и рилизат тромбоцитов, индуцированный как опухолевыми клетками яичников, так и опухолевыми клетками меланомы, являются мощным ингибитором активности NK-клеток (рис. 1E).

Маскировка тромбоцитов управляет механизмом иммунной ловушки через протеазы ADAM

Система рецептор-лиганд NKG2D-MICA / MICB хорошо зарекомендовала себя в иммунном надзоре за опухолями. Мы предположили, что покров тромбоцитов модулирует рецептор и лиганд, способствуя уклонению опухоли от иммунитета.Первоначально мы подтвердили, что ось является функциональной в нацеливании на NK наших клеточных линий с помощью функциональных анализов NK-клеток в присутствии / отсутствии нейтрализующих антител к NKG2D (S2 фиг.) И лигандам, экспрессируемым опухолью MICA и MICB (S2 фиг.). Нейтрализация каждого компонента значительно снизила противоопухолевую активность NK-клеток против каждого эпителиального рака. Впоследствии мы определили роль опухолевых клеток, покрытых тромбоцитами, тромбоцитов и рилизата тромбоцитов (из тромбоцитов, активированных TRAP) в регулировании экспрессии NKG2D и функций NK-клеток.Первоначальные результаты показывают, что как замаскированные, так и незакрытые опухолевые клетки активно подавляют NKG2D на поверхности NK-клеток (рис. 2А). Важно отметить, что уменьшение обнаруживаемого NKG2D на NK-клетках при совместной инкубации с опухолевыми клетками в течение 24 часов является хорошо установленным явлением, которое мы далее продемонстрировали здесь. Поэтому мы проанализировали функции активированных тромбоцитов и растворимых факторов в отсутствие опухолевых клеток. PBMC инкубировали либо с активированными тромбоцитами (с помощью TRAP), либо с рилизатом тромбоцитов, и наблюдалось значительное снижение NKG2D на поверхности NK-клеток (фиг. 2B).

Рис. 2. Тромбоциты модулируют экспрессию рецептора NKG2D, индуцируя высвобождение NKG2DL MICA и MICB с поверхности линий опухолевых клеток.

(A, B, C) Для изучения роли опухолевых клеток, покрытых тромбоцитами, тромбоцитов и TRAP-индуцированного высвобождения тромбоцитов в регуляции экспрессии NKG2D, количественное определение NKG2D было выполнено с помощью проточной цитометрии PBMC в присутствии или в отсутствие опухолевых клеток. опухолевые клетки, покрытые тромбоцитами, тромбоциты или тромбоциты высвобождаются в течение 24 часов. (C) Относительная экспрессия MICA и MICB на линиях опухолевых клеток была определена количественно с помощью mAb MICA / MICB и проточной цитометрии (n = 3) (D, E) Роль тромбоцитарной оболочки в экспрессии известных лигандов, активирующих NK-клетки MICA и MICB на опухолевых клетках исследовали путем измерения базовой экспрессии (светлые столбцы) и сравнения его с опухолевыми клетками, покрытыми тромбоцитами (темные столбцы).Опухолевые клетки инкубировали в течение 4 (D) или 24 (E) часов в присутствии или в отсутствие тромбоцитов, и экспрессию лиганда количественно определяли с помощью проточной цитометрии. (F) Анализ растворимых MICA и MICB в супернатантах линий опухолевых клеток, инкубированных в течение 24 часов в присутствии или в отсутствие тромбоцитов с помощью ELISA. (G) Анализ Такмана скрытых и незакрытых тромбоцитами опухолевых клеток яичника / меланомы на гены ADAM19, ADAM10 и ADAM17. Показанные значения относятся к скрытым ячейкам относительно незакрытых ячеек. (A, B, D) Данные, проанализированные с помощью ANOVA — каждый эксперимент представляет собой среднее значение ± S.E.M. минимум трех независимых экспериментов. (G) Данные проанализированы с помощью t-критерия и представлены как стандартное отклонение по крайней мере трех независимых экспериментов, * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211538.g002

Затем мы исследовали влияние тромбоцитарной оболочки на опухолевую клетку и ее экспрессию NKG2DL. Каждая линия опухолевых клеток экспрессировала различные уровни MICA и лиганда MICB на нестимулированных клетках (фиг. 2C). Экспрессия поверхностных MICA и MICB была заметно снижена для каждой линии эпителиальных раковых клеток при маскировке опухолевыми клетками (фиг. 2D и 2E).Самый сильный эффект наблюдался для экспрессии MICA на линии клеток меланомы и для MICB на клетках яичника 59M, которые экспрессировали самые высокие базальные уровни соответствующих лигандов. Чтобы изучить временную взаимосвязь тромбоцитов со сниженной экспрессией опухолевых лигандов, опухолевые клетки инкубировали в течение 4 часов и 24 часов с тромбоцитами для изучения прямого маскирования лиганда и / или протеолитического расщепления тромбоцитами (4 часа) и транскрипционных изменений в опухолевой клетке. линия (24h) (Рис 2D и 2E).Наши результаты предполагают, что, хотя есть некоторая потеря MICA и MICB из опухолевой клетки через 4 часа (не достигла статистической значимости), большая часть лиганда теряется в течение 24 часов, что позволяет предположить, что механизм не является быстрой стерической окклюзией, а происходит в большей степени. постепенно (рис 2D и 2E).

Известным механизмом ингибирования NK-клеток является индуцированное подавление рецептора NKG2D растворимыми лигандами NKG2D, в частности MICA и MICB. Мы инкубировали NK-клетки с рекомбинантными MICA и MICB и наблюдали значительное снижение экспрессии поверхностного лиганда NKG2D в нашей системе (S3 фиг.).Важно отметить, что присутствие рекомбинантной молекулы в сайте связывания рецептора NKG2D может искусственно снизить обнаружение антителами, если они конкурируют за сайты связывания. Поэтому мы охарактеризовали последующий эффект связывания лиганда, чтобы подтвердить нашу гипотезу. NK-клетки, которые были предварительно обработаны рекомбинантными MICA и MICB, имели пониженные противоопухолевые функции по сравнению с контрольным белком IgG-Fc (S3 фиг.). Это подтверждается предыдущими данными, согласно которым функции NK-клеток подавлялись, когда функции рецептора NKG2D были нейтрализованы (S2 фиг.).

Учитывая, что MICA и MICB теряются с поверхности опухолевых клеток тромбоцитозависимым образом, мы предположили роль тромбоцитов в стимулировании высвобождения растворимых лигандов NKG2D в микроокружение скрытых опухолевых клеток. Чтобы количественно оценить это, супернатанты от культур опухолевых клеток в присутствии или в отсутствие тромбоцитов и только тромбоцитов были проанализированы с помощью ELISA на растворимые молекулы MICA и MICB (рис. 2F). MICA продуцировался клетками меланомы в отсутствие тромбоцитов, но не обнаруживался для клеток яичников или контрольных клеток.(Рис. 1C). Маскировка тромбоцитов вызвала высвобождение MICA из всех клеточных линий, однако это имело значение только для наших клеток меланомы. Точно так же присутствие тромбоцитарной оболочки индуцировало секрецию растворимого MICB из всех клеточных линий, особенно из линий яичниковых клеток 59M и SKOV-3, демонстрируя тромбоцитозависимый механизм уклонения от иммунитета.

