Тк 236 статья: ТК РФ Статья 236. Материальная ответственность работодателя за задержку выплаты заработной платы и других выплат, причитающихся работнику / КонсультантПлюс

Содержание

Статья 236 ТК РФ с комментариями

Полный текст ст. 236 ТК РФ с комментариями. Новая действующая редакция с дополнениями на 2021 год. Консультации юристов по статье 236 ТК РФ.

При нарушении работодателем установленного срока соответственно выплаты заработной платы, оплаты отпуска, выплат при увольнении и (или) других выплат, причитающихся работнику, работодатель обязан выплатить их с уплатой процентов (денежной компенсации) в размере не ниже одной трехсотой действующей в это время ставки рефинансирования Центрального банка Российской Федерации от невыплаченных в срок сумм за каждый день задержки начиная со следующего дня после установленного срока выплаты по день фактического расчета включительно. Размер выплачиваемой работнику денежной компенсации может быть повышен коллективным договором, локальным нормативным актом или трудовым договором. Обязанность выплаты указанной денежной компенсации возникает независимо от наличия вины работодателя.

Комментарий к статье 236 ТК РФ

Комментируемая статья предусматривает материальную ответственность работодателя за задержку выплат, причитающихся работнику.

Перечень выплат, содержащийся в ст. 236 ТК РФ, не является исчерпывающим и включает, в частности, заработную плату, оплату отпуска, выплаты при увольнении и (или) другие выплаты, причитающиеся работнику.

За нарушение работодателем сроков указанных выплат, помимо них, работодатель обязан выплатить проценты, то есть денежную компенсацию, размер которой должен быть не ниже одной трехсотой ставки рефинансирования Центрального банка РФ от не выплаченных в срок сумм за каждый день задержки начиная со следующего дня после установленного срока выплаты по день фактического расчета включительно. В соответствии с указанием Центрального банка РФ от 13 сентября 2012 года N 2873-У «О размере ставки рефинансирования Банка России» начиная с 14 сентября 2012 года ставка рефинансирования установлена в размере 8,25 процента годовых.

В соответствии с положениями ст. 136 ТК РФ заработная плата выплачивается не реже чем каждые полмесяца в день, установленный правилами внутреннего трудового распорядка, коллективным договором, трудовым договором. Для отдельных категорий работников федеральным законом могут быть установлены иные сроки выплаты заработной платы.

Если день выплаты заработной платы совпадает с выходным, то работодатель обязан выплатить заработную плату в последний рабочий день, предшествующий выходному, на который пришелся день выплаты заработной платы.

В связи с этим право работника на получение компенсации за задержку выплаты заработной платы возникает по истечении половины месяца со дня выплаты части заработной платы.

Оплата отпуска производится не позднее чем за три дня до его начала (ч.9 ст. 136 ТК РФ). Соответственно, при оплате отпуска позднее трех дней до его начала у работника также возникает право на выплату ему денежной компенсации помимо отпускных денежных средств.

В соответствии со ст. 140 ТК РФ при прекращении трудового договора выплата всех сумм, причитающихся работнику от работодателя, производится в день увольнения работника. Если работник в день увольнения не работал, то соответствующие суммы должны быть выплачены не позднее следующего дня после предъявления уволенным работником требования о расчете. Невыполнение работодателем данной обязанности влечет возникновение у работника права на получение процентов за каждый день задержки выплаты причитающихся ему сумм.

Предусмотренная ст. 236 ТК РФ денежная компенсация выплачивается за каждый день просрочки, в том числе за выходные и нерабочие праздничные дни.

Размер выплачиваемой работнику денежной компенсации может быть повышен коллективным договором, ЛНА или трудовым договором. Таким образом, размер денежной компенсации не может быть меньше, чем установлено в ст. 236 ТК РФ.

Наличие обязанности выплатить денежную компенсацию законодатель не связывает с наличием вины работодателя в задержке причитающихся работнику выплат. В постановлении Пленума ВС РФ о применении судами ТК РФ даны разъяснения о том, что при рассмотрении спора, возникшего в связи с отказом работодателя выплатить работнику такую денежную компенсацию, необходимо иметь в виду, что в соответствии со ст. 236 ТК РФ суд вправе удовлетворить иск независимо от вины работодателя в задержке выплаты указанных сумм.

Кроме того, начисление процентов в связи с несвоевременной выплатой заработной платы не исключает права работника на индексацию сумм задержанной заработной платы в связи с их обесцениванием вследствие инфляционных процессов.

Другой комментарий к ст. 236 ТК РФ

1. Трудовой кодекс расширил перечень ситуаций, связанных с задержкой различных выплат, при которых наступает ответственность работодателя. Теперь она может возникать не только при задержке собственно заработной платы, но и в других случаях. В комментируемой статье определены как минимум три варианта привлечения работодателя к материальной ответственности за задержку выплат, причитающихся работнику. При этом не исключаются и иные выплаты, полагающиеся работнику.

2. Обязанность выплаты указанной денежной компенсации возникает независимо от наличия вины работодателя, что, безусловно, повышает гарантии для работника. В конце концов, именно работодатель является участником хозяйственной деятельности, несущим весь риск и всю ответственность за ее результаты. Если же данная ситуация возникнет в бюджетных организациях, то ответственность должны разделить государство или муниципальные образования, из бюджета которых финансируется деятельность данного работодателя.

Соответствующая позиция отражена и в Постановлении Пленума ВС РФ от 17 марта 2004 г. N 2 «О применении судами Российской Федерации Трудового кодекса Российской Федерации». При рассмотрении спора, возникшего в связи с отказом работодателя выплатить работнику проценты (денежную компенсацию) за нарушение срока выплаты заработной платы, оплаты отпуска, выплат при увольнении и других выплат, причитающихся работнику, необходимо иметь в виду, что в соответствии с комментируемой статьей суд вправе удовлетворить иск независимо от вины работодателя в задержке выплаты указанных сумм (п. 55 названного Постановления).

3. Если коллективным договором или трудовым договором определен размер процентов, подлежащий уплате работодателем в связи с задержкой выплаты заработной платы либо иных выплат, причитающихся работнику, суд исчисляет сумму денежной компенсации с учетом этого размера при условии, что он не ниже установленного комментируемой статьей.

Начисление процентов в связи с несвоевременной выплатой заработной платы не исключает права работника на индексацию сумм задержанной заработной платы в связи с их обесцениванием вследствие инфляционных процессов.

4. О сроках, в течение которых работник имеет право обратиться в суд по вопросу о взыскании причитающихся ему выплат, см. ст. 392 ТК.

Консультации и комментарии юристов по ст 236 ТК РФ

Если у вас остались вопросы по статье 236 ТК РФ и вы хотите быть уверены в актуальности представленной информации, вы можете проконсультироваться у юристов нашего сайта.

Задать вопрос можно по телефону или на сайте. Первичные консультации проводятся бесплатно с 9:00 до 21:00 ежедневно по Московскому времени. Вопросы, полученные с 21:00 до 9:00, будут обработаны на следующий день.

Статья 236 ТК РФ. Материальная ответственность работодателя за задержку выплаты заработной платы и других выплат, причитающихся работнику

Статья 236 ТК посвящена аспектам материальной ответственности нанимателя перед сотрудниками за задержку выплат причитающихся им денежных средств.

В ней приведены примеры подобных задержек и закреплён порядок расчёта величины компенсации.

Трудовой кодекс Российской Федерации от 30.12.2001 N 197-ФЗ

Положения ст. 236 ТК

В её начале указано, что при нарушении нанимателем сроков выплат денежных средств, положенных сотруднику, он обязан выплатить их с прибавкой соответствующей денежной компенсации. Минимальная граница этой суммы рассчитывается как одна сто пятидесятая актуальной ключевой ставки ЦБ от невыплаченных в срок средств. Начисляться она начинает с того дня, который следует за днём, когда сотруднику не были выданы положенные деньги. Окончание её начисления приходится на день фактической выплаты положенных средств с учётом данной компенсации.

В статье приведены примеры задержек. Они касаются:

  • зарплат;
  • отпускных;
  • выплат при увольнении.

Упомянуты и задержки по выплатам иных средств, положенных сотруднику.

Особо рассмотрена ситуация, когда сотрудник в положенный ему срок получает неполную сумму денег. Тогда базой для расчёта положенной ему компенсации является сумма невыплаченных средств.

Отмечено, что величина средств, положенных сотруднику по данной статье, может быть увеличена на основе соответствующих положений:

  • трудовых договоров индивидуального или коллективного характера;
  • локальных нормативных актов нанимателя.

Подчёркнуто, что обязанность по выплате компенсации действует независимо от наличия вины нанимателя.

Разобранная статья подробно регламентирует аспекты компенсации сотруднику за задержку выдачи нанимателем положенных ему денег. Также она подчёркивает, что эта компенсация необходима, даже если задержка произошла не по вине нанимателя.

Основные вопросы по положениям ст. 236 ТК

Как в ТК определяется срок выплаты средств персоналу?

Сроки, как и остальные параметры выплаты заработков персоналу, регулируются ст. 136. Сроки выплаты сумм, положенных сотруднику при его увольнении, определяются с помощью ст. 140.

Как эта статья будет действовать при высокой инфляции?

Ситуация, когда сумма компенсации, положенной по ст. 236, не покрывает потери от инфляции, уже разбиралась на уровне Верховного суда. Конкретно этот момент освещается в п. 55 Постановления Пленума ВС от 17.03.04. В нём подчёркнуто, что выплата сумм, положенных по ст. 236, не отменяет право сотрудника на дополнительную индексацию положенных ему выплат.

Требуются ли специальные обращения от сотрудника на выплату положенной ему по ст. 236 ТК компенсации?

Нет, каких-то специальных заявлений не требуется. Сумма компенсации по этой статье рассчитывается бухгалтерией, с учётом сроков просрочки и величины ключевой ставки ЦБ. Это не отменяет возможности сотрудника обращения в соответствующие инстанции при обнаружении им факта невыплаты денег.

Каковы сроки обращения в суд сотрудника по данной статье?

Конкретные сроки в самой ст. 236 ТК не установлены. В данном вопросе следует ориентироваться на ст. 392 ТК, которая регулирует сроки судебных разбирательств по трудовым взаимоотношениям между сотрудником и его работодателем. В её второй части указано, что у сотрудника есть год для обращения в суд по делам о полной либо частичной невыплате нанимателем причитающихся ему денег. Этот год отсчитывается с момента, когда не была вовремя осуществлена положенная выплата.

Каковы параметры компенсации по данной статье?

Она имеет ряд особенностей:

  • её размер может увеличиваться с помощью профильных положений колдоговоров и иных правовых документов;
  • минимальная граница рассчитывается исходя из 1/150 ключевой ставки ЦБ за день пропуска;
  • максимальная граница не установлена;
  • должна выплачиваться и без вины нанимателя, т.е. даже при возникновении форс-мажорных обстоятельств или ошибок конкретных менеджеров;
  • выплачивается любому сотруднику – никаких исключений по этому моменту в статье не предусмотрено.

Эти особенности объясняются не только стремлением гарантировать сотруднику получение заработанных им денег, но и стимулировать нанимателя к добросовестным расчётам с персоналом.

Федеральный закон №236-ФЗ от 3 декабря 2012 г.

«О внесении изменений в Трудовой кодекс Российской Федерации и статью 1 Федерального закона «О техническом регулировании»»

Статья 1

Внести в Трудовой кодекс Российской Федерации (Собрание законодательства Российской Федерации, 2002, N 1, ст. 3; 2004, N 35, ст. 3607; 2006, N 27, ст. 2878; 2007, N 17, ст. 1930; N 43, ст. 5084; 2008, N 9, ст. 812; 2011, N 49, ст. 7031) следующие изменения:

1) абзац третий части второй статьи 57 дополнить словами «, или соответствующим положениям профессиональных стандартов»;

2) в статье 143:

а) часть восьмую после слова «служащих» дополнить словами «или с учетом профессиональных стандартов»;

б) часть девятую после слова «служащих» дополнить словами «или профессиональных стандартов»;

3) часть пятую статьи 144 после слова «служащих» дополнить словами «или профессиональных стандартов»;

4) главу 31 дополнить статьей 195. 1 следующего содержания:

«Статья 195.1. Понятия квалификации работника, профессионального стандарта

Квалификация работника — уровень знаний, умений, профессиональных навыков и опыта работы работника.

