Синергический эффект: СИНЕРГИЯ, СИНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ — это… Что такое СИНЕРГИЯ, СИНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ?

Телевизор LG SIGNATURE OLED TV W — воплощение девиза «меньше значит больше» и зримое доказательство, что форм-фактор «изображение на стене» не прихоть, а единственно возможный вариант для техники такого уровня. В ультрапремиальном телевизоре все оказалось «ультра»: ошеломляющая тонкость панели (менее 2,57 мм — тоньше смартфона), специально разработанное плоское магнитное крепление на стену, идеально черный цвет и поистине безграничная контрастность (все благодаря OLED-матрице с самоподсвечивающимися пикселями), поддержка самых актуальных HDR-форматов видео, включая Dolby Vision, HDR10 и HLG, звук Dolby Atmos, и даже операционная система платформы Smart TV — webOS 3.5, сбалансированная и простая для освоения.

1 + 1 > 2

Как и положено ультрапремиальной технике, LG SIGNATURE совмещает передовые технологии и превосходный дизайн в актуальной минималистской стилистике. Но компания не зря ставила перед собой задачу изменить представление потребителей о премиум-классе. Качество примененных технологий и блестящие дизайнерские находки, воплотившись в технике, породили настоящий синергический эффект: продукты линейки оказались в нужной мере премиальными и дорогими, ровно в требуемой степени практичными и интуитивно понятными, эстетически безупречными, дополняющими друг друга и выражающими единую философию. Без преувеличения, LG SIGNATURE — устройства завтрашнего дня, чудом занесенные в сегодня. Их функционал еще долго будет оставаться передовым, а возможности продолжат впечатлять и радовать.

Продукты бренда LG SIGNATURE уже представлены на российском рынке. Познакомиться с ними можно в Галерее LG SIGNATURE в «Крокус Сити Молл» (1-й этаж, вторая линия, рядом с бутиком U-Boat 17), а также в галерее «Модный сезон» по адресу: Охотный ряд, д. 2.

Синергетический эффект — определение и примеры

Синергетический эффект
Определение: эффекты, когда химические вещества или биологические структуры взаимодействуют, приводя к общему эффекту, большему, чем сумма индивидуальных эффектов любого из них.

Определение синергетических эффектов

Синергетические эффекты (определение биологии): эффекты, когда химические вещества или биологические структуры взаимодействуют, приводя к общему эффекту, большему, чем сумма индивидуальных эффектов любого из них. Этимология: от греческого «синергизм» , что означает «работать вместе». Сравните: антагонистический эффект.

Синергетические эффекты — это комбинированные эффекты, по крайней мере, двух веществ, оказывающих более значительное воздействие, чем оба они могли бы продемонстрировать сами по себе.

Примеры синергетических эффектов

• Повреждение кожи, вызванное как табачным дымом, так и УФ-излучением, более заметно, чем от одного табачного дыма или только от УФ-излучения.
• «Вулкан пищевой соды», занятие в научном классе — еще один пример. Совместное действие уксуса и нагревания безалкогольного напитка консолидируется, чтобы при смешивании образовывалась серьезная просачивающая эмиссия.
• Как четыреххлористый углерод, так и этанол (этиловый раствор) вредны для печени. При совместном применении они вызывают более серьезные повреждения печени, чем их индивидуальное воздействие на печень.
• Барбитураты при приеме с общими анестетиками, алкоголем (острое употребление), наркотическими анальгетиками (болеутоляющими) и другими седативно-снотворными препаратами могут привести к более серьезным побочным эффектам на центральную нервную систему (ЦНС) (вызывая угнетение ЦНС).
• Токсичность некоторых инсектицидов, особенно пиретрина (из хризантем) и синтетических пиретринов (пиретроидов), может быть многократно увеличена путем добавления соединений, которые сами по себе не являются инсектицидами. Эти синергисты представляют собой сезамин, сезамолин, пиперонилбутоксид, MGK-264 (бициклогептендикарбоксимид) и кунжут. Пиперонилбутоксид, пожалуй, наиболее широко используемый синтетический синергист пиретроидов.
• Когда врачи лечат бактериальные сердечные инфекции ампициллином и гентамицином.Это делается на том основании, что два противомикробных препарата нацелены на различные части микроорганизмов, и их объединение быстрее убивает микроскопические организмы, тем самым ускоряя выздоровление.
• Лечение рака представляет собой еще один пример синергизма. Больным раком довольно часто назначают как химиотерапию, так и лучевую терапию. Они работают, чтобы остановить рост раковых клеток, воздействуя на различные части процесса репликации.

Синергия и синергизм

Синергия относится к взаимодействию биологических структур или объектов, так что общее воздействие будет больше, чем сумма индивидуальных эффектов.Степень воздействия настолько велика, что не может быть воспроизведена в одиночку. Другой родственный термин — синергизм. Последний используется в фармакологии. Это относится к состоянию, при котором набор лекарств оказывает синергетический эффект, тем самым повышая их эффективность. Этот термин, в основном, связан с понятием, что «целое больше, чем сумма его частей». (Ссылка 1)

Синергия в биологии

В биологии синергия — обычное явление. Это принимает разные формы. Например, в экологии это может быть симбиоз, например.грамм. по кооперации, тунеядство, и т. д. . Это также может подразумеваться как коэволюция в эволюционной биологии. В биохимическом мире синергизм проявляется в виде комбинированного действия веществ, например, лекарств. Или, говоря генетически, это может быть форма эпистаза. Итак, давайте посмотрим на синергию в этих различных областях.

Синергия в экологии

Сотрудничество , вид симбиоза, представляет собой экологическую синергию, при которой отдельные члены ассоциации работают вместе для достижения положительных результатов.Примером этого могут быть семьи муравьев и пчел. У этих социальных насекомых есть отличительные роли и касты в своей колонии. Они общаются друг с другом в основном с помощью химических сигналов, улавливаемых их антеннами. Colobopsis explodens , например, демонстрирует интересное поведение, называемое аутотизом. Эти муравьи будут взрывать (отсюда и название) свое тело по желанию, пока оборачиваются вокруг своего врага. Этот суицидальный акт — попытка защитить свое гнездо. Аутотизис также наблюдается у некоторых видов термитов, когда термиты-солдаты разрывают свое тело, чтобы действовать как блокада туннелей, тем самым предотвращая проникновение захватчиков в их гнездо.(Ссылка 2)

Сотрудничество, ведущее к синергизму, также проявляется в колонии хищных видов миксобактерий, Myxococus xanthus . M. xanthus — почвенная бактерия, питающаяся другими бактериями. Вместе они образуют кооперативную охотничью группу (колонию) через почву. При встрече с бактериями они выделяют пищеварительные ферменты. Посредством колоний они могут кормить даже гораздо более крупную добычу и совместно секретировать пищеварительные ферменты, намного больше, чем те, которые производятся по отдельности, что имеет недостаток в том, что они рассеиваются через почву.(Ссылка 1, 3)

Myxococcus xanthus — синергия через сотрудничество. Кредит: Девангам, Microbewiki.kenyon.edu.

Присутствие двух или более видов паразитов в организме хозяина является примером синергии вредителей . Так, например, присутствие двух разных видов паразитических червей может вызвать синергетические побочные эффекты, которые намного сильнее, чем эффекты, вызываемые каждым из них. Следовательно, воздействие коррелирует с плотностью. Это также заметно даже при инфекции.Хозяин, являющийся носителем патогенных бактерий или вирусов, может проявлять или не проявлять симптомы инфекции, поскольку влияние присутствия патогенов будет зависеть от размера патогенов или плотности популяции.

Синергия в эволюционной биологии

Феномен синергии используется в эволюционной биологии в попытке объяснить прогрессирующую эволюцию сложности организмов во времени. Именуемая Гипотезой синергизма , он постулирует, что синергизм служит функциональной основой для эволюции сложных систем в природе, включая человеческие общества.(Ссылка 1). Определенные ассоциации, образованные двумя или более видами, настолько велики, что имеют тенденцию коэволюционировать вместе с течением времени. Например, насекомые и цветы, которые они опыляют, совместно эволюционируют, приобретая черты, которые делали их относительно более сложными, чем их предки, под воздействием давления отбора, присутствующего в их среде.

Синергия в биохимии

Синергия на биомолекулярном уровне проиллюстрирована некоторыми ферментами, работающими вместе, производя синергетические эффекты.На клеточном уровне это демонстрируют определенные гормоны, особенно те, которые участвуют в петле положительной обратной связи. Например, окситоцин постепенно вырабатывается во время родов, чтобы вызвать схватки. По мере высвобождения большего количества окситоцина мышечные сокращения усиливаются, пока новорожденный не будет вытеснен за пределы родовых путей.

В фармакологии лекарственный синергизм возникает, когда эффекты двух или более различных видов лекарств усиливаются при их совместном применении.Их влияние больше, чем их совокупный эффект. Например, препарат А дает эффект 30%, а препарат В — 20%. В сочетании их синергетические эффекты составляют 75%, что больше, чем сумма их независимых эффектов, которая составляет 50%.

Примеры следующие:

• Синергетическое действие пенициллина и аминогликозида на повреждение клеточной стенки определенных грамположительных бактерий
• Комбинированная эффективность аспирина и кофеина в обеспечении большего обезболивания, чем при приеме отдельно
• Пробенецид пролонгирует действие препарата. эффекты пенициллина за счет задержки его почечной экскреции (см.4)

Токсикологическая синергия относится к исследованию антагонистического воздействия синтетических соединений или физических агентов на живые формы жизни. Традиционное значение токсикологии — «изучение токсинов». Токсикологическая совместная энергия вызывает беспокойство у людей в целом и административных организаций, поскольку синтетические вещества, рассматриваемые исключительно как защищенные, представляют собой неприемлемое благополучие или биологическую опасность, когда их вводят в смесь.

Токсичность некоторых инсектицидов может быть увеличена в несколько раз за счет присутствия других соединений, которые не являются инсектицидами, per se . Именуемые как синергисты , соединения, такие как пиперонилбутоксид, сезамин, сезамолин, бициклогептендикарбоксимид и сезамекс, усиливают инсектицидную активность пиретрина. (Ссылка 5)

Синергия в генетике

Эпистаз относится к взаимодействию генов в двух или более локусах. Вместе они образуют фенотипическое выражение другого гена.Термин синергетический эпистаз относится к типу эпистаза, при котором влияние двух мутаций на приспособленность больше, чем то, что они могли бы вызвать в одиночку.

Попробуйте ответить на приведенный ниже тест, чтобы проверить, что вы узнали о синергетических эффектах.

Синергетический эффект — обзор

28.5.2.3 Синергетическое тепловое, тепловое циклическое и радиационное воздействие на тефлон без покрытия и с покрытием FEP

Синергетические эффекты между радиационным и тепловым циклом наблюдались для материалов космических аппаратов при наземных испытаниях и в космосе.В одном из испытаний было обнаружено, что термоциклирование вызывает отслоение и растрескивание защитных оксидных покрытий на FEP (Dever and de Groh, 2002). В этом исследовании исследованные покрытия включали SiO _x (где x ~ 2) и покрытие, состоящее из чередующихся слоев SiO ₂ , TiO ₂ и Ta ₂ O ₃ , разработанное OCLI. Образцы подвергались воздействию 5 кГр электронного излучения с энергией 1 МэВ с последующим термоциклированием, номинально от -115 ° C до + 90 ° C. В то время как некоторые образцы с покрытием OCLI, которые не подвергались воздействию излучения и термоциклирования, демонстрировали признаки незначительных проблем с адгезией покрытия, таких как растрескивание и потеря покрытия в изогнутых областях, отслаивание и расслоение наблюдались только для образцов, которые подвергались термоциклированию после излучения. .Пример влияния электронного излучения и термоциклирования на OCLI / FEP показан на рис. 28.22. Было обнаружено, что серьезность отслоения и отслаивания хуже для более толстых покрытий.