Временная взаимосвязь маскировки с высвобождением sNKG2DL указывает на то, что регуляция генов опухолевых клеток является механически важной. Относительная ПЦР Такмана скрытых и незакрытых опухолевых клеток яичников выявила, что ADAM19 активируется в скрытых тромбоцитами клетках яичников и меланомы по сравнению с незакрытыми клетками (рис. 2G).Интересно, что ADAM10 и ADAM17 не активируются в опухолевой клетке, что свидетельствует о новом и отличном процессе регуляции расщепления NKG2DL на поверхности опухолевых клеток. Наши результаты демонстрируют, что тромбоциты специфически активируют гены семейства протеаз, которые, как известно, расщепляют лиганды NKG2DL, и предполагают потенциальную роль протеаз ADAM, происходящих из опухоли, в расщеплении NKG2DL.

Путем обработки рилизата из скрытых тромбоцитами опухолевых клеток, содержащих растворимые факторы тромбоцитов плюс растворимые факторы опухолевых клеток, нейтрализующими антителами к MICA и MICB подавление NKG2D (рис. 3A), дегрануляции (рис. 3B) и провоспалительных цитокинов (рис. 3C) производство было частично спасено.Интересно, что спасение с помощью антитела против MICA было достигнуто только для клеток меланомы, что согласуется с нашим выводом о том, что MICA высвобождается только из клеток меланомы в значительных количествах. Кроме того, спасение наблюдали для всех типов клеток, когда MICB нейтрализовали, поскольку MICB присутствовал в рилизате каждой клеточной линии.

Рис. 3. MICA и MICB в рилизате модулируют экспрессию NKG2D и функции NK-клеток.

(A) Для изучения роли MICA и MICB из рилизата тромбоцитов (из опухолевых клеток, покрытых тромбоцитами) в регуляции функций NKG2D и NK-клеток, рилизат тромбоцитов нейтрализовали с использованием моноклональных антител против MICA и MICB, как описано ранее.Экспрессия NKG2D (A) и функции NK-клеток (CD107a (B) и IFNgamma (C)) были количественно определены после стандартных 4-часовых анализов функции NK-клеток с помощью проточной цитометрии, и результаты выражены как средняя интенсивность флуоресценции (MFI; A) или в процентах. нестимулированного или контроля IgG (B и C). (D) Схематическое изображение опосредованного тромбоцитами sNKG2DL механизма-приманки иммунного уклонения от опухоли (A-C). Данные, проанализированные с помощью ANOVA — каждый эксперимент представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. минимум трех независимых экспериментов. * = р <0.05, ** = p <0,01, *** = p <0,001

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211538.g003

Вместе эти результаты раскрывают механизм приманки, способствующий уклонению опухолевых клеток от наблюдения за NK-клетками (рис. 3D).

Маскировка тромбоцитов нарушает ось распознавания опухоли CD226 / CD96-CD112 / CD155

Подобно NKG2D, CD226 и CD96 представляют собой рецепторы, экспрессируемые на поверхности NK-клеток, которые, как известно, важны для иммунного надзора за опухолью. Лигандами рецепторов CD226 и CD96 опухолевой клетки являются CD112 и CD155.Мы подтвердили и количественно оценили их экспрессию на клеточных линиях яичников и меланомы с помощью иммунофлуоресценции с использованием проточной цитометрии на основе специфических моноклональных антител к CD112 и анти-CD155, и каждая из наших линий опухолевых клеток яичников и меланомы экспрессирует как CD112, так и CD155 (S4 фиг.).

Чтобы исследовать, функционирует ли система распознавания CD226 / CD96-CD155 / CD112 опухолевых клеток в контексте наших опухолевых клеток яичников и меланомы, мы заблокировали каждый компонент коммерческими mAb и провели функциональные анализы NK-клеток (Рис. 4 и S4 Рис.).Блокирование CD226 на NK-клетке вызывало заметное ингибирование функций NK как в отношении активности, так и в отношении продукции цитокинов, с наиболее сильными эффектами, наблюдаемыми для линий эпителиальных раковых клеток (фиг. 4A). Нейтрализация CD96 на NK-клетке (фиг. 4A) или лигандов CD155 или CD112 (S4 фиг.) На опухолевой клетке не нарушала целенаправленное уничтожение NK-клеток наших линий опухолевых клеток. Однако двойное блокирование лигандов CD155 и CD112 продемонстрировало заметное ингибирование противоопухолевых функций NK (фиг. 4A). Это подчеркивает сложность и избыточность системы.

Рис. 4. Тромбоциты разрушают NK-ось CD226 / CD96-CD112 / CD155 для нацеливания NK-клеток на линии опухолевых клеток.

(A) Анализы блокирования с использованием mAb против CD226, CD96 или CD155 / CD112 в стандартных противоопухолевых анализах (поверхностная экспрессия CD107a и продукция IFNy) для анализа роли каждой молекулы в нацеливании NK-клеток на линии опухолевых клеток. (B) Роль тромбоцитарной оболочки в экспрессии известных лигандов CD112 и CD155, активирующих NK-клетки, на опухолевых клетках была исследована путем измерения базовой экспрессии (светлые столбцы) и сравнения ее с опухолевыми клетками, покрытыми тромбоцитами (черные столбцы).Опухолевые клетки инкубировали в течение 24 часов в присутствии или в отсутствие тромбоцитов, и экспрессию лиганда количественно определяли с помощью проточной цитометрии. (C) Анализ влияния опухолевых клеток с тромбоцитарной оболочкой и без нее на экспрессию рецепторов CD226 и CD96 NK-клеток. РВМС (прозрачные столбцы) совместно инкубировали с незакрытыми (заполненные столбцы) и скрытыми (серые столбцы) опухолевыми клетками в течение 24 часов, а экспрессию CD226 и CD96 количественно оценивали с помощью проточной цитометрии. (D) Чтобы проанализировать роль растворимых факторов, эксперименты были повторены, как указано выше, с TRAP-активированными дегранулирующими тромбоцитами (+ группа тромбоцитов) и высвобождением из TRAP-активированных дегранулированных тромбоцитов, которые были очищены от клеточного материала тромбоцитов (+ группа рилизата).(A-D) Данные, проанализированные с помощью ANOVA — каждый эксперимент представляет собой среднее значение ± S.E.M. минимум трех независимых экспериментов. * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211538.g004

Учитывая роль тромбоцитов в регуляции лигандов, экспрессируемых опухолевыми клетками, и рецепторов, экспрессируемых NK-клетками в системе NKG2D-MICA / MICB, мы предположили, что CD226 / Ось CD96-CD112 / CD155 регулируется аналогичным образом. Мы наблюдали, что линии опухолевых клеток, покрытые тромбоцитами, имели значительное снижение экспрессии CD112 и CD155 (рис. 4B).Как было показано ранее, опухолевые клетки, покрытые тромбоцитами, менее иммуногенны, чем незакрытые клетки, и блокируя доступ к лигандам опухолевых клеток (с использованием моноклональных антител), дегрануляция NK-клеток и синтез цитокинов ингибируются (Фиг.4A и S4 Фиг). Этот механизм уклонения от иммунитета опосредуется тромбоцитами и активно разрушает ось CD226 / CD96-CD112 / CD155.