Профессиональный стандарт — характеристика квалификации, необходимой работнику для осуществления определенного вида профессиональной деятельности.

Порядок разработки, утверждения и применения профессиональных стандартов, а также установления тождественности наименований должностей, профессий и специальностей, содержащихся в едином тарифно-квалификационном справочнике работ и профессий рабочих, едином квалификационном справочнике должностей руководителей, специалистов и служащих, наименованиям должностей, профессий и специальностей, содержащихся в профессиональных стандартах, устанавливается Правительством Российской Федерации с учетом мнения Российской трехсторонней комиссии по регулированию социально-трудовых отношений.»;

5) часть первую статьи 330.2 дополнить словами «, или соответствующим положениям профессиональных стандартов».

Статья 2

Пункт 3 статьи 1 Федерального закона от 27 декабря 2002 года N 184-ФЗ «О техническом регулировании» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2002, N 52, ст. 5140; 2007, N 19, ст. 2293; N 49, ст. 6070; 2011, N 30, ст. 4603; N 49, ст. 7025) дополнить словами «, профессиональные стандарты».

Президент Российской Федерации

В.В. Путин

Статья 236 Трудового Кодекса РФ. Материальная ответственность работодателя за задержку выплаты заработной платы и других выплат, причитающихся работнику.

Текст статьи 236 ТК РФ:

При нарушении работодателем установленного срока соответственно выплаты заработной платы, оплаты отпуска, выплат при увольнении и (или) других выплат, причитающихся работнику, работодатель обязан выплатить их с уплатой процентов (денежной компенсации) в размере не ниже одной сто пятидесятой действующей в это время ключевой ставки Центрального банка Российской Федерации от не выплаченных в срок сумм за каждый день задержки начиная со следующего дня после установленного срока выплаты по день фактического расчета включительно. При неполной выплате в установленный срок заработной платы и (или) других выплат, причитающихся работнику, размер процентов (денежной компенсации) исчисляется из фактически не выплаченных в срок сумм.

Размер выплачиваемой работнику денежной компенсации может быть повышен коллективным договором, локальным нормативным актом или трудовым договором. Обязанность по выплате указанной денежной компенсации возникает независимо от наличия вины работодателя.


В соответствии со ст. 236 ТК РФ судами были приняты решения по следующим делам:

Решение суда № 1: при увольнении сотрудника работодатель не в полном размере выплатил последнему причитающиеся денежные средства. Сотрудник обратился в суд. Решением суда требования работника были удовлетворены: работнику выплачена задолженность по выплате окончательного расчета при увольнении, компенсация за задержку выплат, компенсация морального вреда. 

Посмотреть решение суда и проект искового заявления.

Решение суда № 2: Работодатель сократил штат своей организации. Работник был уволен по инициативе работодателя в связи с сокращением штата в порядке ч. 2 ст.81 ТК РФ. При увольнении сотрудника работодатель не  выплатил последнему выходное пособие.

Посмотреть решение суда и проект искового заявления.

Решение суда № 3: Работодатель несвоевременно выплачивал заработную плату своим сотрудникам. По причине задержки выплаты заработной платы часть сотрудников приняло решение об увольнении из организации. При увольнении окончательный расчет с работниками произведен не был. Сотрудник обратился в суд. Решением суда требования работника были удовлетворены.

Посмотреть решение суда и проект искового заявления.

Решение суда № 4: Сотрудник являлся руководителем компании ответчика. По решению учредителей трудовые отношения с работником в письменном виде не оформлялись, трудовой договор не заключался. Работнику заработная плата не выплачивалась, а впоследствии учредителями было принято решение об увольнении работника. Компенсация за расторжение трудового договора с руководителем организации по инициативе собственников в размере 3-х размеров заработной платы работнику выплачена также не была. Сотрудник обратился в суд. Решением суда требования работника были удовлетворены: работнику выплачена заработная плата, компенсация за увольнение.

Посмотреть решение суда и проект искового заявления.

Решение суда № 5: Работник по своей инициативе расторг трудовой договор с работодателем. При увольнении с работником не был произведен окончательный расчет: работнику не было выплачено пособие по временной нетрудоспособности.  Работник обратился в суд с исковым заявлением. Требования работника были удовлетворены: с работодателя взыскана сумма пособия по временной нетрудоспособности, компенсация за задержку выплаты денежных средств и компенсация морального вреда.

Посмотреть решение суда и проект искового заявления.

Решение суда № 6: Сотрудник работал в компании ответчика на должности техника. На протяжении 2-х недель сотрудник на работу не являлся, о причинах своей неявки работодателю не сообщал. По вышеизложенным причинам работодатель посчитал возможным уволить сотрудника на основании п.5 ч. 1 ст. 81 Трудового кодекса РФ – неоднократного неисполнения работником без уважительных причин трудовых обязанностей, если он имеет дисциплинарное взыскание. Однако, уволенный сотрудник ранее дисциплинарных взысканий не имел, и как выяснилось в ходе судебного заседания в период своего отсутствия на работе находился на больничном. Сотрудник не согласился со своим увольнением и обратился с исковым заявлением в суд. Решением суда требования работника были удовлетворены. 

Посмотреть решение суда и проект искового заявления.

Решение суда № 7: Между работником и работодателем был заключен трудовой договор на неопределенны срок, в дальнейшем сторонами договора было подписано дополнительное соглашение, в соответствии с условиями которого трудовой договор признавался срочным. По окончанию срока действия договора работнику работодателем был ограничен доступ к рабочему месту: электронный пропуск аннулирован, доступ к рабочей электронной почте отключен. Работнику было направлено уведомление о расторжении с ним трудового договора в связи с окончанием срока его действия. Не согласившись с позицией работодателя, работник обратился в суд.

Посмотреть решение суда и проект искового заявления.

Решение суда № 8: Работника вынудили уволиться по собственному желанию. При увольнении трудовая книжка работодателем выдана не была. Сотрудник продолжал исполнять свои трудовые обязанности. При получении трудовой книжки работником было обнаружено, что в ней отсутствует дата приема на работу и неверно указана дата увольнения. Сотрудник обратился в суд. Решением суда требования работника были удовлетворены: на работодателя возложена обязанность изменить записи в трудовой книжке, выплатить работнику компенсацию за неиспользованный отпуск, компенсацию морального вреда и судебных расходов.

Посмотреть решение суда и проект искового заявления.

Глава 38. Материальная ответственность работодателя перед работником

Статья 234. Обязанность работодателя возместить работнику материальный ущерб, причиненный в результате незаконного лишения его возможности трудиться

Работодатель обязан возместить работнику не полученный им заработок во всех случаях незаконного лишения его возможности трудиться. Такая обязанность, в частности, наступает, если заработок не получен в результате:

незаконного отстранения работника от работы, его увольнения или перевода на другую работу;

отказа работодателя от исполнения или несвоевременного исполнения решения органа по рассмотрению трудовых споров или государственного правового инспектора труда о восстановлении работника на прежней работе;

задержки работодателем выдачи работнику трудовой книжки, внесения в трудовую книжку неправильной или не соответствующей законодательству формулировки причины увольнения работника;

абзац утратил силу. — Федеральный закон от 30.06.2006 N 90-ФЗ.

Статья 235. Материальная ответственность работодателя за ущерб, причиненный имуществу работника

Работодатель, причинивший ущерб имуществу работника, возмещает этот ущерб в полном объеме. Размер ущерба исчисляется по рыночным ценам, действующим в данной местности на день возмещения ущерба.

(в ред. Федерального закона от 30.06.2006 N 90-ФЗ)

При согласии работника ущерб может быть возмещен в натуре.

Заявление работника о возмещении ущерба направляется им работодателю. Работодатель обязан рассмотреть поступившее заявление и принять соответствующее решение в десятидневный срок со дня его поступления. При несогласии работника с решением работодателя или неполучении ответа в установленный срок работник имеет право обратиться в суд.

Статья 236. Материальная ответственность работодателя за задержку выплаты заработной платы и других выплат, причитающихся работнику

(в ред. Федерального закона от 30. 06.2006 N 90-ФЗ)

При нарушении работодателем установленного срока соответственно выплаты заработной платы, оплаты отпуска, выплат при увольнении и (или) других выплат, причитающихся работнику, работодатель обязан выплатить их с уплатой процентов (денежной компенсации) в размере не ниже одной трехсотой действующей в это время ставки рефинансирования Центрального банка Российской Федерации от невыплаченных в срок сумм за каждый день задержки начиная со следующего дня после установленного срока выплаты по день фактического расчета включительно. Размер выплачиваемой работнику денежной компенсации может быть повышен коллективным договором, локальным нормативным актом или трудовым договором. Обязанность выплаты указанной денежной компенсации возникает независимо от наличия вины работодателя.

(в ред. Федеральных законов от 30.06.2006 N 90-ФЗ, от 23.04.2012 N 35-ФЗ)

Статья 237. Возмещение морального вреда, причиненного работнику

Моральный вред, причиненный работнику неправомерными действиями или бездействием работодателя, возмещается работнику в денежной форме в размерах, определяемых соглашением сторон трудового договора.

В случае возникновения спора факт причинения работнику морального вреда и размеры его возмещения определяются судом независимо от подлежащего возмещению имущественного ущерба.

Зарплаты нужно платить, даже если компания признана банкротом

24
ноября
2015

Зарплаты нужно платить, даже если компания признана банкротом

Вязовик_Трудовые споры_Проценты за задержку зарплаты нужно платить, даже если компания признана банкротом_11.2015

Скачать файл
Файл добавлен 15.08.2019
Презентация .pdf (122 Кб)

Компания была признана банкротом и сейчас находится на стадии конкурсного производства. Тем не менее не все сотрудники еще уволены и определенная работа ведется, однако из-за отсутствия денежных средств зарплата выплачивается нерегулярно. Должен ли работодатель выплатить компенсацию за задержку текущей зарплаты в период конкурсного производства, или же проценты по ст. 236 ТК РФ можно выплатить при окончательном расчете с сотрудниками по завершении процедуры банкротства? — спрашивает Мария Ротанова через сайт tspor.ru?

Опытом поделился Александр Вязовик, руководитель направления по банкротству юридической фирмы VEGAS LEX:

— Работодатель банкрот даже на стадии конкурсного производства должен платить проценты за задержку зарплаты, поскольку такие выплаты относятся к текущим платежам.

Исходя из положений ст. 236 ТК РФ, обязанность выплатить проценты в случае просрочки уплаты заработной платы возникает независимо от вины работодателя. Следовательно, обязанность такой выплаты может возникнуть, в том числе, и в связи с отсутствием у работодателя денежных средств. Причины возникновения бедственного финансового положения в этой ситуации не имеют значения.

Согласно п. 1 с т.126 Федерального закона от 26.10.2002 № 127- ФЗ «О несостоятельности (банкротстве)» (далее — Закон № 127- ФЗ), с введением процедуры конкурсного производства начисление процентов, неустоек (штрафов, пеней) на требования по текущим платежам не прекращается.

При этом требования об оплате труда лиц, работающих у должника по трудовому договору, возникшие после даты принятия заявления о признании должника банкротом, относятся именно к текущим платежам (п. 1 ст. 5 Закона № 127-ФЗ).

Таким образом, работодатель обязан выплатить компенсацию работнику за задержку текущей заработной платы в ходе конкурсного производства.