Рисунок 28.22. Образец FEP толщиной 2 мил с оксидным покрытием OCLI (общая толщина покрытия в диапазоне 700–1400 нм) после воздействия электронного излучения и термоциклирования. Темные области указывают на участки, на которых отсутствует покрытие.

Внешний слой многослойных изоляционных покрытий на HST, покрытый VDA толщиной 127 мкм, стал охрупчиваться, что привело к серьезному растрескиванию на орбите, как показано на рис.28.23 (Townsend et al., 1999a). Образец FEP, полученный во время второй сервисной миссии (SM2) после 6,8 лет в космосе, был значительно более хрупким, чем FEP такой же толщины, полученный во время третьей сервисной миссии (SM3A) после 9,7 лет в космосе. Одним из различий в воздействии окружающей среды между этими образцами было максимальное температурное воздействие во время термоциклирования. Извлеченная изоляционная секция SM2 изогнулась после растрескивания, обнажая алюминий задней поверхности с более низким коэффициентом излучения в космос.Было подсчитано, что этот чрезвычайно хрупкий кусок изоляции достиг примерно 200 ° C на орбите, что на 150 ° C выше, чем предельная номинальная температура (от -100 ° C до + 50 ° C для FEP, облицованного солнечными батареями на HST). Наблюдательный совет, который исследовал серьезную деградацию FEP на HST, пришел к выводу, что электронное и протонное излучение в сочетании с термоциклированием на орбите было необходимо, чтобы вызвать наблюдаемое растрескивание FEP на HST в областях концентрации напряжений (Townsend et al., 1999a). Было проведено несколько исследований для изучения факторов космической среды, ответственных за деградацию FEP на HST, включая изучение комбинированного воздействия излучения и температурного или температурного цикла.

Рисунок 28.23. Большие трещины во внешнем слое MLI, обращенного к солнцу, на HST, наблюдаемые во время SM2, после 6,8 лет пребывания в космосе (Townsend et al., 1999a).

В одном исследовании изучались различия в деградации, вызванной космической средой и наземными испытаниями, предназначенными для воспроизведения условий воздействия FEP на HST (Townsend et al., 1998). Образцы пленки FEP 127 мкм подвергались воздействию электронов с энергией 0,5 МэВ и протонов с энергией 1 МэВ, чтобы получить флюенсы, эквивалентные флюенсам при различных длительностях воздействия HST до 20 лет.За этим радиационным воздействием последовали термоциклирование в диапазоне температур от -100 ° C до + 50 ° C, номинального диапазона для внешнего слоя теплоизоляции FEP на HST. Термоциклирование проводили в камере, продуваемой азотом, с номинальной скоростью четыре цикла в минуту. Влияние этих воздействий по сравнению с воздействиями HST на силу и удлинение FEP показано на рис. 28.24. Очевидно, что лабораторные испытания серьезно недооценили деградацию на орбите, вызванную воздействием FEP на HST, даже на 3.6 лет, где для аналогичной деградации потребовалось лабораторное облучение, эквивалентное 20-40 годам пребывания в космосе. Точка данных для SM2 (6,8 года) на рис. 28.24, почти нулевое удлинение, показана для справки; однако, как описано выше, этот образец FEP подвергался воздействию верхнего предела температуры ~ 200 ° C, что намного выше, чем у номинальных материалов FEP на HST, которые достигают 50 ° C.

Рисунок 28.24. Излучение заряженных частиц и излучение с последовательными термоциклическими воздействиями на механические свойства 5-миллиметрового тефлона FEP по сравнению с FEP, полученным из HST во время SM1 (3.6 лет в космосе) и во время SM2 (6,8 лет в космосе): (A) предел прочности при растяжении; (B) удлинение при разрыве.

Были проведены исследования по определению воздействия нагрева на облученный FEP, чтобы лучше понять влияние температуры на скорость разрушения и на механизм разрушения изоляции FEP в окружающей среде LEO. В одном исследовании образцы первичного FEP, FEP, облученного рентгеновским излучением, и FEP, извлеченные из HST, нагревали от 50 ° C до 200 ° C с интервалами 25 ° C в высоковакуумной печи и оценивали на предмет изменений свойств растяжения и плотность (де Гро и Мартин, 2002).Несмотря на то, что наземное лабораторное рентгеновское облучение (проводимое при комнатной температуре) обеспечило площадную дозу ( D , полная энергия, поглощенная на единицу площади, интегрированная по всей толщине в FEP), которая была на порядки выше, чем HST на- орбитальной площадной дозы, она не вызвала степени повреждения, наблюдаемой для FEP, подвергшегося воздействию HST. Однако лабораторное воздействие обеспечило достаточную деградацию, чтобы показать влияние последующего нагрева на облученный FEP. Это исследование показало, что нагревание не приводит к охрупчиванию необлученного тефлона FEP; однако наблюдалась значительная зависимость охрупчивания облученного FEP от температуры нагрева с почти полной потерей удлинения при разрушении при 100 ° C и выше.Эти результаты показаны на рис. 28.25.

Рисунок 28.25. Процентное удлинение при разрушении исходной, наземной лабораторной рентгеновской облученной и полученной HST FEP в зависимости от температуры термообработки в вакууме.

Участок извлеченных термозащитных экранов HST bistem (BSTS), которые подверглись воздействию космоса 8,25 года, был проанализирован de Groh et al. (2008) за экологическую устойчивость космоса. Экраны состояли из колец толщиной 2 мил (0,051 мм) из фторированного этиленпропилена и алюминизированного тефлона (Al-FEP), сплавленных вместе в форму круглого сильфона.Поскольку круглые тепловые экраны имели солнечные, антисолнечные и скользящие поверхности и находились в космической среде в течение длительного времени, они предоставили уникальную возможность изучить влияние солнца на экологическую деградацию Al-FEP. Испытания на растяжение подтвердили, что поверхности, почти обращенные к солнечному свету, потеряли свою механическую прочность и эластичность, в то время как антисолнечные поверхности сохранили свою пластичность. Полярный график удлинения при разрыве в зависимости от солнечного угла для восстановленных образцов сварного шва HST BSTS на растяжение представлен на рис.28,26. Исследование показывает пагубное влияние солнечного воздействия на изоляцию FEP в космической среде. Антисолнечные поверхности испытали лишь незначительную деградацию в космосе, но солнечные поверхности испытали серьезную деградацию из-за дополнительного радиационного воздействия (мягкое рентгеновское излучение и УФ-излучение) в сочетании с повышенным нагревом на орбите для обращенных к Солнцу поверхностей.

Рисунок 28.26. Относительное удлинение при разрыве (%) извлеченных образцов HST BSTS в зависимости от солнечного угла (de Groh et al., 2008).

Тефлоновые образцы FEP на растяжение показали аналогичную деградацию окружающей среды после 1,5 лет пребывания в космосе в рамках миссии MISSE 7 (de Groh et al., 2016). На рис. 28.27 представлены графики процентного удлинения при разрыве в зависимости от солнечного воздействия в эквивалентных солнечных часах (ESH) для образцов из алюминированного тефлона FEP с задней поверхностью (Al-FEP, толщиной 2 мил). Образцы, разрезанные как параллельно направлению валков, так и перпендикулярно направлению валков, были пролетены и испытаны. Эти графики, как и данные HST, подчеркивают влияние солнечного излучения на охрупчивание тефлонового FEP в космосе, поскольку существует четкая корреляция уменьшения удлинения и, следовательно, охрупчивания с увеличением солнечного воздействия.Опять же, это связано как с увеличением общей дозы солнечного излучения, так и / или с увеличением солнечного нагрева для более высоких солнечных воздействий (de Groh et al., 2016).

Рисунок 28.27. Относительное удлинение при разрыве (% E) по сравнению с ESH для образцов MISSE 7 Al-FEP, сеченных параллельно направлению прокатки (пунктирная линия) и перпендикулярно направлению прокатки (сплошная линия) (de Groh et al., 2016).

Это и другие исследования (de Groh et al., 2001) подтверждают вывод о том, что радиационно-индуцированный разрыв цепи (солнечное, рентгеновское излучение, излучение частиц) является основным механизмом охрупчивания FEP на HST, и указывают на то, что существенное влияние температуры на орбите УЭП на его деградацию в космической среде.

В одном исследовании были изучены материалы-кандидаты для замены разрушающегося внешнего слоя алюминизированного FEP на HST. Рассмотренные кандидатные материалы указаны в таблице 28.7. Различные наборы этих материалов-кандидатов на замену подвергались воздействию комбинаций электронного / протонного излучения, атомарного кислорода, мягкого рентгеновского излучения, термоциклирования и ближнего УФ-излучения на различных объектах, чтобы оценить их долговечность на орбите HST (de Groh et al. al., 1998; Townsend et al., 1999b). Два набора образцов (B1 и M2), предварительно подвергнутые облучению заряженными частицами, подвергались мягкому рентгеновскому излучению, а один набор образцов (B1) также подвергался термоциклированию под нагрузкой.Температуры термоциклирования находились в диапазоне от -100 ° C до + 50 ° C, а нагрузка пружины обеспечивала напряжение на каждом образце приблизительно 12,4 МПа. Образцы прошли 1000 термических циклов. Образцы, подвергшиеся термоциклированию, показаны на рис. 28.28. Металлизированные образцы FEP B1.2 и B1.4 толщиной 5 мил, показанные на рис. 28.28A, с холстом из стекловолокна и подложками из каптона, разорвались пополам во время термоциклирования под нагрузкой (de Groh et al., 1998). Это может быть связано с низким сопротивлением каптона разрыву. Эти образцы показали худшие результаты, чем образец B1.8, показанный на рис. 28.28B, материал HST MLI (алюминизированный FEP толщиной 5 мил), который разорвал около 90% ширины во время термоциклирования. Распространение разрыва образцов B1 было связано с термоциклированием под высокой нагрузкой. Предыдущее радиационное облучение, по-видимому, не оказало дополнительного эффекта на разрыв, и разрыв не произошел из-за циклической механической нагрузки. После оценки всех результатов испытаний холст толщиной 5 мил FEP / Al / адгезив / Nomex был рекомендован в качестве материала для замены внешнего теплового покрывного слоя для HST (Townsend et al., 1999b).

Таблица 28.7. Материалы-кандидаты на замену HST Thermal Control

Рисунок 28.28. Кандидат HST MLI под напряжением в установке быстрого термоциклирования после 1000 тепловых циклов.(A) образцы B1.1-B1.4 и (B) образцы B1.5-B1.8.