Мы также подтвердили, что тромбоцитарная оболочка подавляет CD226 и CD96 NK-клеток (рис. 4C). CD226 подавлялся при инкубации только с незакрытыми опухолевыми клетками, явление, которое было опубликовано ранее (рис. 4C).Наблюдается парадоксальное увеличение CD226 с опухолевыми клетками, покрытыми тромбоцитами, артефакт из-за прилипания активированных CD226 + тромбоцитов к NK-клеткам (рис. 4C). Интересно, что активность NK не изменилась через 24 часа по сравнению с 4-часовой инкубацией, что позволяет предположить, что снижение CD226 не является механистическим при ингибировании NK-клеток в этом сценарии. Для дальнейшего анализа роли активированных тромбоцитов и рилизата, РВМС совместно инкубировали либо с активированными TRAP тромбоцитами, либо с рилизатом тромбоцитов, и экспрессию рецептора NK определяли количественно с помощью проточной цитометрии (фиг. 4D).Экспрессия CD226 на клеточной поверхности снижалась как активированными тромбоцитами, так и рилизатом тромбоцитов (рис. 4D). Более сильное ингибирование тромбоцитарным материалом предполагает, что молекулы с поверхности тромбоцитов выполняют регуляторные функции, в то время как растворимые молекулы также активны, что демонстрируется мощным подавлением CD226 рилизатом (рис. 4D). Аналогичный эффект наблюдался для CD96 со значительным снижением экспрессии в ответ на опухолевые клетки, покрытые тромбоцитами, тромбоциты и рилизат, предполагая роль обоих в подавлении CD96, предполагая, что CD226 и его корецептор CD96 подавляются согласованно (Рис. .Регулирование CD96 на NK-клетке, в отличие от CD226, не зависит от подавляющих эффектов одной опухолевой клетки.

TGFβ из тромбоцитов ингибирует CD226, но не CD96 на NK-клетках

TGFβ установил функции в подавлении регуляции рецептора NKG2D и противоопухолевые функции NK-клеток. TGFβ высвобождается из активированных тромбоцитов, что продемонстрировано анализами ELISA, проведенными на опухолевых клетках в присутствии или в отсутствие тромбоцитов (фиг. 5A). Рекомбинантный TGFβ подавлял экспрессию CD226 на NK-клетках.Интересно, что наблюдалось значительное увеличение экспрессии CD96 (фиг. 5B). Кроме того, нейтрализуя TGFβ в рилизате тромбоцитов (из опухолевых клеток, покрытых тромбоцитами) с использованием антитела против TGFβ, мы наблюдали восстановление подавления CD226, поддерживая TGFβ-зависимую регуляцию этого рецептора. Для CD96 не наблюдалось значительного эффекта, что указывает на то, что этот рецептор регулируется независимо от TGFβ. Посредством обработки NK-клеток рекомбинантным TGFβ их функции могли быть подавлены (фиг. 5C), что дополнительно поддерживалось нейтрализацией TGFβ в рилизате для восстановления подавления NK-клеток (фиг. 5D и 5E).Вместе эти данные демонстрируют, что TGFβ подавляет функции NK-клеток посредством подавления CD226 на поверхности NK-клеток.

Рис. 5. TGFbeta — это активная растворимая молекула в тромбоцитах, вызывающая иммунное уклонение циркулирующих опухолевых клеток.

(A) Количественное определение TGFbeta (общего и активного), высвобожденного из скрытых опухолевых клеток (закрашенное поле), по сравнению с незакрытыми клетками (прозрачное поле) с использованием двойного анализа ELISA супернатантов опухолевых клеток, инкубированных в течение 4 часов в присутствии или в отсутствие тромбоцитов.(B) Чтобы проанализировать роль TGFbeta, рекомбинантную молекулу TGFbeta1 использовали для предварительной обработки NK-клеток в течение 24 часов, и экспрессию рецепторов CD226 и CD96 количественно оценили с помощью проточной цитометрии. Для подтверждения in vitro роли TGFbeta, полученного из тромбоцитов, для предварительной очистки супернатантов использовали нейтрализующие антитела против TGFbeta, а экспрессию рецептора сравнивали с необработанными клетками. (C) Функциональные анализы для подтверждения действия TGFbeta на противоопухолевые функции NK-клеток выполняли путем предварительной обработки NK-клеток рекомбинантным TGFbeta и измерения поверхностной экспрессии CD107a и продукции IFNgamma в качестве маркеров активации NK-клеток.(D, E) Анализ роли TGFbeta в рилизате тромбоцитов на экспрессию CD107a (D) и продукцию IFNgamma (E) путем сравнения действия TRAP-индуцированного рилизата тромбоцитов по сравнению с рилизатом, который был очищен от TGFbeta нейтрализующим антителом. (C-E) Результаты представляют собой обнаружение маркеров активации в виде процента от среднего ответа необработанных NK-клеток на каждую отдельную линию опухолевых клеток. (A-E) Данные, проанализированные с помощью ANOVA — каждый эксперимент представляет собой среднее значение ± S.E.M. минимум трех независимых экспериментов.* = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211538.g005

Обсуждение

В кровотоке раковые клетки (также известные как циркулирующие опухолевые клетки или ЦКО) сталкиваются со многими проблемами, которые частично преодолеваются за счет образования кластеров ЦОК-тромбоцитов, опосредованного факторами свертывания, высвобождаемыми как опухолевыми клетками, так и активированные тромбоциты [14]. ЦКО должны уклоняться от иммунного клиренса NK-клетками периферического кровообращения.NK-клетки экспрессируют рецепторы, которые эффективно связывают антигены опухолевых клеток и высвобождают цитотоксические гранулы для нейтрализации опухолевых клеток в крови. Однако, как сообщалось ранее, ЦОК вызывают высвобождение иммуносупрессивных молекул из тромбоцитов, чтобы ингибировать NK-клетки и ускользать от обнаружения [7, 15]. Кроме того, было показано, что тромбоциты передают свой главный комплекс гистосовместимости класса I опухолевым клеткам, тем самым обеспечивая «собственный» статус и способствуя уклонению от иммунитета [6]. Взаимодействия между опухолевыми клетками и тромбоцитами являются сложными, особенно роль тромбоцитов в облегчении иммунного уклонения от ЦКО, аналогичная той, которая ранее была идентифицирована для линий клеток зародышевых клеток, простаты и толстой кишки [7].