Дополнительно отметим, что, исходя из п. 40 постановления Пленума ВАС РФ от 23.07.2009 № 60, требования кредиторов по текущим платежам о применении мер ответственности за неисполнение или ненадлежащее исполнение обязательств подлежат удовлетворению в соответствии с абз. 5 п. 2 ст. 134 Закона № 127-ФЗ в пятую очередь текущих платежей. Выплата процентов по правилам ст. 236 ТК РФ будет осуществляться по остаточному принципу после выплаты вознаграждения конкурсному управляющему, заработной платы работникам, оплаты работы лицам, привлеченным управляющим для выполнения им своих обязанностей в рамках банкротного дела, а также после уплаты коммунальных платежей.


Статья 236 ТК РФ с комментариями. Материальная ответственность работодателя за задержку выплаты заработной платы и других выплат, причитающихся работнику

Организация работы и кадровые вопросы в связи с коронавирусомОбразцы основных документов в связи с коронавирусомНерабочие дни в связи с коронавирусом

Образцы заполнения кадровых документовФормы первичных учетных документовСведения о трудовой деятельности (электронная трудовая книжка)Ведение трудовых книжек в бумажном виде

Специальная оценка условий трудаНесчастный случай на производствеОбязательные медосмотры (профосмотры)Инструктажи по охране труда

Обязательные документы при проверкахКалендарь кадровика

Хранение и использование персональных данныхМеры по защите персональных данных работниковОтветственность за нарушения законодательства о персональных данных

Привлечение иностранцевОформление иностранцев

Оформление приема на работуТрудовой договор

График отпусковЗамена отпуска денежной компенсациейОформление ежегодного оплачиваемого отпускаОтпуск по беременности и родамОтпуск по уходу за ребенкомЛьготный (дополнительный) отпуск

График работыПривлечение, оформление и оплатаУчет рабочего времениВыходные и праздничные дни

Правила внутреннего трудового распорядка (ПВТР)Дисциплинарные взысканияПорядок увольнения за нарушение трудовой дисциплины

Заработная платаРайонные коэффициенты и надбавкиМатериальная ответственность работника

Оплата больничного листа (не пилотный проект)Оплата больничного листа (пилотный проект)Заполнение больничного листа работодателемРабота с электронными больничнымиПособие по беременности и родам

Порядок проведения аттестацииОграничения на увольнение из-за непрохождения аттестацииРасходы на подготовку и переподготовку кадров

Основания для увольненияПроцедура увольнения по сокращению

Перейти в telegram-чат

Ниобат лития: сводка физических свойств и кристаллической структуры

  • К. Нассау, Х.Дж. Левинштейн, Г.М. Loiacono: J. Chem. физ. Твердые вещества 27 , 983–988 (1966)

    Google Scholar

  • К. Нассау, Х.Дж. Левинштейн, Г.М. Loiacono: J. Chem.физ. Твердые вещества 27 , 989–996 (1966)

    Google Scholar

  • S.C.Abrahams, J.M.Reddy, J.L.Bernstein: J. Chem. физ. Твердые вещества 27 , 997–1012 (1966)

    Google Scholar

  • С. К. Абрахамс, У. К. Гамильтон, Дж. М. Редди: J. Chem. физ. Твердые вещества 27 , 1013–1018 (1966)

    Google Scholar

  • С.К. Абрахамс, У.К. Гамильтон, Дж. М. Редди: J. Chem. физ. Твердые вещества 27 , 1019–1026 (1966)

    Google Scholar

  • С. К. Абрахамс, Э. Бюлер, В. К. Гамильтон, С.Дж. Лаплака: J. Chem. физ. Твердые вещества 34 , 521–532 (1973)

    Google Scholar

  • Б.К. Вайнштейн: Современная кристаллография I , Springer Ser. Науки о твердом теле. 15 (Спрингер, Берлин, Гейдельберг, 1981)

    Google Scholar

  • Проц.IRE 37 , 1378–1395 (1949)

  • Г.Д. Бойд, Р.К. Миллер, К. Нассау, В.Л. Бонд, А. Сэвидж: Appl. физ. лат. 5 , 234–236 (1964)

    Google Scholar

  • И.П. Каминов, Э.Х. Тернер, Р.Л. Барнс, Дж.Л. Бернштейн: J. Appl. физ. 51 , 4379–4384 (1980)

    Google Scholar

  • А. Раубер (Э. Калдис, ред.): Текущие темы Матем. науч. 1 , 481–601 (Северная Голландия, Амстердам, 1978 г.)

    Google Scholar

  • П. Лернер, К. Легра, Дж. П. Думан: J. Cryst. Рост 3/4 , 231–235 (1968)

    Google Scholar

  • Дж.Р.Каррутерс, Г.Э. Петерсон, М. Грассо, П.М. Bridenbaugh: J. Appl. физ. 42 , 1846–1851 (1971)

    Google Scholar

  • Дж.Г. Бергман, А. Ашкин, А.А. Ballman, J.M. Dziedzic, HJ Levinstein, R.G. Смит: заявл. физ. лат. 12 , 92–94 (1968)

    Google Scholar

  • К.Сугии, Х. Коидзуми, С. Миядзава, С. Кондо: J. Cryst. Рост 33 , 199–202 (1976)

    Google Scholar

  • Ю.С. Ким, Р.Т. Смит: J. Appl. физ. 40 , 4637–4641 (1969)

    Google Scholar

  • Дж.С. Браудер, С. С. Баллард: Appl. Опц. 16 , 3214–3217 (1977)

    Google Scholar

  • эл.g., Crystal Technology, Inc., 2510 Old Middlefield Way, Mountain View, CA 94040, USA

  • A. Savage: J. Appl. физ. 37 , 3071–3072 (1966)

    Google Scholar

  • А.В. Уорнер, М. Оноэ, Г.А. Кокин: J. Acoust. соц. Являюсь. 42 , 1223–1231 (1967)

    Google Scholar

  • Р.Т. Смит, Ф.С. Валлийский: J. Appl. физ. 42 , 2219–2230 (1971)

    Google Scholar

  • Т.Ямада, Н. Ниизэки, Х. Тойода: Jpn. Дж. Заявл. физ. 6 , 151–155 (1967)

    Google Scholar

  • Дж. Р. Тиг, Р. Р. Райс, Р. Герсон: J. Appl. физ. 46 , 2864–2866 (1975)

    Google Scholar

  • Ю. Накагава, К. Яманучи, К. Шибаяма: Дж. заявл. физ. 44 , 3969–3974 (1973)

    Google Scholar

  • Э.Х. Тернер, Ф.Р. Нэш, П.М. Bridenbaugh: J. Appl. физ. 41 , 5278–5281 (1970)

    Google Scholar

  • Г. Д. Бойд, В. Л. Бонд, Х. Л. Картер: J. Appl. физ. 38 , 1941–1943 (1967)

    Google Scholar

  • Д.С. Смит, Х.Д. Ричциус, Р. П. Эдвин: Opt. коммун. 17 , 332–335 (1976) Также опечатки 20 , 188 (1977)

    Google Scholar

  • Г.Дж. Эдвардс, М. Лоуренс: Opt. Квантовый электрон. 16 , 373–374 (1984)

    Google Scholar

  • JF Nyc: Physical Properties of Crystals (Oxford U. Press, Oxford 1957) p. 115

    Google Scholar

  • Т.Ямада (K.-H. Hellwege, изд.): Landolt-Börnstein Числовые данные и функциональные взаимосвязи в науке и технике, Новая серия, Группа III, Vol. 16a (Springer, Berlin, Heidelberg 1981), стр. 149–156 и стр. 489–499

    Google Scholar

  • Р.А. Грэм: Ферроэлектр. 10 , 65–69 (1976)

    Google Scholar

  • Р.А. Грэм: J. Appl. физ. 48 , 2153–2163 (1977)

    Google Scholar

  • Дж.Д. Зук, Д. Чен, Г.Н. Отто: заявл. физ. лат. 11 , 159–161 (1967)

    Google Scholar

  • М. ДиДоменико-младший, С.Х. Источник: J. Appl. физ. 40 , 720–752 (1969)

    Google Scholar

  • А.А. Бережной: Опт. Спектроск. 49 , 178–181 (1980)

    Google Scholar

  • стр. В. Лензо, Э.Г. Спенсер, К. Нассау: J. Opt. соц. Являюсь. 56 , 633–635 (1966)

    Google Scholar

  • Э. Бернал, Г.Д. Чен, Т.С. Ли: Физ. лат. 21 , 259–260 (1966)

    Google Scholar

  • П.Х. Смакула, П.К. Застежка: Пер. Металл. соц. AIME 239 , 421–24 (1967)

    Google Scholar

  • К.Онуки, Н. Учида, Т. Саку: J. Opt. соц. Являюсь. 62 , 1030–1032 (1972)

    Google Scholar

  • Э.Х. Тернер цитируется в [11]

    Google Scholar

  • Э.Х. Тернер: заявл. физ. лат. 8 , 303–304 (1966)

    Google Scholar

  • Э. Х. Тернер: J. Opt. соц. Являюсь. 56 , 1426 (1966)

    Google Scholar

  • А.А. Блистанов, Н.В. Переломова, Л.Е. Чирков, В.А. Шкитин: Сов. физ.-крист. 24 , 287–291 (1979)

    Google Scholar

  • А.Р. Хатсон, Д.Л. Белый: J. Appl. физ. 33 , 40–47 (1962)

    Google Scholar

  • Дж.Дж. Кяме: J. Acoust. соц. Являюсь. 21 , 159–167 (1949)

    Google Scholar

  • Д.Ф. Нельсон, М. Лакс: Phys. Rev. B 3 , 2778–2794 (1971) Также Erratum Phys. B 4 , 3779 (1971)

    Google Scholar

  • Д.Ф. Нельсон, М. Лакс: Phys. Преподобный Летт. 24 , 379–380 (1970)

    Google Scholar

  • Л.Марлеску, Г. Оре: Compt. Ренд. акад. науч. (Б) 276 , 555–558 (1973)

    Google Scholar

  • Р. В. Диксон: J. Appl. физ. 38 , 5149–5153 (1967)

    Google Scholar

  • В.В. Леманов, О.В. Шакин, Г.А. Смоленский: Сов. физ. -Твердотельный 13 , 426–28 (1971)

    Google Scholar

  • Р.Дж. О’Брайен, Г.Дж. Розаско, А. Вебер: J. Opt. соц. Являюсь. 60 , 716 (1970)

    Google Scholar

  • В.В. Клудзин: Сов. Phys.-Solid State 13 , 540–541 (1971)

    Google Scholar

  • А.А. Oliner (ed.): Акустические поверхностные волны , Topics Appl. физ. 24 (Springer, Berlin, Heidelberg, 1978) гл. 6

    Google Scholar

  • И.К. Чанг: IEEE Trans. СУ- 23 , 2–22 (1976)

    Google Scholar

  • Е.И. Гордон: IEEE J. QE- 2 , 104–105 (1966)

    Google Scholar

  • Т.М. Смит, А. Корпель: IEEE J. QE- 1 , 283–284 (1965)

    Google Scholar

  • Гласс, Д. фон дер Линде, Т. Дж. Негран: заявл. физ. лат. 25 , 233–235 (1974)

    Google Scholar

  • Х.М. Смит (ред.): Материалы для голографической записи , Topics Appl. физ. 20 (Springer, Berlin, Heidelberg 1977) гл. 4

    Google Scholar

  • В.М. Фридкин, Р.Г. Магомадов: Письма в ЖЭТФ. 30 , 686–688 (1979)

    Google Scholar

  • В.М. Фридкин: Ферроэлектр. 53 , 169–187 (1984)

    Google Scholar

  • HG Festl, P. Hertel, E. Kratzig, R. von Baltz: Phys. Стат. Сол. Б 113 , 157–164 (1982)

    Google Scholar

  • Р.Гроуссон, М. Генри, С. Маллик, С.Л. Сюй: J. Appl. физ. 54 , 3012–3016 (1983)

    Google Scholar

  • AB Банковские сифоны Tk 236cr подробнее

    Комиссия по борьбе с коррупцией обнаружила еще один случай отмывания денег на сумму около 236 крор тенге AB Bank Ltd с использованием своих оффшорных банковских услуг.