Наземные испытания на устойчивость к окружающей среде, такие как те, которые обсуждались в Townsend et al. (1998), указывают, что экспонирование материалов в ходе ускоренных испытаний моделями окружающей среды предсказало экспозицию космических аппаратов УФ и / или источниками ионизирующего излучения, не моделируя степень ущерба, который происходит в космической среде. Один из подходов к преодолению трудностей при моделировании космической среды с использованием наземных испытаний заключается в калибровке объекта с использованием данных из реальных материалов, подвергшихся воздействию космического пространства, для определения уровней воздействия, необходимых для воспроизведения ухудшенных свойств, наблюдаемых в космосе.de Groh et al. (2003) описывает метод корреляции земля-космос, который использует многоступенчатый процесс для определения долговечности вспененного политетрафторэтилена (ePTFE) для приложений Международной космической станции (МКС), основанный на наземном рентгеновском облучении и тепловом воздействии, которое имитирует объемное охрупчивание, которое имеет место в теплоизоляции FEP, покрывающей HST. Этот метод был разработан, чтобы повредить заднюю поверхность ePTFE эквивалентной толщины до того же количества разрывающего повреждения, которое произошло в HST FEP (на основе данных о удлинении), а затем скорректировать различия в ионизирующем излучении при наземных испытаниях по сравнению с эффектами космического излучения. , колебания температуры, изменения окружающей среды космического ионизирующего излучения (высота, наклон и продолжительность космического корабля) и изменения толщины.

Что такое синергетический эффект?

Что означает синергетический эффект?

Синергетический эффект — это результат взаимодействия двух или более процессов, которые производят эффект, превышающий совокупный эффект, который эти процессы производят при использовании по отдельности. Эта концепция является важным фактором в области охраны труда и техники безопасности, когда на рабочем месте присутствует множество опасностей.

Две опасности сами по себе могут представлять приемлемый риск; однако, если они синергетичны друг с другом, уровень риска, который они представляют, может возрасти до неприемлемого уровня.Пределы профессионального воздействия для данной опасности могут быть неприемлемыми, если химическое вещество используется вместе с другой опасностью, которая усугубляет его негативное воздействие. Синергетические эффекты также могут возникать между опасностями, которым сотрудник подвергается по отдельности, но которые имеют длительное воздействие на организм.

Safeopedia объясняет синергетический эффект

«Синергетический эффект» относится к двум или более опасностям, имеющим мультипликативный эффект на уровень риска, который они представляют для здоровья и безопасности работников при совместном использовании.Синергетические эффекты контрастируют с аддитивными эффектами, когда эффект двух или более веществ, используемых вместе, равен сумме этих веществ, используемых по отдельности, и с антагонизмом, когда эффект двух или более веществ, используемых вместе, меньше, чем эффект двух вещества используются отдельно.

Потенциальные эффекты связаны с синергетическими эффектами. Потенцирование относится к веществу, которое само по себе не оказывает отрицательного воздействия, но может значительно усилить отрицательный эффект другого вещества.Некоторые источники считают потенцирование видом синергизма.

Эксперты по безопасности и гигиене труда рекомендуют минимизировать профессиональное воздействие опасностей в максимально возможной степени, поскольку пределы профессионального воздействия не учитывают потенциальные синергетические воздействия. Например, пределы воздействия асбеста и дочернего радона не учитывают тот факт, что воздействие этих веществ гораздо более опасно для курильщиков сигарет, чем некурящих, из-за синергизма.Паспорта безопасности (SDS), используемые для химических смесей –, учитывают синергетические эффекты и описывают комбинированные опасности от всех компонентов в смеси; однако они не рассматривают потенциальный синергизм с другими опасностями на рабочем месте. Синергетические эффекты могут также включать физические явления; Существуют важные индикаторы того, что химические вещества, связанные с потерей слуха (ототоксины), могут синергетически усугубляться воздействием шума.

Последние новости о раке

Медицина (Каунас).2019 Apr; 55 (4): 110.

В 2011 году сообщалось, что гераниол эффективен для уменьшения объема опухоли (на 70% по сравнению с контролем), воздействует на клеточный цикл и пути апоптоза, а также повышает химиочувствительность к доцетакселу.Это эфирное масло было связано с доцетакселом или таксотером в ксенотрансплантатной мышиной модели клеток рака предстательной железы PC-3 [64]. Клетки устойчивой к платине линии клеток рака яичников A2780 / CP70 обрабатывали β-элеменом, сесквитерпеном, полученным из различных растений, плюс таксан, что приводило к значительному снижению жизнеспособности клеток и усилению апоптоза клеток [65]. Более того, β-элемен заметно ингибировал рост и пролиферацию клеток и увеличивал цитотоксичность цисплатина в клетках рака мочевого пузыря 5637 и Т-24 человека.Он также увеличивал чувствительность к цисплатину и усиливал цитотоксичность цисплатина в клеточных моделях in vitro (таких как рак мозга, шейки матки, груди, колоректального рака, яичников и мелкоклеточный рак легкого) [65,66]. Эвгенол — это эфирное масло, получаемое из гвоздики, мускатного ореха, корицы, базилика и лаврового листа, а сульфорафан — это соединение, получаемое из овощей семейства крестоцветных, таких как брокколи, брюссельская капуста или капуста. Оба были протестированы вместе с гемцитабином на клетках рака шейки матки HeLa и не показали значительного увеличения гибели клеток, что указывает на то, что цитотоксичность клеток была пропорциональна только гемцитабину [67].Более того, цисплатин в сочетании с метилэвгенолом значительно усиливал противоопухолевую активность препарата против клеток HeLa, воздействуя на индукцию апоптоза клеток, активность каспазы-3, остановку клеточного цикла и потерю потенциала митохондриальной мембраны [68]. β-кариофиллен, сесквитерпен, присутствующий в эфирных маслах различных растений, и паклитаксел были протестированы на линиях опухолевых клеток MCF-7 (клетки груди человека), DLD-1 (клетки толстой кишки человека) и L-929 (фибробласты мыши). β-кариофиллен усиливал противоопухолевую активность паклитаксела в этих клеточных линиях, вероятно, облегчая прохождение паклитаксела через плазматическую мембрану [69].β-кариофилленоксид был также объединен с доксорубицином в 2 клеточных линиях рака яичников (чувствительный A2780 и частично резистентный SKOV3) и 2 клеточных линиях рака лимфобластов (чувствительный CCRF / CEM и полностью резистентный CEM / ADR) [70]. Авторы утверждали, что доксорубицин действует синергетически с β-кариофилленоксидом в клетках SKOV3 и CCRF / CEM, в то время как на клетки, устойчивые к CEM / ADR, заметного эффекта не наблюдалось. Подобно предыдущей работе, β-кариофиллен и β-кариофилленоксид были оценены на предмет их потенциальных хемосенсибилизирующих свойств в линиях раковых клеток Caco-2, CCRF / CEM и CEM / ADR5000 в сочетании с доксорубицином [70].В исследовании сообщается, что оба сесквитерпена влияют на функцию насоса ABC, повышая цитотоксичность доксорубицина за счет увеличения его внутриклеточного накопления и статуса окислительного стресса. Кроме того, d-лимонен, циклический терпен, коммерчески полученный из цитрусовых, был использован в карциноме предстательной железы человека DU-145 и нормальных эпителиальных клетках предстательной железы PZ-HPV-7 в комбинации с доцетакселом. Синергетические эффекты привели к генерации более активных форм кислорода (АФК), истощению глутатиона и увеличению активности каспаз [71].Тимохинон, входящий в состав эфирного масла Nigella sativa , был изучен в отношении его связи с доксорубицином на человеческих клетках лейкемии HL-60, меланомы 518A2, толстой кишки HT-29, шейки матки KB-V1 и карциномы молочной железы MCF-7. Тимохинон улучшает противоопухолевые свойства доксорубицина, подавляя рост раковых клеток [72]. Тимохинон также был объединен с паклитакселом для изучения генетических сетей, участвующих в их действиях, с использованием панелей цепной реакции белков (ПЦР), ориентированных на пути в реальном времени, которые исследовали апоптоз, пролиферацию клеток, активность факторов роста и активность цитокинов [73].Работа доказала, что в трижды отрицательных клетках рака молочной железы тимохинон вызывает цитотоксичность и увеличение апоптоза и ингибирование заживления ран, помимо сенсибилизации раковых клеток к паклитакселу посредством внешнего апоптоза, генов-супрессоров опухолей и передачи сигналов р53. Синергетические эффекты были продемонстрированы на моделях рака груди у мышей, поскольку рост раковых клеток уменьшился. Кроме того, тимохинон был связан с доцетакселом в клетках рака предстательной железы, устойчивых к гормонам и лекарствам DU-145, вызывая значительную синергетическую цитотоксичность и апоптоз через сигнальный путь PI3K / Akt [74].Точно так же тимохинон усиливал цитотоксичность, вызванную цисплатином и доцетакселом, в двух трижды отрицательных клеточных линиях рака молочной железы (с мутантным p53) [75], что еще раз подчеркивает синергетические эффекты тимохинона. В двух независимых работах одной и той же группы использовались резистентные к иринотекану (CPT-11) раковые клетки толстой кишки LoVo для изучения эффектов тимохинона, и обе продемонстрировали, что это фитохимическое вещество может модулировать JNK (c-Jun N-концевую киназу) и пути p38, влияющие на ERK1. / 2, PI3K или проницаемость внешней мембраны митохондрий и процесс аутофагии [76,77].Также топотекан использовался в сочетании с тимохиноном при лечении клеток острого миелогенного лейкоза. Комбинированный режим (который был лучше с предварительным воздействием) уменьшал пролиферацию клеток с увеличением уровней экспрессии Bax / Bcl2, p53 и каспаз-3 и -9 [78]. Точно так же в клетках колоректального рака человека тимохинон синергетически увеличивал эффективность топотекана с p53- и Bax / Bcl2-независимыми механизмами, уменьшая пролиферацию и снижая цитотоксичность [79].

6.1.2. Производные полифенолов

Полифенолы — это природные вещества, характеризующиеся наличием множества структурных единиц фенола, способных модулировать окислительный стресс в раковых клетках [80].Большое количество исследований изучали противоопухолевые эффекты растительных продуктов в сочетании с обычными химиотерапевтическими препаратами. Этот обзор был посвящен наиболее распространенным полифенолам, описанным в литературе, таким как ресвератрол, генистеин, куркумин и кверцетин.

В клеточных моделях острого миелоидного лейкоза ресвератрол (стильбен, который присутствует в винограде, вине, арахисе, сое и многих других продуктах) [81] индуцировал остановку роста клеток и апоптотическую гибель при резистентном к доксорубицину AML (Acute Myeloid Leukemia ) клеток и подавление экспрессии MRP1 ( ABCC1 ген, кодирующий переносчик ABC).Были использованы три резистентные к доксорубицину линии клеток AML (AML-2 / DX30, AML-2 / DX100, AML-2 / DX300), k предполагая, что ресвератрол может преодолевать резистентность к доксорубицину или сенсибилизировать резистентные к доксорубицину клетки AML к антилейкемическим агентам [82] . Кроме того, ресвератрол подавлял пролиферацию нескольких клеточных линий миеломы человека и усиливал апоптотические эффекты бортезомиба и талидомида [83,84].

Генистеин (фитоэстроген, содержащийся в семенах Glycine soja ) был протестирован в многочисленных работах [85].Его синергическая комбинация с цисплатином была оценена с камптотецином в двух линиях раковых клеток человека (HeLa и OAW-42) [86,87], с гемцитабином в двух мышиных ксенотрансплантатах клеток карциномы поджелудочной железы человека (COLO 357 и L3.6pl) [88] и с гидроксикамптотецином в мышиных ксенотрансплантатах клеток карциномы мочевого пузыря человека (TCC-SUP) [89]. Более того, микроэлементы, минеральные селен (Se) и генистеин вместе с традиционными лекарствами цисплатином и митомицином C были использованы в периферических лимфоцитах человека, используемых против апоптоза, индуцированного цитотоксическими агентами, что подчеркивает защитную роль Se и генистеина в клетках крови [90].