В этом исследовании мы изучили влияние тромбоцитов и их высвобождения на двух разных моделях метастатического заболевания; использование клеток рака яичников с низким уровнем трафика, которые распространяются в основном через брюшную полость в асцитической жидкости и реже через периферическую сосудистую сеть, а также злокачественных клеток меланомы с высоким уровнем трафика, которые распространяются преимущественно через лимфатическую и сосудистую системы. Мы предсказали, что клетки с такими несопоставимыми метастатическими стратегиями будут различаться по своим основным молекулярным антииммунным функциям.Используя проточную цитометрию, мы подтвердили способность опухолевых клеток яичников и меланомы эффективно активировать и принимать покров из тромбоцитов и индуцировать высвобождение модулирующих молекул, включая TGFβ. Впоследствии мы показали, что молекулы, содержащиеся в рилизате тромбоцитов, являются мощными ингибиторами NK-клеток. Мы также продемонстрировали консервативную роль контактных факторов межклеточного взаимодействия и растворимых факторов высвобождения тромбоцитов в подавлении противоопухолевых функций NK-клеток в опухолевые клетки, которые распространяются гематогенно (высокий трафик) и транскеломно (низкий трафик).

Взаимодействие между NKG2D на NK-клетке и NKG2DL (MICA и MICB) на опухолевой клетке активирует противоопухолевые функции NK-клетки. Поскольку NKG2DL экспрессируются только на стрессированных клетках, включая злокачественно трансформированные клетки, эта ось представляет целевой механизм иммунного клиренса раковых клеток. Интересно, что длительное воздействие на NK-клетки опухолевых клеток, экспрессирующих лиганд, приводит к снижению уровней NKG2D в NK-клетке. Это было важным соображением в нашем исследовании, и поэтому мы изучили функции тромбоцитов и растворимых факторов отдельно от опухолевых клеток.В нашем исследовании высвобождение тромбоцитов из скрытых опухолевых клеток яичников и меланомы подавляло NKG2D на NK-клетках, явление, ранее описанное для клеток рака простаты и толстой кишки [7]. Тромбоциты воздействовали на опухолевые клетки, уменьшая обнаруживаемый поверхностный NKG2DL, изменяя фенотип «стресс или чужой» на «собственный». Затем маскировка тромбоцитов снижает иммуногенность опухолевых клеток по отношению к NK-клеткам, способствуя уклонению от иммунитета. Мы подтвердили это открытие, продемонстрировав снижение узнавания NK-клеток и реактивность по отношению к опухолевым клеткам, которые были нейтрализованы антителами против NKG2DL, MICA и / или MICB.

TGFβ из тромбоцитов представляет собой хорошо установленный механизм подавления поверхностной экспрессии рецептора NKG2D и функции NK-клеток. Однако мы наблюдали, что NKG2D и, следовательно, функция NKG2D более сильно подавляется высвобождением тромбоцитов, чем рекомбинантным TGFβ (S2 фиг.). Мы, следовательно, предположили, что солюбилизированный NKG2DL вносит вклад в супрессию NKG2D. В нашем исследовании опухолевые клетки яичников и меланомы с тромбоцитарной оболочкой могут быть индуцированы высвобождением растворимого NKG2DL в микроокружение опухолевых клеток, и что NKG2D активно подавляется с помощью рекомбинантных белков MICA и MICB.Недавнее исследование демонстрирует влияние маскировки тромбоцитов на отщепление лигандов NKG2D, что подтверждает эти выводы [16]. Кроме того, нейтрализуя растворимые MICA и MICB в высвобождении тромбоцитов, мы частично восстанавливали подавление и функцию NKG2D. Нейтрализация MICA была эффективна только для клеток меланомы, которые высвобождали растворимую MICA в высоких дозах независимо от тромбоцитов. Это, возможно, предполагает, что клетки меланомы с высоким трафиком выделяют высокие концентрации растворимого MICA, чтобы избежать обнаружения и атаки NK-клеток, что объясняет меньшую способность NK-клеток вызывать иммунный ответ на эту клеточную линию.Растворимый MICA для клеток рака яичников, хотя и индуцируется маскировкой тромбоцитов, демонстрирует лишь умеренное увеличение уровней в микросреде, и поэтому неудивительно, что нейтрализация sMICA в рилизате не имеет поддающегося измерению эффекта. Однако, наоборот, нейтрализация MICB в рилизате восстанавливала экспрессию NKG2D для каждой клеточной линии, что коррелирует с индуцированным тромбоцитами высвобождением растворимого MICB из опухолевых клеток, описанным ранее. Это предполагает консервативную роль MICB в клетках с высоким и низким трафиком, в то время как MICA, по-видимому, функционирует только в типах клеток с высоким трафиком.

Роль протеаз ADAM в отщеплении MICA и MICB была показана ранее [16, 17]. Чтобы изучить роль протеаз ADAM на поверхности тромбоцитов, мы определили временную взаимосвязь маскировки тромбоцитов с выделением MICA и MICB с поверхности. Мы обнаружили, что, хотя низкие уровни выделения обнаруживаются через короткие интервалы времени (что связано с прямым расщеплением ADAM10 и ADAM17 на поверхности тромбоцитов), гораздо более сильный эффект наблюдался при 24-часовой инкубации. Впоследствии мы исследовали экспрессию ADAM10, ADAM17 и ADAM19 в опухолевой клетке и обнаружили, что, хотя ADAM10 / 17 не индуцируется маскировкой тромбоцитов, ADAM19 индуцируется мощно.Мы предполагаем, что ADAM19 играет важную функциональную роль в расщеплении MICA и MICB, и мы стремимся рассмотреть этот вопрос в будущих исследованиях. Действительно, обнаружение растворимых MICA и MICB в сыворотке крови пациентов с запущенной гепатоцеллюлярной карциномой [18] и плоскоклеточной карциномой полости рта [19] соответственно представляет собой маркер худшего прогноза, в то время как повышенный уровень растворимого MICA и сниженный уровень NKG2D являются плохими прогностическими маркерами в рак поджелудочной железы [20]. Наши результаты демонстрируют иммунный механизм-приманку для выхода опухолевых клеток из естественных клеток-киллеров в периферическое кровообращение и идентифицируют новую механистическую мишень в метастатическом каскаде для иммунотерапии рака.