    После расследования, которое длилось около трех с половиной лет, соответствующая следственная группа ACC обнаружила причастность 25 человек, в основном из тогдашнего правления, в том числе председателя банка М. Вахидула Хака, сообщил New Age в понедельник генеральный директор ACC.

    Он сказал, что вскоре в связи с этим будут возбуждены три отдельных дела, поскольку группа под руководством Джахангира Алама уже представила свои выводы в комиссию, требуя одобрения для подачи дел.

    Из 25 человек по всем трем делам будут привлечены к уголовной ответственности около 18 человек, сказал он.

    Он сказал, что деньги были отмыты в Сингапур и Дубай в период с 2014 по 2016 год.

    В сговоре с частью руководства банка и должностными лицами три иностранные компании, использующие адреса в Сингапуре и Дубае, подали заявки в банк на получение кредитов от его оффшорного банковского подразделения в то время, сказал чиновник, добавив, что таких компаний не существует.

    Поддельными компаниями являются Sematcity General Trading LLC, ATZ Communications Pte Ltd и Euro Cars Holdings Pte Ltd.

    Согласно заключению, компании открыли счета в банке после того, как подали заявки на получение кредита.

    Из трех компаний одна получила 60,40 крор тенге, другая 14,88 крор, а третья 160,80 крор, сказал чиновник.

    5 марта комиссия в связи с другим инцидентом с отмыванием денег одобрила обвинительный акт против Вахидул Хак и еще семи человек по обвинению в их предполагаемой причастности к отмыванию около 165 крор тенге в Объединенные Арабские Эмираты.

    Семь других обвиняемых — директор AB Bank Сайед Афзал Хасан Уддин, его бывший глава финансовых учреждений и казначейства Абу Хена Мустафа Камаль, его бывшие управляющие директора М. Фазлур Рахман и Шамим Ахмед Чаудхури, глава оффшорного банковского подразделения в Читтагонге Мохаммад Локман, заместитель — президент Мохаммад Махфузул Ислам и бизнесмен Сайфул Хак.

    Согласно выводам комиссии, восемь подозреваемых отмыли сумму по сговору друг с другом в период с сентября 2013 года по февраль 2014 года, грубо нарушив законодательство страны.

    28 декабря 2017 года на допросах Вахид признал свою причастность к инциденту с отмыванием денег, по его словам.

    25 января 2018 года комиссия арестовала Вахидула Хака, Абу Хену Мустафу Камаля и бизнесмена Сайфула Хака.

    Анализ in vitro цидофовира и генно-инженерная экспрессия ТК как потенциальные подходы к вмешательству в лечение рака на основе ColoAd1 самораспространяются и тем самым увеличивают терапевтическую дозу в зависимости от опухоли.

    1 Кроме того, они обладают способностью циркулировать внутри организма, что делает возможным лечение как первичных, так и метастатических поражений. Однако на сегодняшний день онколитические вирусы еще не полностью реализовали свой потенциал в качестве эффективного нового класса противоопухолевых агентов. Несмотря на доказанную безопасность в многочисленных клинических испытаниях, их общая эффективность в качестве монотерапии была разочаровывающей. Поскольку только один онколитический вирус (h201) 2 одобрен для лечения рака, необходимо повысить эффективность этих агентов, если они должны рассматриваться как эффективное средство для лечения рака.

    Недавно мы разработали новый химерный онколитический вирус аденовирус-3 (Ad3)/Ad11p, названный ColoAd1. 1 Было показано, что этот вирус обладает более высокой активностью по сравнению с исходными вирусами in vitro (на панели линий опухолевых клеток), ex vivo (на эксплантатах опухоли пациентов) и in vivo (в метастазах в печени). модель рака толстой кишки). Хотя ColoAd1 продемонстрировал высокую степень селективности и безопасности во всех исследованиях, проведенных на сегодняшний день, это искусственные системы, которые могут не полностью имитировать условия у онкологического больного.Поэтому, чтобы обеспечить достаточную безопасность в клинике, мы изучили, могут ли клинически одобренные противовирусные препараты, которые использовались в качестве экспериментальных средств для лечения инфекций Ad, рибовирин (RBV) и цидофовир (CDV), служить потенциальными «предохранительными клапанами» для этого вируса. лечение. Кроме того, ген вируса простого герпеса-тимидинкиназы ( HSV-TK ) был включен в вирусный геном ColoAd1, чтобы проверить, может ли генно-инженерная чувствительность к ганцикловиру (GCV) быть эффективным средством лечения вирусной инфекции. .

    Аденовирусы вызывают ряд клинических синдромов у здоровых, иммунокомпетентных лиц, которые обычно слабо выражены и проходят самостоятельно. Тем не менее, Ad-инфекцию все чаще признают важным патогеном у лиц с ослабленной иммунной системой, что приводит к острому геморрагическому циститу и острой почечной недостаточности у младенцев, детей младшего возраста и у пациентов с ослабленным иммунитетом. Таким образом, различные клинически одобренные противовирусные препараты были протестированы в качестве потенциальных методов лечения, включая GCV, RBV и CDV 3, 4 , и только два из них, RBV и CDV, показали обнадеживающую клиническую активность. 3, 4, 5 RBV (1-β-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид) представляет собой аналог пуринового нуклеозида, который превращается в трифосфатную форму под действием клеточных ферментов и проявляет активность против нескольких разные вирусы. Было показано, что RBV in vitro высокоэффективен против вирусов Ad группы C, но неэффективен против других групп Ad. 6, 7 Поскольку ColoAd1 происходит от двух вирусов группы B, Ad11p и Ad3, предполагается, что ColoAd1 и его родительские вирусы, Ad3 или Ad11p, должны быть устойчивы к лечению RBV.Однако это усложняет тот факт, что RBV и CDV являются аналогами нуклеозидов и нуклеотидов, которые ингибируют репликацию вирусной ДНК, воздействуя на вирусную ДНК-полимеразу. Поскольку этот белок изменен в ColoAd1, 1 , способность этих методов лечения влиять на вирусную репликацию этого вируса может быть непредсказуемой. Когда мы проверили активность RBV по блокированию репликации и распространения вируса на клеточной линии рака толстой кишки (HT-29), клеточной линии рака яичников (SKOV-3) и на нормальных эндотелиальных клетках (HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) ), ColoAd1 и его исходные вирусы были чувствительны к RBV в более высоких концентрациях (333 мкМ) в линии раковых клеток HT-29, ColoAd1 и Ad3 были чувствительны к RBV в линии раковых клеток SKOV-3, но все вирусы были относительно устойчивы к лечение в нормальной эндотелиальной клеточной линии (рис. 1a–c).Это говорит о том, что RBV не может быть эффективным предохранительным клапаном для ColoAd1 в клинических условиях.

    Рисунок 1

    Влияние рибавирина (RBV) на ColoAd1. Клетки (HT-29 (ATCC, Manassas, VA, USA), SKOV3 (ATCC) и эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC, Vec Technologies, Rensselaer, NY, USA)) высевали в 96-луночный формат при плотности, определяемой для каждой линии опухолевых клеток для создания сливающегося монослоя в течение 24 часов (10 тыс. на лунку для HUVEC, 50 тыс. на лунку для HT-29, 50 тыс. на лунку для SKOV3).Этим плотно засеянным клеткам давали возможность расти в течение 2 дополнительных дней перед воздействием тестируемого(ых) вируса(ов). Инфицирование как опухолевых, так и первичных нормальных клеток проводили в четырех повторностях. Аденовирус (Ad) серотипа Ad3 (штамм GB) был приобретен в ATCC, а Ad11p (штамм Slobitski) был любезным подарком от доктора Уильяма С.М. Уолда из Университета Сент-Луиса. Вирусные запасы размножали на клетках эмбриональной почки человека 293 (Университет Макмастера, Гамильтон, Онтарио, Канада) и очищали в градиентах CsCl. 24, 25 Метод, используемый для количественного определения и частичной характеристики вирусных частиц, основан на методе Shabram et al. , 26 , за исключением того, что вместо Resource Q (GE Healthcare, Пискатауэй, Нью-Джерси, США) использовали анионообменную среду TMAE Fractogel (EM Sciences, Gibbstown, NJ, USA). 27 Каждый вирус разводили в 100  мкл среды, чтобы получить ввод вируса, эквивалентный их заранее определенной IC50 50 на каждой клеточной линии. (Для клеток HT-29 используемые значения IC 50 были равны 0.02 VP на ячейку для ColoAd1, 1,87 VP на ячейку для Ad11p и 45 VP на ячейку для Ad3. На HUVEC используемые значения IC 50 составляли 50 VP на клетку для ColoAd1, 399 Vp на клетку для Ad11p и 799 VP на клетку для Ad3. Для клеток SKOV3 используемые значения IC 50 составляли 20 VP на клетку для ColoAd1, 150 VP на клетку для Ad11p и 50 VP на клетку для Ad3). Вирус добавляли в каждую лунку и оставляли для заражения на 2 ч при 37°С. Через 2 часа вирус аспирировали и заменяли серийными разведениями испытуемых соединений в 100 мкл среды на лунку, начиная с 100 мкМ для цидофовира (Gilead, Фостер-Сити, Калифорния, США) и 1000 мкМ для рибавирина (Sigma, Сент-Луис). , Миссури, США).После заранее определенного количества дней инкубации (5–8 дней для HT-29 и HUVEC) клетки подвергали анализу MTS в соответствии с инструкциями производителя (CellTiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, WI, США). Псевдоинфицированные/обработанные противовирусным средством клетки служили в качестве отрицательного контроля и устанавливали 100% точку выживания для данного анализа. RBV в значительной степени ингибирует инфекцию ColoAd1 на клетках ( и ) HT-29 и ( и ) SKOV3, но лишь в минимальной степени ( и ) на клетках HUVEC.

    Цидофовир представляет собой монофосфатный нуклеотидный аналог цитозина, который ингибирует вирусные ДНК-полимеразы и проявляет активность против многих ДНК-вирусов. В исследовании in vitro , сравнивавшем CDV и RBV, анти-Ad-активность CDV была значительно лучше, чем у RBV, 8 , и также сообщалось об аналогичных наблюдениях на ограниченном наборе клинических изолятов. 9, 10, 11 Противовирусную активность CDV в отношении ColoAd1 тестировали вместе с его исходными вирусами, Ad11p и Ad3 (рис. 2a–c).Это исследование показывает, что ColoAd1 чувствителен к лечению CDV в клетках HT29, SKOV-3 и HUVEC с почти полным ингибированием, достигаемым как в опухолевых, так и в нормальных клетках, в отличие от относительно слабой противовирусной активности, наблюдаемой у RBV (рис. 1). Важно отметить, что существуют новые липидные составы CDV с повышенной активностью против Ad in vitro , включая вирусы группы B, что позволяет предположить, что они также могут предложить потенциально более эффективную альтернативу оригинальному CDV, использованному в этих исследованиях. 12

    Рисунок 2

    Влияние цидофовира (CDV) на ColoAd1. Посев клеток, дозировку вируса, введение лекарственного средства и экспозицию проводили, как показано на рисунке 1. CDV ингибирует инфекцию ColoAd1 на ( a ) HT-29, ( b ) SKOV3 и ( c ) эндотелиальных клетках пупочной вены человека ( HUVEC) клетки.