Куркумин, полученный из корневищ Curcuma longa (куркума), имеет долгую историю использования, и его противораковый потенциал [91,92] был исследован на клетках глиомы человека (T98G, U87MG и T67) и крысы (C6). линий. Было продемонстрировано, что куркумин способен подавлять рост и химиорезистентность, вызванную химиотерапевтическими агентами (цисплатин, этопозид, камптотецин и доксорубицин) и радиацией [93]. Кроме того, в клетках карциномы яичников человека куркумин, связанный с цисплатином или оксалиплатином, увеличивает чувствительность резистентных клеток рака яичников к лекарствам как в клетках дикого типа, так и в клетках, устойчивых к цисплатину, вызывая снижение клеточного цикла и усиление апоптоза [94].Кроме того, куркумин подавлял рост линии клеток рака толстой кишки человека HT-29 при синергической обработке 5-фторурацилом [95]. В клетках MDA-MB-231 (высокометастатические клетки рака молочной железы) куркумин, связанный с иксабепилоном, цисплатином, винорелбином или эверолимусом, показал остановку клеточного цикла, снижение жизнеспособности клеток и индукцию апоптоза [96]. Клетки рака молочной железы, устойчивые к паклитакселу, и модель ксенотрансплантата рака молочной железы человека использовали для тестирования синергетических эффектов куркумина и паклитаксела.Результаты показали, что куркумин оказывает терапевтическое действие в предотвращении метастазирования рака груди на доклинической модели путем подавления ядерного фактора каппа B (NF-kB) [97].

Кверцетин, флавонол с множеством полезных свойств, обнаруженных во многих растениях, фруктах и ​​овощах [98], показал синергетические эффекты с цисплатином в клеточной линии злокачественной мезотелиомы человека, с доксорубицином в клеточных линиях нейробластомы и саркомы Юинга, с темозоломидом у человека. линия клеток астроцитомы и доксорубицин при установленном раке груди у мышей [99,100,101,102].

6.2. Биохимические производные растений

Помимо эфирного масла и производных полифенолов, многие другие растительные соединения или сложные смеси могут проявлять синергетические противораковые свойства, связанные с обычными химиотерапевтическими препаратами. Например, l-канаванин, антиметаболит, обнаруженный в нескольких растениях семейства Fabaceae , который вряд ли токсичен сам по себе, усиливал цитотоксичность винбластина и паклитаксела в двухклеточных моделях (HeLa и клетки гепатоцеллюлярной карциномы) [103].Более того, в модели ортотопического рака поджелудочной железы на мышах с клетками PANC-1 обогащенный бета-карболином (алкалоид из растения Rauwolfia vomitoria ) экстракт в сочетании с гемцитабином снижал опухолевую нагрузку и метастатический потенциал в невосприимчивой к гемцитабину опухоли [104 ]. То же растение, Rauwolfia vomitoria , в сочетании с карбоплатином, было способно повышать химиочувствительность в клетках рака яичников (OVCAR-5, OVCAR-8, SHIN-3) и подавлять рост опухоли на модели мышей с внутрибрюшинными метастазами и массивными метастазами. образование асцита [105]. Бензофеноны гарцинии (полученные из видов гарцинии ) были протестированы на раковых клетках толстой кишки HT29 в сочетании с различными химиопрофилактическими агентами и продемонстрировали большую способность блокировать рост раковых клеток [106]. Другая работа показала, что экстракт красной свеклы ( Beta vulgaris ) вместе с доксорубицином вызывал синергетический антипролиферативный эффект против опухолевых клеток поджелудочной железы (PaCa), груди (MCF-7) и простаты (PC-3) [107].

7. Заключительные замечания

Фитомедицина и этнофармакология приобрели большую популярность в последние десятилетия, особенно с учетом их применения в обширной области болезней человека [108,109,110,111,112].Результаты вышеупомянутых литературных исследований позволяют предположить, что соединения растительного происхождения оказывают сильное воздействие в качестве терапевтических агентов, как по отдельности, так и в комбинации с обычными лекарственными средствами. Таким образом, фитотерапию, основанную на фактических данных, следует рассматривать как действенный вариант при лечении заболеваний человека, не только при заболеваниях легкой или легкой степени, но также и при более сложных и проблемных заболеваниях, таких как рак. Конечно, доклинические данные, представленные в этом обзоре, должны быть подтверждены надежными клиническими испытаниями (рандомизированными двойными слепыми), и в этом направлении научных исследований было сообщено о большом количестве клинических испытаний.Действительно, библиографические исследования с использованием ключевых слов «рак и травы» и «рак и растение» привели к получению 78 и 149 исследований на веб-сайте ClinicalTrials.gov (декабрь 2018 г.), даже если они не связаны строго с синергизмом [113]. Это дает нам представление о несомненно растущем интересе к CAM и должно привлечь новое внимание к этой области исследований, которой иногда пренебрегают основные каналы финансирования. Кроме того, следует иметь в виду, что растущее употребление растительных продуктов, которые назначаются самостоятельно или объединяются с обычными лекарствами, в конечном итоге будет способствовать увеличению частоты взаимодействий между растениями и лекарствами.Таким образом, каждый практикующий врач должен знать об этом важном вопросе. Однако, принимая во внимание онкологических больных, существует очевидная необходимость инвестировать в дополнительную клиническую работу по изучению применения лечебных трав, уделяя особое внимание не только предотвращению вредных взаимодействий, но и предоставлению обоснованной поддержки, если научная синергетическая демонстрация гарантирует эффективность. Несомненно, доступная во всем мире бесплатная база данных о взаимодействии лекарственных растений и лекарственных растений не только желательна, но и становится сейчас конкретной потребностью для врачей; необходимость, не имеющая прямого отношения к лечению рака.

Благодарности

Н. Мартинс благодарит Португальский фонд науки и технологий (FCT – Portugal) за стратегический проект исх. UID / BIM / 04293/2013 и «NORTE2020 — Региональная операционная программа до Норте» (NORTE-01-0145-FEDER-000012).

Вклад авторов

Все авторы внесли равный вклад в эту работу. B.S., N.M. и J.S.-R. критически рассмотрели рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

Финансирование

Эта работа частично поддержана CONICYT PIA / APOYO CCTE AFB170007.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Ссылки

Тест на микротитровальном планшете с шахматной доской, тестирующий комбинацию G3KL с PI в P. aeruginosa PAO1 ( A ) и ванкомицина с G3KL в 10 K. NCTC 418. ( B ) Двукратные серийные разведения 2D проводили, начиная с 500 мкг / мл PI , 256 мкг / мл ванкомицина и 8 или 64 мкг / мл G3KL .Жизнеспособность бактерий была выявлена ​​после добавления красителя 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолия (МТТ) (черные лунки). Красный кружок: FIC _i синергетического эффекта; желтые кружки: FIC _i частичной синергии; зеленые кружки: значения МИК G3KL , PI и ванкомицин.

Мы исследовали P. aeruginosa , A. baumannii , E. coli и K. pneumoniae как грамотрицательные бактерии и MRSA как грамположительные бактерии.Сначала мы проверили, может ли эффект пермеабилизации G3KL , наблюдаемый с PI , привести к синергетическому эффекту с этим красителем, который связывается с ДНК и, следовательно, должен препятствовать росту бактерий [44]. При использовании отдельно PI был практически неактивен против грамотрицательных бактерий, но показал умеренную активность против MRSA (устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus ) (). В тесте шахматной доски мы наблюдали частичный синергетический эффект с G3KL в P.aeruginosa (FIC _i = 0,5, A) в соответствии с нашими предыдущими исследованиями под микроскопом [37]. Частичная синергия также имела место с E. coli (FIC _i = 0,6, рисунок S1) и A. baumannii (FIC _i <0,53, рисунок S2). Эти данные предполагают, что G3KL обеспечивает проницаемость бактериальных мембран ниже своего значения MIC, что способствует проникновению PI .

Таблица 1

Активность G3KL и PMB в сочетании с PI .

В случае K. pneumoniae , ни PI , ни G3KL , ни их комбинация не проявляли активности (рисунок S3). Поскольку G3KL обеспечивает проницаемость K. pneumoniae по отношению к другим антибиотикам (см. Ниже), мы интерпретируем эти данные как указание на то, что PI неактивен в отношении этой бактерии при самой высокой используемой концентрации, даже при наличии проницаемости мембраны.Эффект между PI и G3KL был безразличным в случае MRSA, что указывает на то, что G3KL , который неактивен в отношении этой бактерии, также не увеличивает значительно активность PI против этой бактерии (Рисунок S4).

Для сравнения, полимиксин B ( PMB ), хорошо известный разрушающий мембраны природный антимикробный циклический пептид [45,46], показал частичный синергетический эффект с PI в P. aeruginosa (FIC _i = 0.6, рисунок S5), E. coli (FIC _i = 0,6, рисунок S1), A. baumannii (FIC _i <0,8, рисунок S2) и MRSA (FIC _i = 0,8, Рисунок S4), но продемонстрировал неожиданный антагонистический эффект в случае K. pneumoniae (FIC _i > 4, Рисунок S3), что трудно рационализировать, поскольку известно, что PMB способствует проницаемости этой бактерии [45].

2.2.

Затем мы провели более широкий обзор, чтобы проверить, может ли проницаемость мембраны с помощью G3KL обеспечить синергетический эффект с классическими антибиотиками, используя анализ шахматной доски с использованием P. aeruginosa и K. pneumoniae в качестве грамотрицательных бактерий и MRSA в виде грамма. -положительная бактерия. Мы протестировали ванкомицин [47], эритромицин [48] и триметоприм [49], которые активны в отношении грамположительных бактерий, но неактивны в отношении грамотрицательных бактерий из-за неэффективного поглощения.Мы также протестировали новобиоцин, который наиболее активен против грамположительных бактерий, но проявляет активность против некоторых грамотрицательных патогенных штаммов [50,51], а также антибиотики широкого спектра действия ципрофлоксацин [52], хлорамфеникол [53], гентамицин [ 54], азитромицин [55], сульфаметоксазол и ампициллин [56].

В случае P. aeruginosa комбинация G3KL с ампициллином не привела к синергическому эффекту (рисунок S6), как ожидалось, из-за присутствия в этой бактерии бета-лактамазы AmpC и оттока MexAB-OprM. [57].Мы наблюдали частичный синергизм G3KL в сочетании с ванкомицином (FIC _i = 0,6), хлорамфениколом (FIC _i = 0,6) и азитромицином (FIC _i = 0,5), в соответствии с частичным синергизмом, наблюдаемым с PI (рисунки S6 и S7). Комбинация G3KL с эритромицином или сульфаметоксазолом приводила к аддитивному эффекту (FIC _i = 1, рисунок S7), указывая на то, что в обоих случаях G3KL и антибиотик действуют независимо на свою цель, не мешая друг другу.Безразличный эффект наблюдался между G3KL и новобиоцином, ципрофлоксацином, гентамицином и триметопримом (Рисунки S8 и S9). В целом, отсутствие синергизма отражает то, что концентрация G3KL , необходимая для мембранной проницаемости (1-2 мкг / мл), очень близка к его значению MIC при использовании отдельно (4-8 мкг / мл). Тем не менее, G3KL , как было показано, убивает P. aeruginosa в течение двух часов, разрушая внешнюю мембрану, внутреннюю мембрану и, в конечном итоге, образуя комплекс с некоторыми отрицательно заряженными внутриклеточными компонентами, которые, вероятно, включают ДНК и белки [37].Таким образом, возможно, что G3KL нарушает связывание низкомолекулярных лекарственных средств с такими мишенями, что также будет способствовать отсутствию синергетических эффектов.