NK-клеточные иммуноглобулиновые рецепторы CD226 и CD96, которые взаимодействуют с нектиноподобным лигандом CD112 и рецептором полиовируса CD155 на клетках-мишенях, становятся важными медиаторами противораковых функций NK-клеток [21–23]. Функция CD226 в распознавании опухолевых клеток NK-клетками была исследована ранее [24]. В нашем исследовании мы первоначально продемонстрировали, что CD226 был функциональным в нацеливании NK на наши клеточные линии меланомы и опухоли яичников. Это было достигнуто путем наблюдения за отрицательным функциональным воздействием блокирования рецептора CD226 коммерческими mAb.Интересно, что нейтрализация CD96, известной молекулы адгезии, не оказала значительного влияния на функции NK-клеток. Это подтверждается ранее опубликованными данными [24]. CD96 менее изучен. Его первичным лигандом является CD155, и недавние исследования мышиного CD96 показали, что он является конкурентным ингибитором CD226, конкурирующим за связывание с CD155 с более сильным сродством связывания с лигандом и, как следствие, прямым ингибированием дегрануляции NK-клеток и продукции цитокинов [21] . Однако CD96 действует как молекула адгезии, способствующая активности NK в контексте человека, и поэтому описывается как рецептор, активирующий NK-клетки [25].Эволюционно расходящиеся функции мышиных и человеческих молекул CD96 были рассмотрены экспертами как объяснение различий в отчетах, и для полного определения CD96 в контексте человека требуется дополнительная работа. Функциональные сложности CD96 в иммунном надзоре за опухолью интригуют, однако они выходят за рамки данного исследования, и мы намерены сосредоточить на них внимание в дальнейших исследованиях. Подтверждая роль CD226 и CD96 в контексте уклонения от опухоли, исследование пациентов с раком поджелудочной железы продемонстрировало, что CD226 + CD96 + NK-клетки недостаточны у пациентов по сравнению со здоровым контролем, в то время как TIGIT не изменился [26].Кроме того, повышенная регуляция CD226 и CD96 наблюдалась на NK-клетках пациентов с безрецидивным раком груди, и было обнаружено, что CD226 снижен на анергических NK-клетках, связанных с раком легких [27–29].

Учитывая, что ось активна в иммунном надзоре как за клетками меланомы, так и за опухолевыми клетками яичников, мы установили, что опухолевые клетки, покрытые тромбоцитами, активированные тромбоциты и тромбоциты высвобождают все функции по подавлению экспрессии CD226 и CD96 на поверхности NK-клеток. Кроме того, мы наблюдали, что опухолевые клетки, покрытые тромбоцитами, значительно снижают экспрессию лигандов CD112 и CD155, которые активируют CD226 / CD96.Это имитирует двойную функциональность тромбоцитов в системе NKG2D / NKG2DL по ингибированию как иммунных рецепторов, так и маркера опухолевых клеток. Роль TGFβ в модулировании функции рецептора NK-клеток установлена ​​для NKG2D [7], и здесь мы описали аналогичную роль для CD226. Рекомбинантный TGFβ подавлял экспрессию CD226 и функции NK-клеток, и это поддерживалось нейтрализацией TGFβ в рилизате тромбоцитов для частичного восстановления подавления. TGFβ значительно увеличивает экспрессию CD96 на NK-клетках, предполагая, что CD96 регулируется независимо от TGFβ.Эта новая роль TGFβ может помочь в разработке успешных анти-TGFβ или антитромбоцитарных стратегий в борьбе с метастатическим заболеванием.

Взятые вместе, эти результаты указывают на глубокое и систематическое ингибирование врожденного иммунного надзора за счет маскировки тромбоцитов или выработки тромбоцитов из тромбоцитов, примированных раком, и обеспечивают потенциальные будущие химиотерапевтические мишени для метастатического заболевания.

Дополнительная информация

S1 Рис. Типичная стратегия стробирования.

(A) Гейтинг популяций опухолевых клеток из свободных тромбоцитов. Графики FSC / SCC клеток SKOV3, тромбоцитов и скрытых клеток SKOV3 демонстрируют две различные популяции. (B) Ворота опухолевых клеток (P11), окрашенные антителом CD42b APC. Изотипический контроль, SKOV3, образцы тромбоцитов и скрытые образцы SKOV3 демонстрируют низкую контаминацию свободных тромбоцитов в популяции опухолевых клеток, а также положительные и отрицательные популяции для скрытых опухолевых клеток. (C) Ворота лимфоцитов были применены к целым PBMC от здоровых доноров.Лимфоциты были заблокированы для NK-клеток (CD3-CD56 + клетки). (D) CD3-CD56 + NK-клетки обрабатывали раковыми клетками и скрытыми раковыми клетками (раковые клетки + тромбоциты) и анализировали на экспрессию CD107a.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211538.s001

(TIF)

S2 Рис. Нейтрализация оси NKG2D-NKG2DL подавляет функции NK-клеток.

(A) Количественная оценка способности моноклональных антител нейтрализовать рецептор NKG2D на NK-клетках и лиганды MICA и MICB на линиях опухолевых клеток.PBMC и линии опухолевых клеток инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре в присутствии или в отсутствие 1 мкг / мл соответствующего mAb и затем окрашивали флуоресцентными антителами для количественной оценки молекулярной блокады по сравнению с необработанными клетками. Для линий опухолевых клеток прозрачный прямоугольник представляет окрашивание в отсутствие блокады mAb, а закрашенный прямоугольник представляет нейтрализованные клетки. (B) Учитывая удовлетворительную нейтрализацию поверхностных молекул, клетки использовали в стандартных противоопухолевых анализах (поверхностная экспрессия CD107a и продукция IFNgamma) для анализа роли каждой молекулы (и действительно, комбинации молекул) в нацеливании NK-клеток на линии опухолевых клеток.(C) Экспрессия NKG2D на NK-клетках. NKG2D был сильно подавлен, но как рилизат тромбоцитов, так и рекомбинантный белок TGFbeta, со значительным ингибированием с помощью рилизата по сравнению с рекомбинантным белком. (A, B, C) Каждый эксперимент представляет собой среднее значение ± S.E.M. минимум трех независимых экспериментов. * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211538.s002

(TIF)

S3 Рис. Роль растворимых MICA и MICB в экспрессии NKG2D и функциях NK-клеток.

(A) Экспрессия NKG2D на NK-клетках после обработки рекомбинантным MICA или MICB в течение 24 часов. (B и C) NK-клетки также были функционально проанализированы на экспрессию CD107a и продукцию IFNy. Результаты выражены в процентах от контроля в присутствии контроля IgG для каждой клеточной линии. (A-C) Данные, проанализированные с помощью ANOVA — каждый эксперимент представляет собой среднее значение ± S.E.M. минимум трех независимых экспериментов. * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211538.s003

(TIF)

S4 Рис. Количественная оценка экспрессии и функции лигандов CD112 и CD155 на линиях опухолевых клеток.

(A) Количественная оценка лигандов CD112 и CD155 на линиях опухолевых клеток с использованием флуоресцентных mAb и проточной цитометрии (B) Моноклональные антитела против CD155 или CD112 использовали для блокирования нацеливания NK-клеток на линии опухолевых клеток. NK-клетки инкубировали совместно с опухолевыми клетками в присутствии или в отсутствие опухолевых клеток, которые предварительно обрабатывали нейтрализующими антителами, и определяли дегрануляцию и продукцию цитокинов.Результаты выражаются в процентах увеличения или уменьшения нейтрализованных условий по сравнению с необработанными клетками. (C) 24-часовая временная точка для реактивности NK. Количественное определение CD107a и гамма IFN NK-клеток, которые инкубировали в течение 24 часов либо только с опухолевыми клетками, либо с замаскированными опухолевыми клетками (A, B, C). Данные, проанализированные с помощью ANOVA — каждый эксперимент представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. минимум трех независимых экспериментов. * = p <0,05, ** = p <0,01, *** = p <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211538.s004

(TIF)

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить доктора Сиару Кин за помощь в разработке функциональных тестов NK-клеток.