    Альтернативой одобренному противовирусному препарату для вмешательства в клинических условиях является генная инженерия вируса для создания чувствительности к одобренному лекарству.В случае онколитического вируса это может быть достигнуто путем «вооружения» вируса ферментом, превращающим пролекарство, и введением одобренного пролекарства. 13 Выбор включения гена HSV-TK в вирус в качестве предохранительного клапана основан на нескольких параметрах. Как было показано ранее другими, 8 ген HSV-TK , когда он включен и экспрессируется из реплицирующегося вирусного генома, может быть высокоэффективным средством для ограничения репликации и распространения вируса, когда пролекарство GCV вводится до терапевтических уровней. .GCV и родственные агенты, широко используемые для лечения инфекции HSV у людей, являются плохими субстратами для нуклеозидмонофосфаткиназы млекопитающих, но могут быть преобразованы в монофосфат в 1000 раз более эффективно с помощью гена HSV-TK . Впоследствии монофосфат GCV может быть затем преобразован клеточными киназами сначала в дифосфат GCV и, в конечном счете, в токсичную форму GCV-трифосфат. Трифосфат GCV конкурирует с дезоксигуанозинтрифосфатом за включение в удлиняющуюся ДНК во время клеточного деления, вызывая ингибирование ДНК-полимеразы и одноцепочечные разрывы. 14, 15 Фосфорилирование пролекарства GCV превращает его из формы, свободно проходящей через клеточные мембраны, в более гидрофильную молекулу и, таким образом, препятствует проникновению через клеточную мембрану, создавая зависимость от щелевых контактов или, в меньше примеров, другие плохо описанные механизмы эффективного эффекта свидетеля. 16 Поскольку было показано, что большинство опухолевых тканей подавляют коммуникацию функции межклеточной щели, 17, 18, 19, 20 активная, токсическая форма пролекарства должна быть ограничена инфицированной раковой клеткой, создавая возможность избирательно устраняя только инфицированную вирусом клетку, а не окружающие неинфицированные клетки. Эти характеристики делают комбинацию HSV-TK/GCV особенно подходящей для эрадикации быстро делящихся опухолевых клеток, внедряющихся в непролиферирующие ткани. Важно отметить, что существует обширное клиническое подтверждение концепции этого подхода, поскольку введение GCV в безопасных, хорошо переносимых дозах для лечения вируса, содержащего ген HSV-TK , остается основным методом лечения, используемым для остановки распространения инфекции HSV. Чтобы подтвердить этот принцип в качестве предохранительного клапана для ColoAd1, ген HSV-TK был генетически сконструирован в ColoAd1, как описано в разделе «Материалы и методы», без потери литического потенциала по сравнению с исходным вирусом ColoAd1 (рис. 3) и протестирован. на чувствительность к GCV.Как показано на рисунках 4a и b, GCV очень эффективен в остановке ColoAd1-опосредованного клеточного лизиса, особенно в первичных нормальных эндотелиальных клетках. Следовательно, это говорит о том, что генно-инженерная чувствительность к GCV в ColoAd1 является жизнеспособным подходом к остановке вирусной инфекции.

    Рисунок 3

    Сравнение активности ColoAd1 и ColoAd1/sv40/GFP/PL30 (исходный вирус ColoAd1/PL30/TK/TK). Клетки HT-29 инфицировали различными уровнями вируса и жизнеспособность клеток измеряли через 7 дней с использованием анализа MTS в соответствии с инструкциями производителя (CellTiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega, Мэдисон, Висконсин, США).Эффективность ColoAd1 и ColoAd1/sv40/GFP/PL30 оказалась статистически одинаковой.

    Рисунок 4

    Эффект лечения ганцикловиром (GCV) на ColoAd1, экспрессирующем ген тимидинкиназы вируса простого герпеса ( HSV-TK ). Используя ранее описанную систему на основе транспозонов, 28 , новый сайт вставки был идентифицирован в области ORF3 ColoAd1 E4 между G (30929 п.н.) С (30930 п.н.). Это не изменило активность вируса ColoAd1. Кассету экспрессии TK/TK (ген тимидинкиназы, управляемый промотором тимидинкиназы) вставляли в идентифицированный сайт, и полученный вирус был назван «ColoAd1/PL30/TK/TK». Цитотоксичность вируса in vitro анализировали с добавлением GCV и без него на двух разных клетках, эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC) (первичные нормальные клетки) и клетках A549 (клеточная линия рака легкого — ATCC). Клетки инфицировали различными уровнями вируса в течение 24 часов перед добавлением 20 мкМ GCV, а жизнеспособность клеток измеряли через 7 дней с использованием анализа MTS в соответствии с инструкциями производителя (CellTiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, Висконсин, США).Вооружение ColoAd1 TK повышает чувствительность вируса к обработке GCV как на клетках ( a ) A549, так и ( b ) HUVEC.

    Важно отметить, что экспрессию белка ТК также можно использовать для визуализации и отслеживания активности виротерапии в ходе виротерапевтического лечения. Позитронно-эмиссионная томография и однофотонная эмиссионная компьютерная томография являются методами, которые обычно используются для обнаружения и мониторинга рака и методов лечения рака, и оба являются жизнеспособными средствами для обнаружения экспрессии белка ТК при введении соответствующего субстрата ТК. 21, 22 Важно отметить, что эти субстраты избирательно фосфорилируются вирусным ферментом ТК, и, как указывалось ранее, фосфорилированная форма остается изолированной в клетке. Возможность контролировать активность биологического агента в режиме реального времени во время лечения может иметь решающее значение для перевода этой терапии в клинику. Возможность количественного и неинвазивного определения местоположения, величины и продолжительности экспрессии гена дает возможность отслеживать виротерапию и ее жизнеспособность у пролеченного пациента, что позволяет использовать более персонализированные схемы лечения, основанные на необходимости, а не на заранее согласованном -при режиме дозирования Возможность контролировать активность и интенсивность суррогатного сигнала также дает клиницистам возможность оптимизировать комбинированную терапию, которая часто используется при лечении рака.Это важно, поскольку вирусная терапия продемонстрировала синергизм со стандартной химиотерапией в клинических условиях 23 и в сочетании с химиотерапией представляет собой первую одобренную виротерапию для лечения рака. 2

    Способность разрабатывать эффективные методы лечения рака остается серьезной проблемой. Виротерапия представляет собой новый рубеж в лечении рака, и, поскольку вирусы первого поколения доказали свою безопасность в клинике, в настоящее время разрабатываются более сильнодействующие агенты.В этой рукописи мы изложили различные подходы, чтобы обеспечить безопасное управление этими агентами во время лечения пациента. В частности, мы показываем, что новый, сильнодействующий онколитический вирус, названный ColoAd1, можно контролировать с помощью внешнего вмешательства, либо непосредственно с помощью клинически одобренного противовирусного препарата, либо путем генной инженерии чувствительности вируса к лекарственным средствам, продолжая развивать этот агент как жизнеспособный следующий вирус. Вирус поколения для лечения рака человека.

    Витилиго: обзор — Полный текст — Дерматология 2020, Том. 236, No. 6

    Витилиго, распространенное депигментирующее кожное заболевание, по оценкам, встречается у 0,5–2% населения во всем мире. Заболевание характеризуется избирательной потерей меланоцитов, что приводит к появлению типичных меловидно-белых пятен без чешуек. В последние годы был достигнут значительный прогресс в понимании патогенеза витилиго, которое в настоящее время однозначно классифицируется как аутоиммунное заболевание. Витилиго часто сбрасывают со счетов как косметическую проблему, хотя его последствия могут быть психологически разрушительными, часто со значительным бременем в повседневной жизни.В 2011 году международный консенсус классифицировал сегментарное витилиго отдельно от всех других форм витилиго, и термин витилиго был определен для обозначения всех форм несегментарного витилиго. В этом обзоре обобщаются современные знания о витилиго и делается попытка дать обзор будущего лечения витилиго.

    © 2020 S. Karger AG, Базель

    Введение

    Витилиго, депигментирующее заболевание кожи, характеризуется избирательной потерей меланоцитов, что, в свою очередь, приводит к разбавлению пигмента в пораженных участках кожи. Характерным поражением является полностью бесцветное, нешелушащееся, меловидно-белое пятно с четкими краями. В последнее время был достигнут значительный прогресс в нашем понимании патогенеза витилиго, и теперь оно четко классифицируется как аутоиммунное заболевание, связанное с генетическими факторами и факторами окружающей среды, а также с метаболическими, окислительными стрессами и аномалиями отслоения клеток [1, 2]. Витилиго не следует сбрасывать со счетов как косметическое или незначительное заболевание, поскольку его последствия могут быть психологически разрушительными, часто со значительным бременем в повседневной жизни [3].

    В 2011 году международный консенсус разделил витилиго на две основные формы: несегментарное витилиго (NSV) и сегментарное витилиго (SV) [2]. Термин витилиго был определен для обозначения всех форм NSV (включая акрофациальный, слизистый, генерализованный, универсальный, смешанный и редкий варианты). Отличие СВ от других типов витилиго было одним из наиболее важных решений консенсуса, прежде всего из-за его прогностических последствий.

    Эпидемиология

    Витилиго является наиболее распространенным депигментирующим кожным заболеванием с предполагаемой распространенностью 0.5-2% населения как у взрослых, так и у детей во всем мире [4-7]. Одно из самых ранних и крупных эпидемиологических исследований, о которых сообщалось, было проведено на острове Борнхольм, Дания, в 1977 г., где сообщалось, что витилиго поражает 0,38% населения [4]. Витилиго поражает этнические группы и людей всех типов кожи без предрасположенности [1, 8, 9]. Однако, похоже, существуют большие географические различия. Например, исследование, проведенное в провинции Шэньси в Китае, показало, что распространенность составляет всего 0.093% [10], тогда как в регионах Индии этот показатель достигает 8,8% [11, 12]. Это высокое значение может быть связано с включением случаев с химической и токсической депигментацией [12] или с тем, что эти данные могут отражать распространенность одного института кожи в Дели [11]. Кроме того, несоответствие данных о распространенности может быть связано с тем, что данные чаще сообщаются в местах, где распространена социальная и культурная стигма, или где поражения более очевидны у темнокожих людей [12]. Обширный подробный обзор данных о распространенности из более чем 50 исследований по всему миру продемонстрировал, что распространенность витилиго колеблется от нуля.06% до максимума 2,28% [7]. Метаанализ, оценивающий распространенность витилиго, который включал в общей сложности 103 исследования, показал, что совокупная распространенность витилиго из 82 популяционных или внебольничных исследований составила 0,2%, а из 22 госпитальных исследований — 1,8% [13]. На СВ приходится 5–16% всех случаев витилиго [14, 15]; однако его заболеваемость и распространенность точно не установлены. Распространенность СВ в опубликованных отчетах колеблется от 5 до 30% [14, 16-18]. Эта изменчивость эпидемиологических данных может быть объяснена различиями в классификации заболеваний из-за отсутствия консенсуса в предыдущие годы, непоследовательных отчетов пациентов и различных групп населения.

    Мужчины и женщины страдают в равной степени, хотя женщины и девочки чаще обращаются за консультацией, возможно, из-за большего негативного социального воздействия, чем мужчины и мальчики [6, 19]. НСВ развивается в любом возрасте, но обычно встречается у молодых людей в возрасте от 10 до 30 лет [12, 20, 21]. У 25% больных витилиго заболевание развивается в возрасте до 10 лет, почти у половины больных витилиго заболевание развивается в возрасте до 20 лет и почти у 70–80% — до 30 лет [12, 22].Большинство популяций имеют смешанные возрастные группы и двойные пики, как было отмечено [23]. СВ имеет тенденцию возникать в более молодом возрасте, чем НСВ [21]: до 30 лет в 87% случаев и до 10 лет в 41,3% [14]. В отчете Hann и Lee [14] средний возраст начала заболевания составил 15,6 года. Самое раннее зарегистрированное начало было сразу после рождения, тогда как самое позднее — в 54 года. В большинстве случаев продолжительность лечения на момент направления была менее 3 лет, от 2 месяцев до 15 лет [14].