В случае K. pneumoniae мы наблюдали сильную синергию между G3KL и ванкомицином (FIC _i <0,3, B), эритромицином (FIC _i <0,3), новобиоцином (FIC _i <0,2), хлорамфеникол (FIC _i <0,5), азитромицин (FIC _i <0.4) и триметоприма (FIC _i <0,5), а также частичный синергизм с антибиотиком широкого спектра действия гентамицином (FIC _i <0,6) (рисунки S10 и S11). Синергетические эффекты между G3KL и ванкомицином, эритромицином или триметопримом особенно поразительны, поскольку эти соединения были неактивны против K. pneumoniae при использовании отдельно. Эти синергетические эффекты предполагают, что G3KL был способен проникать в клетки K. pneumoniae , даже если он не был активен против бактерии, в соответствии с близкими производными G3KL , проявляющими значительную активность против K.pneumoniae [58,59,60]. Ранее сообщалось о синергизме между полимиксином B / колистином и низкомолекулярными антибиотиками в K. pneumoniae [10,11,12,13,14,30,61]. Синергетические эффекты с участием проницаемого, но неактивного соединения ранее наблюдались с нонапептидом полимиксина B (PMBN), неактивным производным полимиксина B, лишенным жирной ацильной цепи [11,62].

Таблица 2

МИК (мкг / мл) G3KL и низкомолекулярных препаратов в комбинации ^a .

G3KL не увеличивал активность ампициллина и сульфаметоксазола, которые были неактивны против K. pneumoniae при использовании отдельно (Рисунок S12). В случае ампициллина антибиотик, вероятно, расщепляется естественной β-лактамазой в K. pneumoniae NCTC 418, делая неэффективной пермеабилизацию [63]. G3KL также существенно не увеличивал активность ципрофлоксацина, который очень активен и активность которого не ограничивается захватом (фиг. S12).

Наконец, мы проверили эффект пермеабилизации G3KL на грамположительном штамме MRSA. Результаты показали очень слабый эффект проницаемости, в соответствии с тем, что G3KL неактивен против этой бактерии. Мы наблюдали слабую синергию между G3KL с эритромицином (FIC _i <1), ампициллином (FIC _i <1) и азитромицином (FIC _i <0,8) (Рисунок S13) и индифферентный эффект со всеми другие антибиотики (Рисунки S14 – S16), что позволяет предположить, что G3KL не может пройти через слой пептидогликана и достичь мембраны, и, следовательно, не может проницаемо для MRSA для поглощения низкомолекулярных лекарств.

Чтобы подтвердить синергетический эффект, наблюдаемый в тесте шахматной доски, мы провели эксперименты по уничтожению времени для комбинаций G3KL с ванкомицином (FIC _i <0,3), эритромицином (FIC _i <0,3), новобиоцином (FIC _i <0,2) и триметоприма (FIC _i <0,5). Кинетика уничтожения на K. pneumoniae при начальном посевном материале ~ 10 ⁶ КОЕ / мл показала, что пары G3KL / ванкомицин (32 мкг / мл / 32 мкг / мл) и G3KL / триметоприм (32 мкг / мл / 16 мкг / мл) эффективно убивал бактерии через 4 часа и G3KL / эритромицин (32 мкг / мл / 16 мкг / мл) через 8 часов, все ниже уровня МПК ().Пара G3KL / новобиоцин не показала снижения бактериальной нагрузки, но продемонстрировала ингибирующую активность. Низкий уровень выживших бактерий мог не быть обнаружен в тесте шахматной доски. Аналогичное ингибирование роста наблюдалось для новобиоцина при использовании отдельно при 2 × MIC (16 мкг / мл) против K. pneumoniae (и фиг. S17). Этот эффект также наблюдался в предыдущих исследованиях против E. coli , которые предполагали, что новобиоцин обычно подавляет деление клеток и вызывает более медленный рост клеток [50,64].Обратите внимание, что G3KL , ванкомицин, триметоприм, эритромицин и новобиоцин при использовании по отдельности в той же концентрации, что и в комбинации, не оказали влияния на уничтожение бактерий.

Статический анализ «time-kill» с G3KL , антибиотиками ванкомицином, эритромицином и новобиоцином и их комбинацией с G3KL . Эксперимент показал снижение бактериальной нагрузки K. pneumoniae при 37 ° C для комбинации G3KL / ванкомицин (32 мкг / мл / 32 мкг / мл), G3KL / эритромицин (32 мкг / мл / 16 мкг / мл). мкг / мл) и G3KL / триметоприм (32 мкг / мл / 16 мкг / мл) ниже уровня МИК.Комбинация G3KL / новобиоцин (32 мкг / мл / 2 мкг / мл) показала ингибирование роста K. pneumoniae . Анализы проводили в трех экземплярах.

Синергетическое воздействие четырех факторов изменения климата на земной углеродный цикл

Синергетический эффект химио-иммунотерапии опухолей, индуцированный термочувствительными мицеллами, перемещающими лейкоциты

Материалы

Акрилонитрил (AN) был приобретен у Qinghongfu Technology Co., Ltd. (Пекин, Китай) и перед использованием очищают перегонкой при атмосферном давлении. Акриламид (AAm), 4,4′-азобис (4-циановалериановая кислота) (ACVA), диметилсульфоксид (ДМСО) и азелаиновая кислота были предоставлены Aladdin (Шанхай, Китай). Амино-полиэтиленгликольамин (H ₂ N-PEG-NH ₂ ) (Mw = 5 кДа) был приобретен у ToYongBio Tech. Inc. (Шанхай, Китай). Nα, Nα-бис (карбоксиметил) -L-лизин (NTA) получали от Energy Chemical (Шанхай, Китай). Гидрохлорид доксорубицина и индоцианиновый зеленый (ICG) были доставлены из Meilun Biotechnology Co., Ltd. (Далянь, Китай). SCH 58261 был приобретен в TCI (Токио, Япония). Нильский красный был получен от компании Aladdin (Шанхай, Китай). Рекомбинантная химера Fc E-селектина мыши (ES) была от R&D Systems (Миннеаполис, США). 5 ‘- (N-этилкарбоксамидо) аденозин (NECA) был приобретен у ApexBio Technology LLC (Хьюстон, США). Среда RPMI 1640 и фетальная бычья сыворотка (FBS), полученные от Sigma (Сент-Луис, Миссури, США) и Sijiqing Biological Engineering Materials Co. Ltd. (Ханчжоу, Китай), соответственно. Все наборы для ELISA были приобретены у Meimian Industrial Co., Ltd. (Цзянсу, Китай). Набор для анализа АТФ был куплен в Beyotime (Шанхай, Китай).

Культура клеток и животные

Клетки рака молочной железы мыши 4T1 (серийный номер: TCM32) и клетки рака толстой кишки CT26 (серийный номер: TCM37) были получены из банка клеток Китайской академии наук (Шанхай, Китай) и клетки Luc-4T1 ( Номер: CM-2233) были приобретены в Mingjing Biology (Шанхай, Китай). Клетки культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% (об. / Об.) FBS и пенициллина / стрептомицина (100 Ед / мл каждого) и выдерживали в инкубаторе для клеток (37 ° C и 5% CO ₂ ).Клетки регулярно разделяли с использованием трипсина / ЭДТА. Для групп, получавших гипертермию, клетки помещали в инкубатор для клеток (43 ° C и 5% CO ₂ , 30 мин) сразу после добавления тестируемых агентов с последующей инкубацией при 37 ° C в течение заранее установленного периода времени. .

Мышей Balb / c (самки, возраст 6-8 недель, 18-20 г) были приобретены у Slack Laboratory Animal Co., Ltd (Шанхай, Китай). Животных содержали при температуре ~ 22 ± 2 ° C, влажности 50 ± 10% с циклом 12 часов света / 12 часов темноты. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных с одобрения Совета по научным исследованиям Чжэцзянского университета, Ханчжоу, Китай.

Синтез и характеристика NTA-PEG-p- (AAm-co-AN)

Во-первых, p- (AAm-co-AN) с UCST 43 ° C был синтезирован сополимеризацией в растворе AN и AAm, инициированной ACVA. Вкратце, 10,95 г (150 ммоль) AAm отвешивали в трехгорлую колбу на 500 мл и растворяли в 170 мл безводного ДМСО. Затем добавляли 2,55 г (50 ммоль) AN. Для удаления кислорода из системы закачивали азот в течение 1 ч. После этого 30 мл отдельно дегазированного безводного ДМСО, содержащего 0.519 г (1,853 ммоль) ACVA закапывали в систему через капельную воронку с постоянным давлением. Затем колбу поместили на водяную баню, предварительно нагретую до 65 ° C. Затем реакционную смесь полимеризовали в течение 8 ч в атмосфере азота и быстро охлаждали до комнатной температуры на ледяной бане. Продукт осаждали в 10-кратном избытке метанола. Затем осадок трижды промывали метанолом и сушили в вакуумном сушильном шкафу при 70 ° C в течение 24 часов.

Затем H ₂ N-PEG-NH ₂ был введен в p- (AAm-co-AN) посредством химической реакции между одной из аминогрупп в H ₂ N-PEG-NH ₂ и карбоксильные группы п- (AAm-co-AN).Вкратце, 500 мг (0,1 ммоль) p- (AAm-co-AN) отвешивали в колбу на 50 мл и растворяли в 10 мл ДМСО, куда добавляли 95 мг (0,5 ммоль) EDC и 57 мг (0,5 ммоль). ) NHS и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Затем раствор смеси по каплям добавляли к 10 мл ДМСО, содержащему 500 мг (0,2 ммоль) H ₂ N-PEG-NH ₂ (Mw = 5 кДа) при 50 ° C. Реакционную смесь перемешивали в течение 48 часов, а затем диализ против деионизированной воды с диализной мембраной (MWCO: 8–14 кДа) в течение 48 часов с последующей лиофилизацией и получали PEG-p- (AAm-co-AN).

Затем NTA прививали к PEG-p- (AAm-co-AN) с азелаиновой кислотой в качестве линкера. Вкратце, 19 мг (100 мкмоль) азелаиновой кислоты растворяли в 10 мл ДМСО, к которому добавляли 20 мг (100 мкмоль) EDC и 11,5 мг (100 мкмоль) NHS, и перемешивали при комнатной температуре в течение 10 часов для активации. одна из карбоксильных групп азелаиновой кислоты. Затем 500 мг (33,5 мкмоль) PEG-p- (AAm-co-AN) растворяли в 10 мл ДМСО и по каплям добавляли в вышеуказанный раствор смеси, также добавляли 67 мкмоль триэтиламина.Реакционную смесь перемешивали в течение 17 часов при комнатной температуре, а затем диализ против деионизированной воды с диализной мембраной (MWCO: 3,5 кДа) в течение 48 часов с последующей лиофилизацией с получением карбоксилсодержащего PEG-p- (AAm-co-AN ). Затем 420 мг (28 мкмоль) карбоксилсодержащего PEG-p- (AAm-co-AN) растворяли в 10 мл ДМСО, добавляли 54 мг (280 мкмоль) EDC и 32,5 мг (280 мкмоль) NHS. и перемешивали при комнатной температуре 4 часа. Затем 147 мг (560 мкмоль) NTA и 1,12 ммоль триэтиламина растворяли в 10 мл смешанного раствора ДМСО / H ₂ O (ДМСО: H ₂ O = 3: 2), добавляли по каплям в указанный выше раствор и реагировал при комнатной температуре в течение 24 часов.После диализа против деионизированной воды с диализной мембраной (MWCO: 3,5 кДа) в течение 48 часов и лиофилизации получали конечный продукт NTA-PEG-p- (AAm-co-AN).