Ссылки

1. 1. Ханахан Д., Вайнберг Р.А. Признаки рака. Клетка. 2000. 100 (1): 57–70. pmid: 10647931
2. 2. Иган К., Кук Н., Кенни Д. Жизнь в условиях сдвига: тромбоциты защищают раковые клетки от повреждений, вызванных сдвигом. Clin Exp Metastasis. 2014. 31 (6): 697–704.pmid: 24942131
3. 3. Leblanc R, Peyruchaud O. Метастазы: новые функциональные последствия тромбоцитов и мегакариоцитов. Кровь. 2016; 128 (1): 24–31. pmid: 27154188
4. 4. Ацето Н., Бардиа А., Миямото Д.Т., Дональдсон М.К., Виттнер Б.С., Спенсер Дж. А. и др. Циркулирующие скопления опухолевых клеток являются олигоклональными предшественниками метастазов рака груди. Клетка. 2014. 158 (5): 1110–22. pmid: 25171411
5. 5. Вивье Э., Уголини С., Блез Д., Шабаннон С., Броссей Л.Нацелены на естественные клетки-киллеры и естественные Т-клетки-киллеры при раке. Nat Rev Immunol. 2012; 12 (4): 239–52. pmid: 22437937
6. 6. Плаке Т., Оргель М., Шаллер М., Юнг Дж., Раммензее Х.Г., Копп Х.Г. и др. MHC класса I, полученный из тромбоцитов, наделяет раковые клетки псевдонормальным фенотипом, который подрывает противоопухолевую реактивность естественных иммунных клеток-киллеров. Cancer Res. 2012. 72 (2): 440–8. pmid: 22127925
7. 7. Копп Х.Г., Плаке Т., Салих Х.Р. Бета-трансформирующий фактор роста тромбоцитов подавляет NKG2D, тем самым подавляя противоопухолевую реактивность естественных клеток-киллеров.Cancer Res. 2009. 69 (19): 7775–83. pmid: 19738039
8. 8. Вивье Э., Раулет Д.Х., Моретта А., Калиджури М.А., Зитвогель Л., Ланье Л.Л. и др. Врожденный или адаптивный иммунитет? Пример естественных клеток-киллеров. Наука. 2011; 331 (6013): 44–9. pmid: 21212348
9. 9. Гассер С., Раулет Д.Х. Активация и самотолерантность естественных клеток-киллеров. Immunol Rev.2006; 214: 130–42. pmid: 17100881
10. 10. Валне Г., Беккер С., Бродин П., Йоханссон М. Х. Продукция и дегрануляция IFN-гамма по-разному регулируются в ответ на стимуляцию в мышиных естественных клетках-киллерах.Scand J Immunol. 2008. 67 (1): 1–11. pmid: 18028287
11. 11. Иган К., Кроули Д., Смит П., О’Тул С., Спиллейн С., Мартин С. и др. Адгезия и дегрануляция тромбоцитов вызывают про-выживание и проангиогенную передачу сигналов в раковых клетках яичников. PLoS One. 2011; 6 (10): e26125. pmid: 22022533
12. 12. Смит Т., Параисо К.Х., Хирн К., Родригес-Лопес А.М., Мунк Дж. М., Хаарберг Х. Э. и др. Ингибирование HSP90 с помощью AT13387 задерживает появление устойчивости к ингибиторам BRAF и преодолевает устойчивость к двойному ингибированию BRAF и MEK на моделях меланомы.Mol Cancer Ther. 2014. 13 (12): 2793–804. pmid: 25349308
13. 13. Fraietta JA, Beckwith KA, Patel PR, Ruella M, Zheng Z, Barrett DM и др. Ибрутиниб усиливает приживление Т-клеток химерного антигенного рецептора и повышает эффективность при лейкемии. Кровь. 2016; 127 (9): 1117–27. pmid: 26813675
14. 14. Ю М., Бардиа А., Виттнер Б.С., Стотт С.Л., Смас М.Э., Тинг Д.Т. и др. Циркулирующие клетки опухоли молочной железы демонстрируют динамические изменения эпителиального и мезенхимального состава. Наука. 2013. 339 (6119): 580–4.pmid: 23372014
15. 15. Amo L, Tamayo-Orbegozo E, Maruri N, Eguizabal C, Zenarruzabeitia O, Riñón M и др. Участие взаимодействия тромбоцитов и опухолевых клеток в уклонении от иммунитета. Возможная роль подокаликсиноподобного белка 1. Front Oncol. 2014; 4: 245.
16. 16. Маурер С., Кропп К.Н., Кляйн Г., Стейнле А., Хаен С.П., Вальц Дж. С. и др. Опосредованное тромбоцитами отщепление лигандов NKG2D нарушает иммунный надзор за опухолевыми клетками NK-клетками. Онкоиммунология. 2018; 7 (2): e1364827. pmid: 29308299
17. 17.Waldhauer I, Goehlsdorf D, Gieseke F, Weinschenk T., Wittenbrink M, Ludwig A, et al. MICA, ассоциированная с опухолью, выделяется протеазами ADAM. Cancer Res. 2008. 68 (15): 6368–76. pmid: 18676862
18. 18. Ли Дж. Дж., Пан К., Гу М. Ф., Чен М. С., Чжао Дж. Дж., Ван Х и др. Прогностическое значение уровней растворимого MICA в сыворотке крови пациентов с запущенной гепатоцеллюлярной карциномой. Подбородок Дж. Рак. 2013; 32 (3): 141–8. pmid: 22704489
19. 19. Тамаки С., Каваками М., Иситани А., Кавасима В., Касуда С., Яманака Ю. и др.Уровни растворимого MICB в сыворотке коррелируют со стадией заболевания и выживаемостью у пациентов с плоскоклеточным раком полости рта. Anticancer Res. 2010. 30 (10): 4097–101. pmid: 21036725
20. 20. Чен Дж, Сюй Х, Чжу ХХ. Аномальные уровни экспрессии sMICA и NKG2D коррелируют с плохим прогнозом рака поджелудочной железы. Ther Clin Risk Manag. 2016; 12: 11–8. pmid: 26730197
21. 21. Чан С.Дж., Мартинет Л., Гилфиллан С., Соуза-Фонсека-Гимарайнш Ф., Чоу М.Т., Таун Л. и др. Рецепторы CD96 и CD226 противостоят друг другу в регуляции функций естественных клеток-киллеров.Nat Immunol. 2014; 15 (5): 431–8. pmid: 24658051
22. 22. Pauken KE, Wherry EJ. TIGIT и CD226: изменение баланса между костимулирующими и коингибитирующими молекулами для расширения набора инструментов для иммунотерапии рака. Раковая клетка. 2014; 26 (6): 785–7. pmid: 254
23. 23. Пенде Д., Боттино С., Кастрикони Р., Кантони С., Марченаро С., Ривера П. и др. PVR (CD155) и нектин-2 (CD112) в качестве лигандов активирующего рецептора человеческого DNAM-1 (CD226): участие в лизисе опухолевых клеток.Мол Иммунол. 2005; 42 (4): 463–9. pmid: 15607800
24. 24. Карлстен М., Бьоркстрём Н.К., Норелл Х., Брайсесон И., ван Холл Т., Бауманн BC и др. Дополнительная молекула-1 ДНКХ опосредует распознавание свежевыделенной карциномы яичника покоящимися естественными клетками-киллерами. Cancer Res. 2007. 67 (3): 1317–25. pmid: 17283169
25. 25. Fuchs A, Cella M, Giurisato E, Shaw AS, Colonna M. Передний край: CD96 (тактильный) способствует адгезии NK-клеток к клеткам-мишеням, взаимодействуя с рецептором полиовируса (CD155).J Immunol. 2004. 172 (7): 3994–8. pmid: 15034010
26. 26. Peng YP, Xi CH, Zhu Y, Yin LD, Wei JS, Zhang JJ, et al. Измененная экспрессия CD226 и CD96 на естественных клетках-киллерах у пациентов с раком поджелудочной железы. Oncotarget. 2016; 7 (41): 66586–94. pmid: 27626490
27. 27. Ascierto ML, Idowu MO, Zhao Y, Khalak H, Payne KK, Wang XY, et al. Молекулярные сигнатуры, в основном связанные с NK-клетками, позволяют прогнозировать безрецидивную выживаемость у пациентов с раком груди. J Transl Med.2013; 11: 145. pmid: 23758773
28. 28. Gras Navarro A, Björklund AT, Chekenya M. Терапевтический потенциал и проблемы естественных клеток-киллеров при лечении солидных опухолей. Фронт Иммунол. 2015; 6: 202. pmid: 25972872
29. 29. Ли Т., Ян И, Хуа Х, Ван Г, Лю В., Цзя С. и др. Фибробласты, ассоциированные с гепатоцеллюлярной карциномой, вызывают дисфункцию NK-клеток через PGE2 и IDO. Cancer Lett. 2012. 318 (2): 154–61. pmid: 22182446