    Патогенез

    Витилиго — многофакторное заболевание, характеризующееся потерей функциональных меланоцитов [2, 24–27].Было предложено несколько механизмов разрушения меланоцитов при витилиго. К ним относятся генетические, аутоиммунные реакции, окислительный стресс, образование медиаторов воспаления и механизмы отслоения меланоцитов. По-видимому, задействованы как врожденные, так и адаптивные ветви иммунной системы. Ни одна из этих предложенных теорий сама по себе не достаточна для объяснения различных фенотипов витилиго, и общий вклад каждого из этих процессов все еще обсуждается, хотя в настоящее время существует консенсус относительно аутоиммунной природы витилиго.Несколько механизмов могут быть вовлечены в прогрессирующую потерю меланоцитов, и они включают либо иммунную атаку, либо дегенерацию и отслоение клеток. «Теория конвергенции» или «интегрированная теория» предполагает, что при витилиго несколько механизмов могут работать совместно, способствуя разрушению меланоцитов, что в конечном итоге приводит к одному и тому же клиническому результату [1, 8, 24, 28, 29].

    Считалось, что NSV и SV имеют различные лежащие в основе патогенетические механизмы из-за их различных клинических проявлений, с нейронной гипотезой или соматическим мозаицизмом, предпочтительным для сегментарной формы [30]. Однако более свежие данные указывают на перекрытие воспалительного патогенеза как для SV, так и для NSV. Оба, по-видимому, включают многоэтапный процесс, который включает начальное высвобождение провоспалительных цитокинов и нейропептидов, вызванное внешним или внутренним повреждением, с последующим расширением сосудов и иммунным ответом [1, 31, 32].

    Некоторые авторы предполагают, что нервная система способствует патогенезу витилиго, что называется «нейронной гипотезой». Эта гипотеза основывалась на одностороннем характере распространения СВ [27].Однако картина распространения СВ не совсем похожа на любое другое кожное заболевание, и она редко, если вообще когда-либо, бывает дерматомной [31, 33]. Кроме того, нет достаточных доказательств, подтверждающих такую ​​гипотезу. Более того, меланоцит-специфические Т-клеточные инфильтраты, идентичные NSV, были обнаружены при SV, что также позволяет предположить, что он также опосредуется аутоиммунитетом [34].

    Генетика витилиго

    Многочисленные исследования убедительно свидетельствуют о важности генетических факторов в развитии витилиго, хотя ясно, что эти влияния сложны. Эпидемиологические исследования показали, что витилиго имеет тенденцию накапливаться в семьях [9, 35-37]; однако генетический риск не является абсолютным. Около 20% пациентов с витилиго имеют по крайней мере 1 родственника первой степени родства с витилиго, а относительный риск витилиго у родственников первой степени родства увеличивается в 7-10 раз [37]. У монозиготных близнецов коэффициент конкордантности составляет 23%, что подчеркивает важность дополнительных стохастических факторов или факторов окружающей среды в развитии витилиго [37]. Крупномасштабные полногеномные ассоциативные исследования, проведенные у белых европейцев и китайцев, выявили почти 50 различных генетических локусов, которые вызывают риск витилиго [38-46].

    В настоящее время идентифицировано несколько соответствующих релевантных генов. Они участвуют в иммунной регуляции, меланогенезе и апоптозе; они связаны с другими пигментными, аутоиммунными и аутовоспалительными заболеваниями [38-48]. Несколько локусов являются компонентами врожденной и адаптивной иммунной системы и являются общими с другими аутоиммунными заболеваниями, такими как заболевания щитовидной железы, диабет 1 типа и ревматоидный артрит [42, 47, 49, 50].

    Тирозиназа, кодируемая геном TYR , представляет собой фермент, который катализирует лимитирующие этапы биосинтеза меланина [51].Тирозиназа является основным аутоантигеном при генерализованном витилиго [52-54]. Полногеномное ассоциативное исследование обнаружило вариант восприимчивости к NSV в TYR у европейских белых людей, который редко наблюдается у пациентов с меланомой [43]. По-видимому, существует взаимоисключающая связь между восприимчивостью к витилиго и восприимчивостью к меланоме, что предполагает генетическую дисрегуляцию иммунного надзора за меланоцитарной системой [38, 43, 47]. Ген NALP1 на хромосоме 17p13, кодирующий белок 1 повтора NACHT, богатый лейцином, является регулятором врожденной иммунной системы.Это было связано с витилиго-ассоциированным множественным аутоиммунным заболеванием, группой заболеваний, включающей различные комбинации витилиго, аутоиммунного заболевания щитовидной железы и других аутоиммунных и аутовоспалительных синдромов [42]. С другой стороны, производство большого количества белка во время синтеза меланина увеличивает риск неправильной укладки этих белков, что активирует путь стресса внутри клетки, называемый реакцией развернутого белка. XBP1P1 (ген, кодирующий X-box-связывающий белок 1) ассоциирован с витилиго [49, 55].Он играет ключевую роль в смягчении реакции развернутого белка, а также в управлении вызванным стрессом воспалением in vivo [39]. Хотя многие специфические механизмы, возникающие из-за этих генетических факторов, все еще изучаются, в настоящее время очевидно, что витилиго является аутоиммунным заболеванием, включающим сложную взаимосвязь между программированием и функцией иммунной системы, аспектами аутоиммунной мишени меланоцитов и нарушением регуляции иммунной системы. ответ [38].

    Оксидативный стресс

    Исследования патогенеза витилиго показывают, что оксидативный стресс может быть начальным событием разрушения меланоцитов [56-59].Действительно, было обнаружено, что меланоциты пациентов с витилиго более восприимчивы к окислительному стрессу, чем у здоровых людей, и их труднее культивировать ex vivo, чем у здоровых людей [60].

    Активные формы кислорода (АФК) высвобождаются из меланоцитов в ответ на стресс. В свою очередь, это вызывает масштабное изменение антиоксидантной системы: дисбаланс повышенных маркеров окислительного стресса (супероксиддисмутаза, малоновый диальдегид, АФК) и значительное истощение антиоксидантных механизмов (каталаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, тиоредоксинредуктаза и тиоредоксин, супероксиддисмутазы). и ферменты репарации метионинсульфоксидредуктазы А и В) в коже и в крови [26, 57, 61-67].Было высказано предположение, что этот дисбаланс между прооксидантами и антиоксидантами при витилиго отвечает за повышенную чувствительность меланоцитов к внешним прооксидантным стимулам [57, 58, 68] и со временем вызывает предстарение. Генерация и накопление АФК может, в свою очередь, вызывать повреждение ДНК, окисление и фрагментацию белков, а также перекисное окисление липидов, нарушая тем самым их клеточную функцию [68, 69].

    Как эндогенные, так и экзогенные стимулы потенциально могут генерировать АФК при витилиго [29]. Производство меланина само по себе токсично для меланоцитов. Меланогенез — это энергозатратный процесс, осуществляемый меланоцитами, который создает прооксидантное состояние в коже [70]. Родственный тирозину белок 1 является важным белком для синтеза меланина. Окислительный стресс заставляет родственный тирозину белок 1 взаимодействовать с комплексом калнексина, что, в свою очередь, приводит к снижению стабильности родственного тирозину белка 1 с последующим образованием токсичных промежуточных продуктов меланина [58]. Дигидроптеридинредуктаза является последним ферментом в процессе переработки незаменимого кофактора 6-тетрагидробиоптерина [71].Окислительный стресс приводит к модификации активного центра дигидроптеридинредуктазы, что, в свою очередь, приводит к изменению синтеза и рециркуляции биоптерина [71]. Дефектная рециркуляция 6-тетрагидробиоптерина увеличивает выработку перекиси водорода и снижает уровень каталазы, что еще больше способствует гибели клеток.

    Митохондрии, по-видимому, являются ключевым индуктором АФК, и у пациентов с витилиго функциональность митохондрий изменена [72]. Изменение митохондриального трансмембранного потенциала и комплекса электрон-транспортной цепи вызывает заметное увеличение активности митохондриальной малатдегидрогеназы и модификацию липидных компонентов мембраны.Окислительный стресс нарушает функцию мембранных липидов и клеточных белков [58, 68]. Редокс-вариации мембранных липидов нарушают липидные рафты, что нарушает функцию мембранных рецепторов, перенос электронов и продукцию АТФ в митохондриях [26, 56, 68, 73]. Кроме того, окислительный стресс способствует экспрессии временного рецепторного потенциала катионного канала подсемейства М члена 2 и, таким образом, способствует митохондриально-зависимому апоптозу меланоцитов за счет увеличения притока кальция [74].

    Экзогенные стимулы также могут генерировать побочные продукты окисления [29]. Монобензон является наиболее широко используемым депигментирующим агентом [75]; было показано, что он индуцирует высвобождение экзосом, содержащих антиген, связанный с меланосомой, после перепроизводства АФК меланоцитами [76].

    Снижение адгезивности меланоцитов из-за окислительного стресса было обнаружено на границах поражений витилиго, что, возможно, объясняет феномен Кебнера [77-79]. Взаимодействие меланоцитов и кератиноцитов требует не специфических адгезивных структур, таких как десмосомы, а простых молекул адгезии, таких как интегрины и кадгерины.В здоровой коже пациентов с витилиго экспрессия е-кадгеринов снижена, а экспрессия тенасцина, антиадгезивной молекулы, повышена [77, 78]. В коже с витилиго хроническое трение может активировать эпителиальные клетки, которые, в свою очередь, преобразуют механические силы в биохимические сигналы [78], вызывая внутриклеточный стресс и последующее изменение экспрессии кадгерина [79].

    Врожденный иммунитет

    Врожденный иммунитет при витилиго заполняет пробел между окислительным стрессом и адаптивным иммунитетом при витилиго.Вполне вероятно, что активация врожденных иммунных клеток происходит на ранних стадиях витилиго путем восприятия экзогенно или эндогенно индуцированных сигналов стресса, высвобождаемых меланоцитами и, возможно, кератиноцитами [25, 76, 80]. Как упоминалось выше, существует связь между предрасположенностью к витилиго и генетическими изменениями в NALP1, регуляторе врожденной иммунной системы [42, 81]. Анализ геномной экспрессии на коже пациентов с витилиго выявил аномально повышенный врожденный иммунитет в локальном микроокружении меланоцитов в коже с витилиго, особенно естественных клеток-киллеров [80].Действительно, было обнаружено, что естественные клетки-киллеры инфильтрируют клинически нормальную кожу пациентов с витилиго, что позволяет предположить, что естественные клетки-киллеры являются ранними ответами на стресс меланоцитов [80].

    Меланоциты, по-видимому, передают стресс системе врожденного иммунитета посредством выделения экзосом. Было обнаружено, что меланоциты человека секретируют экзосомы в ответ на химически индуцированный стресс [76]. Эти экзосомы содержат специфичные для меланоцитов антигены, микроРНК, белки теплового шока и другие белки, которые действуют как молекулярные паттерны, связанные с повреждением [82]. Эти экзосомы доставляют антигены-мишени витилиго к близлежащим дендритным клеткам и индуцируют их созревание в эффективные антигенпрезентирующие клетки [76, 83-85]. Среди этих молекулярных паттернов, связанных с повреждением, индуцируемый белок теплового шока 70 уникален, поскольку он действует как шаперон для пептидов, специфичных для исходных клеток-хозяев, которые защищают клетки от апоптоза [86]. Было показано, что индуцируемый белок теплового шока 70 играет центральную роль в патогенезе витилиго на мышиной модели, индуцируя дендритные клетки для представления меланоцит-специфических антигенов Т-клеткам в лимфоидных тканях [83, 87].Было высказано предположение, что это ключевое звено между врожденным и адаптивным иммунитетом, ведущее к опосредованному Т-клетками аутоиммунному разрушению меланоцитов [88, 89]. Недавно было обнаружено, что модифицированная версия индуцируемого белка теплового шока 70, Hsp70iQ435A, репигментирует поражения витилиго у свиней Sinclair, открывая дверь для потенциального нового лечения пациентов с витилиго [90, 91].