Спектры ¹ H-ЯМР полимеров получали с использованием ЯМР-спектрометра (AC-80, BrukerBioSpin, Германия), и спектры анализировали с помощью программного обеспечения MestReNova 6.1.1. p- (AAm-co-AN), PEG, PEG-p- (AAm-co-AN) и NTA-PEG-p- (AAm-co-AN) растворяли в DMSO- d6 в концентрациях 20 мг. / мл. Молекулярные массы p- (AAm-co-AN) и PEG-p- (AAm-co-AN) анализировали с использованием гель-проникающей хроматографии (GPC) с ДМСО в качестве элюента.Колонки PLgel MIXED-C (размер частиц: 5 мкм; размеры: 7,5 мм × 300 мм), калиброванные с помощью узких стандартов монодисперсного декстрана, использовали с детектором дифференциального показателя преломления. Скорость потока составляла 0,6 мл / мин. Полимеры диспергировали в воде в концентрации 2 мг / мл, чтобы облегчить определение значения UCST, оптическое пропускание растворов полимеров при различных температурах измеряли при 637 нм с использованием спектрофотометра в ультрафиолетовой и видимой области (UV-2401, Shimadzu, Япония). .Значение UCST для p- (AAm-co-AN) определяли при температуре, когда оптическое пропускание становилось постоянным. Критическую концентрацию мицелл (CMC) NTA-PEG-p- (AAm-co-AN) определяли с использованием флуоресцентной спектроскопии и пирена в качестве зонда. Сначала пирен растворяли в ацетоне при концентрации 0,0012 мг / мл и добавляли в пробирки. После выпаривания ацетона при 50 ° C добавляли 5 мл растворов полимера с различными концентрациями в диапазоне от 2 до 1000 мкг / мл. После обработки раствора ультразвуковой обработкой на водяной бане в течение 30 мин спектры излучения регистрировали на флуоресцентном спектрофотометре (F-2500, Hitachi High-Technologies Co., Япония) при комнатной температуре. Длина волны возбуждения составляла 336 нм, а ширина щели составляла 10 нм (возбуждение) и 2,5 нм (излучение). Эмиссию пирена контролировали в диапазоне длин волн 360–450 нм. Из спектров испускания пирена было проанализировано отношение интенсивностей первого пика (I ₁ , 374 нм) к третьему пику (I ₃ , 384 нм) и использовано для расчета CMC, и результат был рассчитан следующим образом: Microsoft Excel 2019.

Температурная чувствительность пустых мицелл

NTA-PEG-p- (AAm-co-AN) диспергировали в воде при концентрации 0.5 мг / мл с последующими 30 раундами ультразвуковой обработки зондового типа (импульсы каждые 2 с в течение 3 с, 400 Вт). После перемешивания при 25 ° C в течение 0,5 ч получали раствор холостых мицелл. Раствор холостых мицелл разделяли на четыре части и инкубировали при различных температурах (25, 37, 43, 50 ° C) в течение 0,5 ч, капали на предварительно нагретые медные сетки и сушили при соответствующей температуре. Впоследствии морфология пустых мицелл при различных температурах наблюдалась с помощью ПЭМ.

Способность мицелл хелатировать Ni

Три миллиграмма NTA-PEG-p- (AAm-co-AN) диспергировали в 1 мл воды и обрабатывали ультразвуковым датчиком в течение 30 циклов, перемешивая при 25 ° C. ° C для 0.5 ч. Затем добавляли 0,45 мг NiCl ₂ · H ₂ O и смесь перемешивали еще 2 часа. После диализа против воды (MWCO: 3,5 кДа) для удаления избытка Ni ²⁺ и лиофилизации содержание Ni ²⁺ в мицеллах было обнаружено с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) (NexION300X, PerkinElmer, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ). NTA-PEG-p- (AAm-co-AN) без NiCl ₂ · H ₂ O служил контролем.

Получение и характеристика совместно загруженных мицелл DOX / SCH, модифицированных Е-селектином (ES-DSM)

DOX, используемый для получения мицелл, нагруженных лекарственным средством, был получен реакцией между DOX · HCl и двумя молярными эквивалентами триэтиламина. в ДМСО в течение 24 ч.Диализ против воды для осаждения нерастворимого DOX с последующим центрифугированием и лиофилизацией для получения порошка DOX для дальнейшего использования. Двадцать миллиграммов NTA-PEG-p- (AAm-co-AN) диспергировали в 3 мл воды и обрабатывали ультразвуковым датчиком в течение 30 циклов, перемешивая при 25 ° C в течение 0,5 ч, с образованием стабильных пустых мицелл. DOX и SCH 58261 (SCH) растворяли вместе в ДМСО до конечных концентраций 0,8 и 0,2 мг / мл соответственно. Затем к раствору мицелл при постоянном перемешивании добавляли по каплям 1 мл раствора DOX / SCH в ДМСО (DOX: SCH: полимер = 4: 1: 100).Затем добавляли 3 мг NiCl ₂ · H ₂ O и смесь перемешивали при 25 ° C в течение еще 2 часов с последующим диализом против воды (MWCO: 3,5 кДа) в течение 24 часов и центрифугированием при 1800 × г в течение 10 мин для удаления агрегатов неинкапсулированного DOX / SCH. В конечном итоге раствор совместно загруженных мицелл DOX / SCH (DSM) лиофилизировали и хранили при 4 ° C. E-селектин может быть введен на поверхность DSM между взаимодействием His-метки E-селектина и Ni-NTA полимера.Вкратце, различные концентрации E-селектина (0, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 3 мкг / мл) добавляли к раствору DSM (при концентрации полимера 1 мг / мл), соответственно, инкубировали при 37 °. C в течение 1 ч и далее при 4 ° C в течение ночи, чтобы получить DSM, модифицированный E-селектином (ES-DSM). Получение нагруженных DOX мицелл (DM и ES-DM) было таким же, как указано выше, за исключением отсутствия SCH. Размеры частиц и дзета-потенциалы DSM и ES-DSM регистрировали методом динамического рассеяния света (DLS) (Zetasizer, 3000HS, 66 Malvern Instruments Ltd.). Морфологию ES-DSM наблюдали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ) (JEOL JEM-1230, Япония). Эффективность инкапсуляции (EE) и загрузка лекарственного средства (DL) определяли с помощью флуороспектрального фотометра (DOX: Ex = 480 нм, Em = 560 нм, ширина щели = 5 нм; SCH: Ex = 320 нм, Em = 385 нм, ширина щели = 5 нм). Вкратце, нагруженные лекарственным средством мицеллы были разрушены ДМСО, и было определено общее содержание DOX и SCH. EE% и DL% рассчитывались по следующим формулам:

$$ {{{{{{\ rm {EE}}}}}} \% = \ frac {{{{{{{\ rm {mass}}}}} }} \, {{{{{\ rm {of}}}}}} \, {{{{{{\ rm {drug}}}}}} \, {{{{{\ rm {инкапсулированный}}} }}} \, {{{{{\ rm {into}}}}}} \, {{{{{{\ rm {мицеллы}}}}}}} {{{{{{{\ rm {масса}}) }}}} \, {{{{{\ rm {of}}}}}} \, {{{{{\ rm {drug}}}}}} \, {{{{{{\ rm {добавлено}}) }}}}}} \ times 100 \% $$

(1)

$$ {{{{{\ rm {DL}}}}}} \% = \ frac {{{{{{{\ rm {mass}}}}}}} \, {{{{{\ rm { of}}}}}} \, {{{{{\ rm {drug}}}}}} \, {{{{{{\ rm {инкапсулированный}}}}}} \, {{{{{\ rm {into}}}}}} \, {{{{{{\ rm {micelles}}}}}}} {{{{{{{\ rm {mass}}}}}} \, {{{{{\ rm {of}}}}}} \, {{{{{\ rm {drug}}}}}} \ mbox {-} {{{{{\ rm {loaded}}}}}} \, {{ {{{\ rm {мицеллы}}}}}}} \ times 100 \% $$

(2)

Изменения размера мицелл, вызванные термическим воздействием

Изменения размера мицелл в ответ на температуру контролировали с помощью DLS.Измеряли размеры пустых мицелл, DSM и ES-DSM при различных температурах (5, 15, 25, 37, 43, 50 ° C). Перед измерением образцы (при концентрации полимера 1 мг / мл) инкубировали при соответствующей температуре в течение 10 мин. Для каждого образца есть три повторяющиеся группы.

Термочувствительное поведение высвобождения лекарственного средства in vitro ES-DSM

Профили высвобождения DOX и SCH ES-DSM при различных температурах были протестированы методом диализа. Мешки для диализа (MWCO: 3.5 кДа), содержащий 1 мл свободного DOX и SCH (DS), и ES-DSM (концентрации DOX и SCH составляли 90 и 15 мкг / мл соответственно) погружали в пробирки Falcon, содержащие 30 мл PBS (pH 7,4). Эти пробирки помещали в шейкеры-инкубаторы (37 и 43 ° C соответственно) и горизонтально встряхивали со скоростью 60 об / мин. В каждый заданный момент времени среду для высвобождения собирали и заменяли свежим PBS. Содержание DOX и SCH в высвобождающих средах определяли с помощью флюороспектрального фотометра. Каждый момент времени выполнялся трижды.

Биосовместимость мицелл на лейкоцитах

Для получения лейкоцитов кровь мышей брали путем иссечения глазных яблок и лейкоциты выделяли с помощью набора для разделения лейкоцитов периферической крови мышей в соответствии с инструкциями производителя (Solarbio, Китай). Цитотоксичность холостых мицелл по отношению к лейкоцитам измеряли с помощью анализа CCK-8. Вкратце, лейкоциты суспендировали в среде RPMI 1640 и высевали в 96-луночный планшет при плотности 1 × 10 ⁴ клеток на лунку, а затем подвергали воздействию пустых мицелл в серии концентраций (0, 100, 200, 400, 800 , 1000 мкг / мл) за разное время (1, 2, 4, 8 ч).Затем добавляли 10 мкл раствора CCK-8 и инкубировали в течение 1 ч, после чего измеряли оптическую плотность каждой лунки с помощью ридера для микропланшетов при 450 нм. Жизнеспособность клеток рассчитывалась по отношению к отрицательным клеткам без воздействия тестируемых агентов. Все эксперименты повторяли трижды.

Затем исследовали цитотоксичность ES-DSM по отношению к лейкоцитам. Лейкоциты высевали в 96-луночный планшет при плотности 1 × 10 ⁴ клеток на лунку и подвергали воздействию ES-DSM при различных концентрациях DOX (6.5, 12,5, 25, 31,5, 37,5 мкг / мл) за разное время (1, 2, 4, 8 ч). Жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа CCK-8. Все эксперименты повторяли трижды.