CD226 регулирует продукцию IFN-γ NK-клетками в ответ на LPS.(a) …

Справочная информация Иммунотерапия значительно улучшила результаты лечения пациентов, но недавно столкнулась с препятствиями. CD96, новая иммунная контрольная точка, экспрессируемая на Т-клетках и естественных киллерах (NK), имеет важное значение для регулирования иммунных функций. Однако остается неясным, как CD96 коррелирует с иммунной инфильтрацией и прогнозом пациентов при панкреатите. Методы Базы данных HPA, TCGA, GEO, GTEx, Oncomine, TIMER2.0, PrognoScan, Linkedomics, Metascape и GEPIA2 использовались для анализа CD96 при раке.Визуализация данных в основном достигается с помощью языка R версии 4.0.2. Полученные результаты В целом, CD96 по-разному экспрессировался в большинстве раковых и прилегающих нормальных тканях. CD96 значительно повлиял на прогноз различных видов рака. В частности, высокая экспрессия CD96 была связана с более низкой общей выживаемостью (OS) и выживаемостью при конкретном заболевании (DSS) в когорте глиомы низшей степени злокачественности (LGG) TCGA (OS, HR = 2,18, 95% CI = 1,79–2,66, P <0,001). ). Противоположная ассоциация достоверно наблюдалась в когорте кожно-кожной меланомы (SKCM) (OS, HR = 0.96, 95% ДИ = 0,94–0,98, P <0,001). Примечательно, что образцы SKCM продемонстрировали самую высокую частоту мутации CD96 среди всех типов рака. Кроме того, в большинстве случаев рака уровень экспрессии CD96 значительно коррелировал с уровнями экспрессии признанных иммунных контрольных точек и обилием множественных иммунных инфильтратов, включая CD8 + Т-клетки, дендрические клетки (ДК), макрофаги, моноциты, NK-клетки, нейтрофилы, регуляторные Т-клетки (Tregs). ) и фолликулярные хелперные Т-клетки (Tfh). CD96 был идентифицирован как фактор риска, защитный фактор и нерелевантная переменная при LGG, SKCM и адренокортикальной карциноме (ACC) соответственно.Гены, связанные с CD96, участвуют в негативной регуляции лейкоцитов в LGG, однако участвуют во множественных позитивных иммунных процессах в SKCM. Кроме того, CD96 был значительно связан с определенными подмножествами иммунных маркеров. Важно отметить, что он сильно коррелировал с маркерами хелперных Т-клеток 1 типа (Th2) в SKCM, но не в LGG или ACC. Выводы CD96 участвует в различных иммунных ответах, управляет инфильтрацией иммунных клеток и влияет на злокачественные свойства различных типов рака, таким образом являясь потенциальным биомаркером для определения прогноза пациента и иммунной инфильтрации при множественных формах рака, особенно при глиоме и меланоме.

Абсцесс из остатков ураха на фоне острого живота: серия клинических случаев | Журнал медицинских историй болезни

Урахус — это нормальный эмбриональный остаток примитивного купола мочевого пузыря. Обычно он существует в виде фиброзного канатика, идущего от купола мочевого пузыря до пупка. Он также занимает потенциальное пространство по средней линии между брюшиной и поперечной фасцией. Заболевания ураха могут быть врожденными или приобретенными, и мы поддерживаем предположение о том, что полное обследование мочеполовых путей необходимо в детстве [6, 7].Врожденные аномалии возникают, когда урахус не может стереться. Патология, связанная с врожденным заболеванием урахуса, обычно делится на четыре категории [Рис. 4. Первая (а) — это открытый урахус, при котором существует сообщение между мочевым пузырем и пупком. Следующая категория (b) относится к пуповине, в которой урахус открывается в пупок. Здесь часто присутствует дренаж из пупка. Третья категория (c) — это пузырно-урахальный дивертикул, при котором урахус имеет широкое открытое отверстие в мочевой пузырь.При этом типе часто упоминаются жалобы на мочеиспускание. Последняя категория (d) — это киста ураха, в которой урахус включает кистоподобную структуру в пределах своей длины; это последнее болезненное состояние, киста ураха, становится заметной при инфицировании или разрыве кисты [8, 9]. Недавний отчет показал, что у детей больше шансов иметь инфицированную кисту урахального сустава, в то время как у взрослых вероятность инфицирования урахального синуса выше [7].

Рисунок 4

Типы урахальных аномалий: (а) открытый урахус, (б) урахальный синус, (в) дивертикул ураха, (г) киста ураха.

Приобретенные болезни включают воспаление и новообразование. Воспаление чаще встречается у детей и молодых людей: инфицированные урахальные кисты с дебютом после пятого десятилетия встречаются довольно редко [10, 11], хотя отдельные случаи урахального рака в подростковом возрасте были зарегистрированы на встрече Американской академии педиатрии в 2007 году. Насколько нам известно, не было установлено никакой связи между остатками урахала в детстве и урахальной карциномой в более позднем возрасте [12].

Злокачественная дегенерация урахальных остатков чаще встречается у людей среднего и пожилого возраста [6] и имеет клиническое течение, которое может быть значительно хуже, чем у первичной аденокарциномы мочевого пузыря [13].