    Адаптивный иммунитет

    В патогенез витилиго вовлечены как гуморальные, так и клеточно-опосредованные иммунные нарушения.

    Антитела к поверхностным и цитоплазматическим антигенам меланоцитов были идентифицированы в прошлом в сыворотке больных витилиго [92-94]. Эти антитела могут индуцировать разрушение меланоцитов, выращенных в культуре, за счет комплемент-опосредованного лизиса и антителозависимой клеточной цитотоксичности [92, 93].

    Цитотоксические CD8+ Т-клетки, нацеленные конкретно на меланоциты, ответственны за разрушение меланоцитов. Инфильтрация CD8+ T-клетками эпидермиса и дермы была продемонстрирована гистологически [95, 96].В крови пациентов с витилиго обнаруживают более высокое количество цитотоксических CD8+ Т-клеток по сравнению со здоровым контролем, и это количество коррелирует с активностью витилиго [1, 88, 95-97]. Большое количество CD8+ Т-клеток обнаруживается в коже вокруг поражений, и эти клетки проявляют антимеланоцитарную цитотоксическую реактивность [96]. Инфильтрирующие Т-клетки, выделенные из биоптатов перилезиональных краев, демонстрируют обогащение клетками, распознающими антигены меланоцитов. Когда эти клетки были выделены и повторно введены в нормально пигментированную аутологичную кожу, они индуцировали апоптоз меланоцитов [98].Напротив, Т-лимфоциты перилезиона с обедненными CD8+ Т-клетками были неспособны индуцировать цитотоксичность и апоптоз меланоцитов, тогда как популяции, очищенные от CD8, были даже более эффективны [98]. CD8+ Т-клетки также экспрессируют кожный лимфоцитарный маркер кожного антигена [99, 100]. Было обнаружено, что разрушение меланоцитов связано с заметным присутствием антиген-позитивных Т-клеток кожных лимфоцитов в перилезионном участке, большинство из которых экспрессирует перфорин и гранзим-В. К настоящему времени некоторые антигенные белки, полученные из нормальных или подвергнутых стрессу меланоцитов, участвующих в синтезе меланина, были идентифицированы при витилиго и включают gp100, Melan-A/MART-1, тирозиназу и родственные тирозиназе белки 1 и 2 [101].

    CD8+ Т-клетки из поражений витилиго продуцируют несколько цитокинов, таких как интерферон-γ (IFN-γ) и фактор некроза опухоли, среди других цитокинов [98, 102-104]. IFN-γ играет центральную роль в патогенезе заболевания и способствует рекрутированию аутореактивных CD8+ T-клеток в кожу [102]. IFN-γ-индуцированный хемокиновый лиганд CXC 9 ( CXCL9 ), CXCL10 и CXCL11 были наиболее экспрессированными генами в профиле транскрипции пораженной кожи пациентов с витилиго, тогда как другие пути хемокинов не были [103].Также сообщалось, что эти IFN-γ-индуцированные хемокины CXC повышены в сыворотке пациентов [103]. Анализ экспрессии хемокинов в коже мышей показал, что экспрессия CXCL9 и CXCL10 сильно коррелирует с активностью заболевания, тогда как только CXCL10 коррелирует с тяжестью, что подтверждает их роль в качестве потенциальных биомаркеров последующего прогрессирования заболевания. Точно так же сывороточный CXCL10 у пациентов с витилиго также коррелирует с активностью и тяжестью заболевания и может быть новым биомаркером в мониторинге активности заболевания [105, 106]. Нейтрализация CXCL10 у мышей с установившейся широко распространенной депигментацией приводит к репигментации, что указывает на критическую роль CXCL10 как в прогрессировании, так и в поддержании витилиго [103]. Действительно, CXCL9 способствует массовому привлечению меланоцит-специфических CD8+ T-клеток в кожу, тогда как CXCL10 необходим для локализации в эпидермисе, где меланоциты находятся и выполняют эффекторные функции [103, 107]. Интересно, что и CXCL9, и CXCL10 имеют общий рецептор CXCR3. Меланоцит-специфические аутореактивные Т-клетки у пациентов с витилиго экспрессируют CXCR3 как в крови, так и в пораженной коже [107].Нацеливание на CXCR3 в мышиной модели с использованием истощающих антител снижает количество аутореактивных Т-клеток и обращает болезнь вспять [108]. Кроме того, было показано, что кератиноциты являются основными продуцентами хемокинов на протяжении всего течения заболевания как у мышиной модели, так и у пациентов [109]. Функциональные исследования с использованием мыши с нокаутом условного преобразователя сигнала и активатора транскрипции (STAT) 1 показали, что хемокины, происходящие из кератиноцитов, и передача сигналов IFN-γ вызывают витилиго и правильное аутореактивное возвращение Т-клеток к эпидермису. Напротив, эпидермальные иммунные клетки, такие как эндогенные Т-клетки, клетки Лангерганса и γδ-Т-клетки, не требуются [109]. IFN-γ, в свою очередь, ингибирует меланогенез и непосредственно индуцирует апоптоз меланоцитов [110]. Дальнейшие функциональные исследования на мышиной модели показали, что IFN-γ, рецептор IFN-γ, STAT1, CXCL10 и CXCR3 имеют решающее значение для развития гипопигментации при витилиго [102, 103, 107, 111].

    Многие цитокины, которые связываются с цитокиновыми рецепторами типа I и типа II, используют киназу Януса (JAK) и путь STAT для достижения своего эффекта [112].Внеклеточное связывание цитокинов активирует их рецепторы, индуцируя присоединение JAK и самоактивацию путем аутофосфорилирования. Активированные JAK связывают STAT, которые подвергаются JAK-опосредованному фосфорилированию, что приводит к димеризации STAT, транслокации в ядро, связыванию ДНК и регуляции экспрессии генов. При витилиго рецепторный комплекс, связанный с IFN-γ, рекрутирует киназы JAK1 и JAK2, что приводит к фосфорилированию и ядерной транслокации STAT, что, в свою очередь, транскрипционно активирует нижележащие гены, индуцируемые IFN-γ. Пораженная кожа пациентов с витилиго показала гораздо более интенсивную и диффузную экспрессию JAK1 по сравнению со здоровой тканью. Кроме того, высокая экспрессия JAK1 была связана с короткой продолжительностью заболевания и более низким процентом выживших меланоцитов [113, 114]. Таким образом, эти результаты подтверждают исследование методов лечения, которые нарушают путь, нацеленный на IFN-γ, рецептор IFN-γ, нижестоящие сигнальные белки JAK1, JAK2 и STAT1, а также хемокин CXCL10 и его рецептор CXCR3 [115-117].

    Регуляторные Т-клетки (Treg) имеют решающее значение для развития толерантности к себе.Было обнаружено, что Tregs менее распространены в коже с витилиго, а их функциональная активность снижена [118-120]. Недостаток Tregs в коже при витилиго, вероятно, имеет решающее значение для постоянной антимеланоцитарной реактивности при этом прогрессирующем и хроническом заболевании. Действительно, Treg демонстрируют более низкую экспрессию трансформирующего фактора роста β 1 у пациентов с активным витилиго [119]. Количество Treg, экспрессирующих FoxP3, фактор транскрипции, подавляющий активацию Т-клеток, значительно снижается в поврежденной коже [120].Кроме того, было обнаружено, что экспрессия хоуминг-рецептора CCL22 заметно снижена в коже с витилиго [121], и, наоборот, экспрессия CCL22 может способствовать хоумингу кожи Treg для подавления депигментации [122]. [123]

    На рис. 1 представлены основные механизмы патогенеза витилиго.

    Рис.1.

    Патогенез витилиго. При витилиго меланоциты пациентов с витилиго имеют пониженную адгезивность и более восприимчивы к окислительному стрессу. Дополнительный стресс окружающей среды при наличии восприимчивого генетического фона вызывает широко распространенные изменения антиоксидантной системы. Митохондрии, по-видимому, являются ключевыми индукторами АФК, и у пациентов с витилиго функциональность митохондрий изменена. Окислительный стресс нарушает функцию мембранных липидов и клеточных белков.Синтез и рециркуляция биоптерина также изменяются, что приводит к дальнейшему окислительному стрессу и повреждению клеток. Перепроизводство АФК активирует реакцию развернутых белков и заставляет меланоциты секретировать экзосомы, которые содержат специфичные для меланоцитов антигены, микроРНК, белки теплового шока и молекулярные паттерны, связанные с повреждением. Эти экзосомы доставляют антигены-мишени витилиго к близлежащим дендритным клеткам и индуцируют их созревание в эффективные антигенпрезентирующие клетки. За этим следует управляемая цитокинами и хемокинами активация Т-хелперов 17 и дисфункция Т-регуляторных клеток.CD8+ Т-клетки из поражений витилиго продуцируют несколько цитокинов, таких как IFN-γ. Связывание IFN-γ с его рецептором активирует путь JAK-STAT и приводит к секреции CXCL9 и CXCL10 в коже. Через родственный рецептор CXCR3 CXCL9 способствует массовому привлечению меланоцит-специфических CD8+ T-клеток в кожу, тогда как CXCL10 способствует их локализации в эпидермисе и их эффекторной функции, что усиливает воспаление посредством петли положительной обратной связи. 6Bh5, 6-тетрагидробиоптерин; 7Bh5, 7-тетрагидробиоптерин; CXCL9, хемокиновый лиганд CXC 9; CXCL10, хемокиновый лиганд CXC 10; CXCR3, хемокиновый рецептор типа 3; DAMP, молекулярный паттерн, связанный с повреждением; DC, дендритная клетка; ИФН-γ, интерферон-γ; JAK, янус-киназа; АФК, активные формы кислорода; STAT1, преобразователь сигнала и активатор транскрипции 1.

    Классификация

    В 2011 г. международный консенсус классифицировал СВ отдельно от всех других форм витилиго, а термин витилиго был определен для обозначения всех форм НСВ [2]. «Смешанное витилиго», при котором у одного пациента сосуществуют СВ и НСВ, классифицируется как подгруппа НСВ (табл. 1). Отличие СВ от других типов витилиго было одним из наиболее важных решений консенсуса, прежде всего из-за его прогностических последствий.

    Таблица 1.

    Классификация витилиго (адаптировано из Ezzedine et al.[2])

    НСВ включает акрофациальный, слизистый, генерализованный, универсальный, смешанный и редкий варианты. Генерализованное и акрофациальное витилиго являются наиболее распространенными подтипами.

    • Генерализованное витилиго характеризуется двусторонними, часто симметричными, депигментированными пятнами или пятнами, расположенными случайным образом по всей поверхности тела. Это часто затрагивает области, которые склонны испытывать давление, трение и/или травму. Это может начаться в детстве или в раннем взрослом возрасте (рис. 2).

      Рис. 2.

      Генерализованное витилиго, двусторонние, часто симметричные, депигментированные пятна или пятна.

    • Акрофациальное витилиго характеризуется депигментированными пятнами, ограниченными дистальными отделами конечностей и/или лицом. Отличительной особенностью является депигментация дистальных отделов пальцев и лицевых отверстий. Позже он может прогрессировать, чтобы включать другие участки тела, и его лучше классифицировать как генерализованный или универсальный [2]. Разновидность кончика губы является подкатегорией акрофациального типа, при котором поражения ограничены кожными губами и дистальными кончиками пальцев (рис.3).

      Рис. 3.