Хемотаксис и проникающая способность лейкоцитов исследовали с помощью анализа миграции через лунки (размер пор поликарбонатной мембраны через лунки составлял 8 мкм). Вкратце, лейкоциты подвергали воздействию DSM или ES-DSM при концентрации DOX 37,5 мкг / мл в течение 8 часов. После трехкратной промывки PBS лейкоциты суспендировали в среде RPMI 1640, добавленной в верхнюю камеру трансвелл, которая была прикреплена с помощью HUVEC.Нижнюю камеру трансвелл заполняли средой RPMI 1640, содержащей хемокины (10 нг / мл CXCL2 и 100 нг / мл CXCL12). Через 4 ч инкубации лейкоциты в нижней камере наблюдали под микроскопом, затем лейкоциты собирали и подсчитывали их количество с помощью цитометрии. Процент трансвеллеров рассчитывался по формуле:

$$ {{{{{\ rm {Transwell}}}}}}} \% = \ frac {{{{{{{{\ rm {N}}}}}}} } _ {{{{{{{\ rm {lower}}}}}} \, {{{{{{\ rm {champer}}}}}}}} {{{{{{{{\ rm {N}}) }}}}} _ {{{{{\ rm {total}}}}}}}} \ times 100 \% $$

(3)

Одновременно мышам внутривенно вводили DSM или ES-DSM и через 24 часа выделяли лейкоциты.Хемотаксис и проникающая способность выделенных лейкоцитов также анализировали с помощью трансвелл, как упомянуто выше, и также рассчитывали процент трансвелл.

Лейкоцит-адгезионная способность ES-DSM

Двести микролитров DSM или ES-DSM (концентрации DOX и SCH составляли 300 и 50 мкг / мл соответственно) вводили мышам через хвостовую вену, а затем через хвостовую вену. Через 8 и 24 ч после инъекции лейкоциты обработанных мышей выделяли с помощью набора для разделения лейкоцитов периферической крови мышей в соответствии с инструкциями производителя (Solarbio, Китай).Флуоресценцию DOX на полученных лейкоцитах анализировали с помощью проточной цитометрии (ACEA NovoCyte, США) и конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM) (Leica SP8, Германия). Кроме того, лейкоциты были выделены через 24 часа после инъекции ES-DSM, Т-лимфоциты и нейтрофилы были помечены антителами APC-anti-CD3 (№ по каталогу 100235, 1:40) или CD16 (№ по каталогу 158005, 1:40) (BioLegend , США), соответственно, наблюдаемые CLSM.

Термочувствительное поведение мицелл при высвобождении лекарственного средства на клеточном уровне

Сначала в мицеллы загружали нильский красный.Получение мицелл, нагруженных нильским красным, было таким же, как и DSM, за исключением того, что использованное модельное лекарственное средство было нильским красным вместо DOX / SCH. Клетки 4T1 суспендировали в среде RPMI 1640 и высевали в 12-луночный планшет при плотности 1 × 10 ⁵ клеток на лунку и оставляли для прикрепления в течение ночи. Затем клетки обрабатывали свободными мицеллами, содержащими нильский красный или нильский красный (при конечной концентрации нильского красного 0,1 мкг / мл), и группы, обработанные гипертермией, помещали в инкубатор для клеток (43 ° C и 5% CO _{. 2} , 30 мин) сразу с последующей инкубацией при 37 ° C в течение 6 часов.После трехкратной промывки PBS клетки собирали и интенсивность флуоресценции определяли с помощью проточной цитометрии. Кроме того, флуоресценцию клеток также наблюдали с помощью CLSM. После инкубации и трехкратной промывки PBS клетки фиксировали и ядра окрашивали DAPI с последующим наблюдением CLSM.

Затем в мицеллы загружали ДОКС. Свободные мицеллы, нагруженные DOX и DOX, добавляли к клеткам 4T1 до конечной концентрации DOX 4,5 мкг / мл. После лечения гипертермией и 6-часовой инкубации клетки трижды промывали PBS и фиксировали.После окрашивания DAPI клетки наблюдали с помощью CLSM.

Цитотоксичность и апоптоз

Во-первых, цитотоксичность холостых мицелл измеряли с помощью МТТ-анализа. Клетки 4T1 суспендировали в среде RPMI 1640 и высевали в 96-луночный планшет при плотности 1 × 10 ⁴ клеток на лунку и оставляли для прикрепления в течение ночи. Затем клетки подвергали воздействию пустых мицелл в серии концентраций (0, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 мкг / мл) в течение 48 часов. Группы, обработанные гипертермией, помещали в инкубатор для клеток при 43 ° C на 30 мин с последующей инкубацией при 37 ° C до 48 часов.Затем 20 мкл раствора 3- (4,5-диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенил-2H-тетразолийбромида (МТТ) (5 мг / мл) добавляли в каждую лунку еще на 4 часа. инкубация при 37 ° C. После этого среду заменяли 100 мкл ДМСО для растворения пурпурных кристаллов формазана на дне лунки. Планшет встряхивали в течение 30 мин, и оптическую плотность раствора в каждой лунке измеряли с помощью устройства для считывания микропланшетов при 570 нм. Жизнеспособность клеток рассчитывалась по отношению к отрицательным клеткам без воздействия тестируемых агентов.Все эксперименты повторяли трижды.

Затем с помощью МТТ-анализа определяли цитотоксичность свободного DOX / SCH (DS), DSM и ES-DSM в сочетании с гипертермией или без нее. Клетки 4T1 суспендировали в среде RPMI 1640 и высевали в 96-луночный планшет при плотности 1 × 10 ⁴ клеток на лунку и оставляли для прикрепления в течение ночи. Затем клетки подвергали воздействию DS, DSM или ES-DSM при различных концентрациях лекарства в течение 48 ч (соотношение концентраций DOX и SCH составляет 6: 1). Группы, обработанные гипертермией, немедленно помещали в инкубатор клеток, который был предварительно установлен на 43 ° C в течение 30 минут после воздействия тестируемых агентов, с последующей инкубацией при 37 ° C в течение 48 часов.Жизнеспособность клеток измеряли, как описано выше.

Апоптоз клеток, индуцированный DS, DSM и ES-DSM в сочетании с гипертермией или без нее, исследовали с помощью проточной цитометрии. Клетки 4T1 суспендировали в среде RPMI 1640 и высевали в 12-луночный планшет при плотности 1 × 10 ⁵ клеток на лунку и оставляли для прикрепления в течение ночи. Впоследствии клетки подвергали воздействию DS, DSM или ES-DSM (концентрации DOX и SCH составляли 4,5 и 0,75 мкг / мл соответственно) и обрабатывали с гипертермией или без нее.После 24-часовой инкубации клетки собирали и окрашивали с помощью набора для обнаружения апоптоза Annexin V-FITC / PI (Beyotime Biotech, Китай) в соответствии с инструкциями производителя с последующим анализом на проточном цитометре.

Обнаружение биомаркеров ICD

Обнаружено воздействие DAMP (CRT, HMGB1 и ATP) опухолевых клеток после различного лечения. Вкратце, клетки 4T1 обрабатывали DS, DSM или ES-DSM (концентрации DOX и SCH составляли 4,5 мкг / мл и 0,75 мкг / мл соответственно) с гипертермией или без нее.Воздействие CRT наблюдали по иммунофлуоресценции с помощью CLSM в течение 12 часов (моноклональные антитела кролика к кальретикулину, каталожный номер AF1666, 1: 500, Beyotime, Китай). Полуколичественный анализ выполняли с использованием программного обеспечения Image J. После инкубации в течение 48 часов супернатант клеточной культуры собирали, содержание АТФ определяли с помощью набора для анализа АТФ, а HMGB1 определяли с помощью набора для ELISA в соответствии с инструкциями производителя.

Совместная инкубация опухолевых клеток и DC, происходящих из костного мозга.

Мышиные DC, полученные из костного мозга (BMDC), выделяли от самок мышей Balb / c в возрасте 6 недель.Вкратце, костный мозг мышей собирали промыванием бедренных и большеберцовых костей PBS и лизировали эритроциты. Оставшиеся клетки дважды промывали PBS и культивировали в полной среде RPMI 1640, содержащей рекомбинантный мышиный GM-CSF (20 нг / мл) (MedChemExpress, США), в течение 6 дней для получения незрелых DC. На 7-й день незрелые DC инкубировали совместно с клетками 4T1, которые ранее были обработаны PBS, DS, DSM или ES-DSM (концентрации DOX и SCH составляли 4,5 мкг / мл и 0,6 мкг / мл).75 мкг / мл соответственно) (с добавкой или без гипертермии) 24 ч назад. После 48-часовой совместной инкубации DC окрашивали указанными антителами, включая PE-CD80 (каталожный номер 104707, 1:40, BioLegend, США), APC-CD86 (каталожный номер 105011, 1:40, BioLegend, США). и PE-MHC II (№ по каталогу 12-5321-81, 1: 1000, ThermoFisher, США), проанализированы методом проточной цитометрии. Кроме того, уровни цитокинов в супернатанте системы совместной инкубации, включая IL-12p70, IL-6 и IL-10, определяли с помощью наборов для ELISA в соответствии с инструкциями производителя.

Кроме того, незрелые DC инкубировали совместно с клетками 4T1, которые предварительно обрабатывали D (только DOX), DS, DM, DSM, ES-DM или ES-DSM (концентрации DOX и SCH составляли 4,5 мкг / мл и 0,75 мкг / мл соответственно) и дополнили гипертермией 24 часа назад. После 48-часовой совместной инкубации в присутствии 1 мкМ (доза, имитирующая концентрацию аденозина в микроокружении опухоли) NECA (аналог аденозина), DC окрашивали указанными антителами, включая PE-CD80 (кат. 104707, 1:40, BioLegend, США), APC-CD86 (Cat # 105011, 1:40, BioLegend, США) и PE-MHC II (Cat # 12-5321-81, 1: 1000, ThermoFisher, США) , проанализированы методом проточной цитометрии.Кроме того, уровни цитокинов в супернатанте системы совместной инкубации, включая IL-12p70, IL-6 и IL-10, определяли с помощью наборов для ELISA в соответствии с инструкциями производителя.

Совместная инкубация опухолевых клеток, ДК костного мозга и лимфоцитов селезенки.

Лимфоциты селезенки экстрагировали из селезенки мышей Balb / c, используя центрифугирование в градиенте плотности лимфоцитов с Ficoll-paque PREMIUM. Незрелые DC и лимфоциты совместно инкубировали с клетками 4T1, которые предварительно обрабатывали PBS, DS, DSM или ES-DSM (концентрации DOX и SCH составляли 4.5 и 0,75 мкг / мл соответственно) (с добавкой или без гипертермии) 24 часа назад. После 48-часовой совместной инкубации лимфоциты были окрашены указанными антителами, включая FITC-CD3 (каталожный номер 100204, 1: 200), APC-CD8 (каталожный номер 100712, 1: 100), PE-CD4 (каталожный номер 100408). , 1: 100) и Percific Blue-Foxp3 (№ по каталогу 126410, 1:50) (BioLegend, США), проанализированные методом проточной цитометрии. Кроме того, уровни цитокинов в супернатанте системы совместной инкубации, включая TNF-α, IL-2 и IFN-γ, определяли с помощью наборов для ELISA в соответствии с инструкциями производителя.