Во-первых, по данным Blichert-Toft и Neilson [10], урахальные аномалии редко наблюдаются клинически, только 8 случаев на 40 000 случаев госпитализации в хирургическое отделение. Во-вторых, урахус расположен в клинически тихой области, внебрюшинно в пространстве Ретциуса.Как следствие, возможные симптомы и клинические признаки воспаления, а также опухолей в большинстве случаев неспецифичны, отсрочены или даже отсутствуют.

Воспаление, а также развитие абсцесса могут долгое время оставаться клинически нераспознанными, или их можно рассматривать как острый хирургический живот. Наши пациенты были оценены нашей бригадой висцеральных хирургов при первом обращении, поэтому мы не стали бы отрицать эту сущность, если бы у нас был подозреваемый анамнез и подробное обследование. Пациенты могут жаловаться на симптомы мочеиспускания, такие как надлобковая боль, дизурия и / или периодические эпизоды задержки мочи [14, 15].Общие признаки воспаления (например, повышенная скорость оседания, лейкоцитоз и лихорадка) могут отсутствовать. В общем анализе мочи бактериурия и пиурия отсутствуют более чем в 80% случаев, а посев мочи в большинстве случаев отрицательный [14, 15]. Как следствие, если не происходит дренаж в пупок или мочевой пузырь, довольно часто подозреваются другие заболевания, такие как дивертикул Меккеля, острый простатит, острый аппендицит, рецидивирующие инфекции мочевыводящих путей или абдоминальные колики неизвестного происхождения [14, 15].Хотя инфицирование культи пуповины встречается редко, ее потенциальные последствия, такие как целлюлит, некротический фасциит, перитонит, множественный абсцесс печени, сепсис и возможный забрюшинный абсцесс, могут быть фатальными [16, 17].

Урахальные поражения лучше визуализируются с помощью УЗИ и КТ, чем с помощью любых других методов изображения. Демонстрация абсцесса во внебрюшинном жировом пространстве брюшной стенки и его распространения на пупок с пупочными выделениями или без них является ключом к диагностике урахального абсцесса [18].И УЗИ, и КТ могут использоваться для проведения тонкоигольной аспирационной биопсии [19].

УЗИ обычно достаточно для диагностики инфицированного урахального остатка. Cacciarelli и др. . описали эллиптическую гипоэхогенную структуру в середине передневерхней поверхности мочевого пузыря [20]. УЗИ показало более высокую диагностическую точность, чем КТ, и последняя имеет дополнительный недостаток радиационного облучения. Поэтому мы рекомендуем УЗИ в качестве первого диагностического инструмента в детской возрастной группе.Если это исследование не дает результатов, компьютерная томография может использоваться в качестве второго метода или при подозрении на злокачественное новообразование. Даже сложные методы, такие как УЗИ и КТ, не позволяют дифференцировать воспалительные и опухолевые поражения. Абсцессы могут иметь твердый вид на УЗИ [21–23], а также значения ослабления выше, чем у воды на КТ, таким образом имитируя новообразование [21–23]. С другой стороны, опухоли могут показывать на КТ гиподенсированные центральные области из-за некроза, кровоизлияния или слизистого содержимого, так что полученные в результате признаки могут имитировать воспалительную массу [24].Что касается воспалительных заболеваний урахуса, наиболее распространенными возбудителями инфекции являются E. coli и Proteus , но также можно найти множество других патогенов, включая Staphylococcus aureus Bacteroides Fusobacterium idans и [11, 14, 15]. Редко он является вторичным по отношению к Actinomycosis [23], Aspergillus или Tinea corporis . Иногда хронический воспалительный процесс может привести к необычной форме ксантогранулематозного урахита [22].

Дифференциальный диагноз урахального абсцесса должен включать целлюлит, некротический фасциит, перитонит, острый аппендицит, гематому, вентральную или пупочную грыжу и опухолевые поражения, особенно если они развиваются в брюшную стенку [25].

В описанных случаях первым диагнозом при поступлении был перитонит. Однако важно думать об остатках урахальных образований, когда другого происхождения не обнаружено, особенно у молодых пациентов.

Лечение симптоматических остатков урахала зависит от возраста пациента, когда болезнь впервые была обнаружена.Как правило, в детском возрасте следует избегать хирургического вмешательства для пациентов младше одного года, потому что остаток может исчезнуть самопроизвольно. Хирургическая резекция должна быть ограничена пациентами старше одного года с множественными симптомами. Следовательно, только в нескольких случаях требуется хирургическая резекция. Кроме того, большинству пациентов с бессимптомными остатками урахала не требуется регулярное наблюдение. В бессимптомных случаях нет необходимости в постоянном наблюдении с периодическими ультразвуковыми исследованиями [26].

Однако лечение инфекционных урахальных остатков во взрослом возрасте должно включать антибактериальную терапию при острой инфекции с последующим первичным или вторичным иссечением после дренирования полости абсцесса. Blichert-Toft и Nielson [10, 27–29] сообщили, что до 31% инфицированных кист рецидивировали, если их не удалить при отсутствии инфекции; Наиболее щадящим послеоперационным течением является иссечение кисты урахаля. Обычно рекомендуется иссекать все остатки урахаля, чтобы избежать рецидива заболевания, как это произошло в нашем третьем представлении пациента, и из-за возможной злокачественной трансформации в более позднем возрасте [30].Однако при наличии инфекции наиболее эффективным хирургическим вариантом может быть предоперационное чрескожное дренирование и последующее плановое иссечение. Хотя состояние четко не определено, возможность аденокарциномы в не полностью удаленном образце привела к практике радикального иссечения урахального остатка. Радикальное иссечение требует удаления всех структур внутри пупочно-пузырной фасции [10, 27, 28]; включая урахус и каждую медиальную пупочную связку, а также связанную брюшину от пупка до купола мочевого пузыря.В отношении доброкачественных образований, которые не сообщаются с пупком или мочевым пузырем, нет единого мнения о том, следует ли резектировать пупок и манжету мочевого пузыря в плановом порядке [27–29, 31]. В большинстве сообщений об удалении кисты урахаля [27, 28, 32] не упоминается резекция пуповины [28, 32, 33].

Традиционное хирургическое иссечение урахального остатка включает поперечный или срединный инфра-пупочный разрез. Чтобы свести к минимуму осложнения хирургического вмешательства (например, послеоперационную боль и длительное выздоровление), лапароскопический доступ для резекции ураха был впервые представлен Trondsen et al .[30] С тех пор некоторые другие команды опубликовали серию лапароскопических доступов [27, 28, 31, 34–36].

Каждый случай был технически осуществимым с приемлемым временем операции, но количественной оценки исхода и заболеваемости не проводилось [33, 37]. Используя три или четыре троакара диаметром 12 мм или меньше, мы придерживались основных хирургических принципов хирургии ураха в каждом случае [33], таких как использование медиальной пупочной связки с манжетой мочевого пузыря или без нее. Этот метод имеет много преимуществ, например, короткую продолжительность пребывания в больнице (2.75 дней) и кратковременное восстановление со средним возвращением к нормальной активности через 11 дней [33, 37].