Кроме того, незрелые DC и лимфоциты были совместно инкубированы с клетками 4T1, которые ранее были обработаны D, DS, DM, DSM, ES-DM или ES-DSM (концентрации DOX и SCH составляли 4,5 и 0,75 мкг / мл соответственно) и дополнили гипертермией 24 ч назад. После 48-часовой совместной инкубации в присутствии 1 мкМ NECA лимфоциты были окрашены указанными антителами, включая FITC-CD3 (каталожный номер 100204, 1: 200), APC-CD8 (каталожный номер 100712, 1: 100). PE-CD4 (№ по каталогу 100408, 1: 100) и Percific Blue-Foxp3 (№ по каталогу 126410, 1:50) (BioLegend, США), проанализированные методом проточной цитометрии.Кроме того, уровни цитокинов в супернатанте системы совместной инкубации, включая TNF-α, IL-2 и IFN-γ, определяли с помощью наборов для ELISA в соответствии с инструкциями производителя.

Биораспределение DSM и ES-DSM

Модели ортотопических опухолей были созданы путем подкожной инъекции клеток 4T1 (5 × 10 ⁵ ), диспергированных в бессывороточной среде RPMI 1640, в третью подушечку груди мышей Balb / c. Лечение началось, когда объем опухоли достиг 500 мм ³ .Для наблюдения и визуализации биораспределения мицелл загруженные ICG мицеллы были приготовлены так же, как DSM, и модификация E-селектина была такой же, как ES-DSM. Двести микролитров мицелл, нагруженных ICG, или мицелл, нагруженных ES-ICG, вводили мышам через хвостовую вену, и через 2, 6, 12, 24 ч после инъекции обработанные мыши были анестезированы, а изображения флуоресценции были получены Maestro. система визуализации in vivo. Через 24 часа после инъекции мышей умерщвляли для извлечения основных органов (сердца, печени, селезенки, легких, почек и опухоли).Были получены изображения флуоресценции, и интенсивность флуоресценции этих органов была измерена ex vivo с использованием системы визуализации in vivo. Флуоресценцию ICG и CD45 в опухолях анализировали иммунофлуоресценцией и наблюдали с помощью CLSM.

Противоопухолевое исследование in vivo

Всего ортотопически инъецировали 5 × 10 ⁵ клеток 4T1 в одну из подушечек груди мышей Balb / c. Через 1 неделю мышей случайным образом разделили на восемь групп (по 6 мышей в группе), чтобы, соответственно, получать одну из следующих обработок один раз каждые 3 дня: физиологический раствор, физиологический раствор + MW, DS + MW, DSM + MW, ES-DSM. , ES-DM + MW, ES-DSM + MW, ES-DSM + MW + анти-CD8, для четырехкратного лечения.3 мг / кг DOX и 0,5 мг / кг SCH на дозу использовались при лечении и через 24 часа после в / в. После инъекции тестируемых агентов мягкая микроволновая печь (MW) применялась локально в течение 30 мин (8 Вт). Микроволновый зонд располагали на расстоянии 1 см от фиксированного животного и ориентировали в сторону ортотопической опухоли груди. Антитело к CD8 (каталожный номер BE0004-1, BioXcell, США) вводили внутрибрюшинно (ip) для истощения Т-клеток CD8 ⁺ в дни –3 и обрабатывали каждые 3 дня до конца мониторинга (100 мкг / мышей на инъекцию).Массу тела и объем опухоли контролировали каждые 2 дня, а также время выживания. Объем опухоли рассчитывали по формуле: a ² × b /2, в которой a и b представляют наименьший и наибольший диаметры соответствующей опухоли соответственно.

Для того, чтобы оценить эффективность SCH, мышей с опухолью 4T1 были случайным образом разделены на три группы (по 6 мышей в группе), чтобы, соответственно, получать одну из следующих обработок один раз в 3 дня: физиологический раствор + MW, SCH + MW , ES-SM + MW, для четырехкратной обработки.0,5 мг / кг SCH на дозу применяли при лечении и через 24 ч после в / в. После инъекции тестируемых агентов микроволновая печь (MW) применялась локально в течение 30 мин (8 Вт). Объем опухоли контролировали каждые 2 дня.

В конце мониторинга на 23-й день мышей умерщвляли, собирали основные органы (сердце, печень, селезенку, легкие, почки и опухоль) и фиксировали в 4% параформальдегиде, заливали парафином, разрезали на 5 мкм. срезов и окрашивали H&E, затем исследовали под световым микроскопом. Апоптоз опухолевой ткани также исследуют с помощью иммунофлуоресценции окрашивания TUNEL.Чтобы продемонстрировать ICD опухолевых тканей, уровень воздействия CRT изучали с помощью иммунофлуоресценции и наблюдали с помощью CLSM. Чтобы изучить иммунный ответ, инфильтрацию Т-клеток CD8 ⁺ и Treg (Foxp3) в опухоли анализировали с помощью иммунофлуоресценции, в то время как инфильтрацию активных Т-клеток (CD69) и перфорина изучали с помощью иммуногистохимии. Т-клетки (CD3 ⁺ CD8 ⁺ и CD3 ⁺ CD4 ⁺ ) в PBMC, селезенке и опухоли выделяли центрифугированием в градиенте плотности и окрашивали соответствующими флуоресцентно-меченными антителами, а затем анализировали проточной цитометрией.CD3 ⁺ CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ Т-клетки в опухоли и CD3 ⁺ Т-клетки CD8 ⁺ CD44 ⁺ Т-клетки в селезенке и опухоли окрашивали соответствующими антителами, упомянутыми выше, и оценивали с помощью проточной цитометрии. В частности, CD44 был помечен антителом PerCP-CD44 (каталожный № 103035, 1: 100, BioLegend, США). Кроме того, селезенку и опухоль измельчали ​​на ледяной бане с помощью гомогенизатора, супернатант после центрифугирования (16000 × г, , 10 мин, 4 ° C) собирали для измерения.Уровни TNF-α, IFN-γ и IL-2 в сыворотке, селезенке и опухоли исследовали с использованием наборов для ELISA в соответствии с инструкциями производителя. ДК (CD11c ⁺ CD80 ⁺ и CD11c ⁺ CD86 ⁺ ), выделенные из опухоли и сигнального лимфатического узла (SLN), также окрашивали соответствующими антителами и анализировали с помощью проточной цитометрии.

В отдельном эксперименте по изучению вклада ИКД в иммунотерапию опухолей, мышей с опухолью 4T1 случайным образом разделили на три группы (по 6 мышей в группе), чтобы, соответственно, получать одно из следующих курсов лечения один раз в 3 дня: физиологический раствор. + MW, ES-DSM + MW, ES-DSM + MW + CD39 / анти-CRTα, для четырехкратного лечения.Антитело против CRT (каталожный номер ab223614, Abcam, США) (10 мкг / мышь на инъекцию) и экто-АТФазу CD39 (каталожный номер 4398-EN-010, R&D System, США) (1 мкг / мышь на инъекцию). внутрибрюшинно (ip) вводят каждые 3 дня для блокирования CRT и метаболизма АТФ, начиная с -3 дня. Объем опухоли контролировали каждые 2 дня. Мышей умерщвляли на 23 день, DC (CD11c ⁺ ) и Т-клетки (CD3 ⁺ CD8 ⁺ и CD3 ⁺ CD4 ⁺ ) в опухолях окрашивали соответствующими антителами и анализировали с помощью проточной цитометрии.Кроме того, воздействие CRT и инфильтрация CD8 ⁺ Т-клеток в опухоли были проанализированы с помощью иммунофлуоресценции.

Также была создана модель метастатического рака груди в легкие для дальнейшего исследования эффективности лечения метастатического рака. Первоначально мышей с ортотопической опухолью молочной железы устанавливали путем инъекции 5 × 10 ⁵ клеток 4T1. Шесть дней спустя внутривенно вводили 1 × 10 ⁵ клеток Luc-4T1. Затем мышей случайным образом распределяли по пяти группам (по 3 мыши в группе), чтобы, соответственно, получать одну из следующих обработок один раз каждые 3 дня: физиологический раствор + MW, DS + MW, DSM + MW, ES-DM + MW, ES. -DSM + MW, для четырехкратного лечения.При лечении использовали 3 мг / кг DOX и 0,5 мг / кг SCH на дозу, а через 24 часа после в / в применяли МВ (8 Вт, 30 мин). инъекция тестового агента. Микроволновый зонд располагали на расстоянии 1 см от фиксированного животного и ориентировали в сторону ортотопической опухоли груди. За ростом метастазов в легких следили с помощью системы визуализации IVIS Spectrum (PerkinElmer, США) после внутрибрюшинного введения D-люциферина (15 мг / мл, 200 мкл). В конце мониторинга на 20-й день мышей умерщвляли и получали флюоресцентные изображения легких.

Исследования рецидива опухоли и повторного вызова были дополнительно инвестированы. Мыши с ортотопической опухолью молочной железы были созданы, как указано выше, и получали различные виды лечения. После 4-кратного лечения 90% первичной опухоли было удалено хирургическим путем на 12-й день, ложе опухоли дополнительно контролировали и каждые 2 дня рассчитывали объем рецидива опухоли. Одновременно 5 × 10 ⁵ клеток 4T1 были инокулированы в подушечки груди на другой стороне мышей на 12 день.Повторно зараженная опухоль также контролировалась каждые 2 дня. В конце мониторинга на 30 день мышей умерщвляли и повторно зараженную опухоль собирали для анализа инфильтрации CD8 ⁺ Т-клеток и Treg (Foxp3) с помощью иммунофлуоресценции. Кроме того, после лечения мышей с ортотопической опухолью молочной железы ES-DSM + MW, 5 × 10 ⁵ клеток CT26 были инокулированы подкожно в левую заднюю конечность на 12 день. Повторно зараженная опухоль CT26 также контролировалась каждые 2 дня. .

Анализ гемолиза

Были получены образцы свежей крови мышей, стабилизированные этилендиаминтетрауксусной кислотой, а затем эритроциты были выделены из сыворотки центрифугированием при 250 × g в течение 15 мин. После пятикратной промывки физиологическим раствором очищенную кровь разбавляли до 2% суспензии эритроцитов, а затем 0,5 мл суспензии эритроцитов добавляли в 1,5 мл пробирки Эппендорфа и смешивали со следующими агентами: (1) 0,5 мл физиологического раствора в качестве отрицательный контроль, (2) 0,5 мл чистой воды в качестве положительного контроля, (3) 0.5 мл холостых мицелл (M) при 2 мг / мл, (4) 0,5 мл бланковых мицелл, модифицированных E-селектином (ES-M), при 2 мг / мл, (5) 0,5 мл DSM при концентрации мицелл 2 мг / мл и (6) 0,5 мл ES-DSM при концентрации мицелл 2 мг / мл. Все смеси встряхивали и выдерживали при комнатной температуре в течение 3 ч. Наконец, смеси центрифугировали при 7200 × g в течение 5 минут и оптическую плотность супернатантов определяли при 541 нм с использованием ультрафиолетового спектрофотометра. Процент гемолиза эритроцитов рассчитывали следующим образом:

$$ {{{{{\ rm {Percent}}}}}} \, {{{{{\ rm {hemolysis}}}}}} \, \% = \ frac {{{{{{{\ rm {A}}}}}}} _ {{{{{{{\ rm {sample}}}}}}} — {{{{{{{\ rm {A }}}}}}} _ {{{{{{\ rm {negative}}}}}}}} {{{{{{{{\ rm {A}}}}}}}} _ {{{{{ {\ rm {положительный}}}}}}} — {{{{{{{\ rm {A}}}}}}}} _ {{{{{{{\ rm {negative}}}}}}}}} \ умножить на 100 \% $$

(4)

Статистический анализ

Статистические расчеты были выполнены с использованием программного обеспечения Prism 7 (GraphPad).