      Акрофациальное витилиго, депигментированные пятна, ограниченные периорификальными областями, дистальными отделами конечностей и/или лицом.

    • Витилиго слизистых обычно поражает слизистые оболочки полости рта и/или половых органов. Это может произойти в контексте генерализованного витилиго или как изолированное состояние. Изолированное витилиго слизистых оболочек, которое сохраняется как минимум через 2 года наблюдения, определяется как неклассифицированное [2].

    • Универсальное витилиго (рис. 4) относится к полной или почти полной депигментации кожи (80–90% поверхности тела).Обычно ему предшествует генерализованное витилиго, которое постепенно прогрессирует до полной или почти полной депигментации кожи и волос.

      Рис. 4.

      Универсальное витилиго, полная или почти полная депигментация кожи.

    • Очаговое витилиго представляет собой небольшое, изолированное, депигментированное поражение без четкой картины распределения, которое не эволюционировало в течение 1–2 лет. Он может развиться в SV или NSV [2].

    • Смешанное витилиго относится к сочетанному возникновению СВ и НСВ [124].Его клинические признаки включают: (1) отсутствие участков депигментации в сегментарном распределении при рождении и на первом году жизни и при обследовании с помощью лампы Вуда, за исключением депигментного невуса; (2) SV с последующим NSV с задержкой не менее 6 месяцев; (3) СВ, поражающий не менее 20% дерматомного сегмента или имеющий определенное линейное распределение по Блашко; (4) разница в реакции на обычную обработку узкополосным ультрафиолетом B (NB-UVB) между SV (плохой ответ) и NSV (хороший ответ). Лейкотрихии и галоневусы в дебюте заболевания могут быть факторами риска развития МВ у пациентов с СВ [125]. Одновременное возникновение СВ и НСВ у одного и того же пациента рассматривалось как наложенное сегментарное проявление генерализованного полигенного расстройства, при котором сегментарное поражение предшествует генерализации заболевания и более резистентно к терапии [126, 127].

    В ходе анализа латентного класса были выделены два фенотипа НСВ: первый состоит из раннего начала заболевания (до 12 лет) и часто связан с галоневусами и семейным фоном преждевременного поседения волос. ; второй имеет позднее начало и чаще всего характеризуется акрофациальным распространением [23, 128].

    Несколько состояний трудно разделить на две классические формы NSV и SV.

    • «Точечный витилиго» относится к четко очерченным депигментированным точечным пятнам размером от 1 до 1,5 мм, поражающим любую область тела [129]. Если эти поражения не сосуществуют с классическими пятнами витилиго, их следует называть «точечной лейкодермой».

    • Гипохромное витилиго или малое витилиго характеризуется наличием гипопигментированных пятен с себорейным распределением на лице и шее в сочетании с гипопигментированными пятнами на туловище и волосистой части головы.По-видимому, это относится только к людям с темным типом кожи (рис. 5) [130].

      Рис. 5.

      Гипохромное витилиго, гипопигментированные пятна туловища и волосистой части головы, распределенные по себорейному типу.

    • Фолликулярное витилиго проявляется лейкотрихиями при отсутствии депигментации окружающего эпидермиса [131].

    СВ относится к депигментированным пятнам, распределенным по сегментам, и обычно ассоциируется с лейкотрихией и быстрым началом.Характерное поражение клинически похоже на пятно, наблюдаемое при NSV: полностью бесцветное, нешелушащееся, меловидно-белое пятно с четкими краями.

    Депигментированные пятна обычно ограничены одним дерматомом с частичным или полным поражением. При моносегментарном витилиго одно или несколько белых депигментированных пятен располагаются на одной стороне тела. Это наиболее распространенная форма СВ [14, 132]; однако возможны другие варианты распределения, при которых депигментированное пятно перекрывает несколько ипси- или контралатеральных дерматомов или возникает на больших участках, очерченных линиями Блашко.

    Голова поражается более чем в 50% случаев [14, 133]. Наиболее часто поражается дерматом тройничного нерва [14, 134, 135]. Следующими распространенными локализациями в порядке убывания частоты являются туловище (рис. 6), конечности, конечности и шея [14, 17, 133, 134].

    Рис. 6.

    Моносегментарное витилиго левой половины живота, депигментированные пятна обычно ограничены одним дерматомом с частичным или полным поражением.

    При СВ депигментация распространяется в пределах сегмента в течение 6–24 месяцев.После первоначального быстрого распространения в пораженном дерматоме пятно СВ чаще всего остается стабильным [14]. Однако редко он может снова прогрессировать после нескольких лет покоя, и если это происходит, он обычно распространяется на тот же дерматом. Рецидив заболевания может произойти после нескольких лет стабильности [136]. Однако в очень редких случаях поражения могут стать генерализованными и стать частью смешанного витилиго [124, 136].

    Диагноз

    Диагноз витилиго, как правило, не вызывает затруднений и ставится клинически на основании обнаружения приобретенных, бесцветных, не шелушащихся, меловидно-белых пятен с четкими краями и типичным расположением: периорифициальные, губы и кончики дистальных отделов конечностей, половой член, сегментарные и зоны трения [6, 8, 137].

    Диагноз витилиго обычно не требует подтверждающих лабораторных исследований. Биопсия кожи или другие тесты не нужны, за исключением исключения других заболеваний [6, 138, 139]. Отсутствие меланоцитов в поражении можно оценить неинвазивно с помощью конфокальной микроскопии in vivo или с помощью биопсии кожи. Гистология очага поражения витилиго выявляет полную потерю пигмента меланина в эпидермисе и отсутствие меланоцитов. Отдельные лимфоциты могут быть отмечены на границе поражения [34, 140].

    Диагностике витилиго может способствовать использование лампы Вуда, ручного устройства для ультрафиолетового (УФ) облучения, излучающего УФА [141]. Он помогает выявить очаговую потерю меланоцитов и обнаружить области депигментации, которые могут быть невидимы невооруженным глазом, особенно на бледной коже [142]. В свете Вуда очаги витилиго излучают яркую бело-голубую флуоресценцию и выглядят четко очерченными.

    Дерматоскопия может использоваться для дифференциации витилиго от других нарушений пигментации.Витилиго обычно показывает остаточную перифолликулярную пигментацию и телеангиэктазию, которые отсутствуют при других заболеваниях с гипопигментацией [143]. Что еще более важно, это может быть полезно для оценки активности заболевания при витилиго и стадии эволюции: прогрессирующие поражения демонстрируют перифолликулярную пигментацию, тогда как стабильные или ремиттирующие поражения демонстрируют перифолликулярную депигментацию [144].

    Дифференциальный диагноз витилиго широк (табл. 2). Многие распространенные и необычные заболевания проявляются участками депигментации, которые могут имитировать витилиго.Важно дифференцировать витилиго от лейкодермы, связанной с меланомой, и предотвратить ошибочный диагноз витилиго, особенно потому, что он может предшествовать обнаружению меланомы. Несмотря на клиническое сходство, антитела против антигена меланомы, распознаваемые Т-клетками 1 (MART1) при депигментации, связанной с меланомой, могут помочь дифференцировать ее от витилиго [145]. Депигментный невус представляет собой сегментарную гипопигментацию, обычно присутствующую при рождении или обнаруживаемую на первом году жизни. Она стабильна, хотя может увеличиваться пропорционально росту ребенка.Это распространенный дифференциальный диагноз СВ, но невусы обычно содержат нормальное количество меланоцитов со сниженной выработкой меланина [146]. При осмотре с помощью лампы Вуда контраст между пораженной и нормальной кожей менее выражен, чем при витилиго [147].

    Таблица 2.

    Дифференциальный диагноз витилиго

    Оценка

    Ведение пациента с витилиго требует времени для тщательной первоначальной оценки. Оценка пациента с витилиго включает в себя подробный анамнез и полное обследование кожи для оценки тяжести заболевания и индивидуальных прогностических факторов.Форма оценки, созданная Европейской рабочей группой по витилиго, обобщает элементы личного и семейного анамнеза, а также элементы клинического обследования, которые могут быть полезны для оценки [141]. Пациентов следует регулярно спрашивать о семейном анамнезе витилиго и преждевременного поседения волос, а также о семейном или личном анамнезе заболеваний щитовидной железы или других аутоиммунных заболеваний [148]. Фототип кожи, продолжительность заболевания, степень, активность, скорость прогрессирования или распространения поражений, наличие феномена Кебнера, наличие галоневусов, предшествующее лечение, включая его тип, продолжительность и эффективность, предыдущие эпизоды репигментации, профессиональный анамнез/воздействие химических веществ и влияние болезни на качество жизни следует оценивать во всех случаях.

    Некоторые области тела более восприимчивы к феномену Кебнера и связаны с повседневной деятельностью, такой как гигиена или одежда и профессия [8]. Оценка наличия феномена Кебнера (витилиго после механической травмы) может оказаться полезной для профилактики витилиго [8, 149]. Шкала оценки вероятности феномена Кебнера, K-VSCOR, была разработана и утверждена [150]. Пациентам с высокими баллами следует рекомендовать избегать механического стресса.

    Многие исследования продемонстрировали связь витилиго с заболеваниями щитовидной железы и другими сопутствующими аутоиммунными заболеваниями, такими как очаговая алопеция, ревматоидный артрит, сахарный диабет взрослых, болезнь Аддисона, пернициозная анемия, системная красная волчанка, псориаз и атопический фон [9, 128, 151, 152].

    Из-за повышенного риска аутоиммунных заболеваний щитовидной железы при НСВ, особенно тиреоидита Хашимото [153], следует первоначально проводить скрининг на антитела к тиреопероксидазе и регулярно измерять уровень тиреотропина, особенно у пациентов с антителами к тиреопероксидазе на начальном этапе скрининг. Предрасположенность к аутоиммунным заболеваниям у пациентов с витилиго зависит от этнического происхождения и семейного анамнеза аутоиммунных заболеваний [9, 154]. Наличие признаков или симптомов органоспецифических аутоиммунных заболеваний должно стать поводом для проведения соответствующего обследования и направления к специалистам [155].

    Наиболее широко охарактеризованные клинические маркеры активного, прогрессирующего заболевания включают: феномен Кебнера, трихромные поражения, воспалительные поражения и депигментацию в виде конфетти [27, 156-159].

    Наконец, необходима общая оценка психологических особенностей и качества жизни, поскольку личность пациента и воспринимаемая тяжесть витилиго являются предикторами ухудшения качества жизни [160, 161]. Был разработан и валидирован специфический для витилиго инструмент оценки качества жизни [162]. Всем пациентам с витилиго следует предлагать психологическую поддержку и консультирование [142].

    Лечение

    Лечение витилиго до сих пор остается одной из самых сложных дерматологических проблем. Важным шагом в лечении витилиго является признание того, что это не просто косметическое заболевание, и что существуют безопасные и эффективные методы лечения [163]. Эти методы лечения включают фототерапию, местные и системные иммунодепрессанты и хирургические методы, которые в совокупности могут помочь остановить заболевание, стабилизировать депигментированные поражения и стимулировать репигментацию [164, 165].

    Выбор лечения зависит от нескольких факторов, включая: подтип заболевания, степень, распространение и активность заболевания, а также возраст пациента, фототип, влияние на качество жизни и мотивацию к лечению.Лучше всего на терапию реагируют лицо, шея, туловище и средние конечности, тогда как губы и дистальные отделы конечностей более устойчивы [166]. Репигментация первоначально проявляется перифолликулярно или по периферии очагов поражения. Для определения эффективности лечения необходимо лечение в течение не менее 2–3 месяцев. Терапия на основе УФ-излучения является наиболее распространенным методом лечения витилиго и в сочетании с дополнительной терапией связана с улучшением результатов [165].

    Ведение требует индивидуального терапевтического подхода, при котором пациенты всегда должны консультироваться, поскольку большинство терапевтических вариантов требуют много времени и длительного наблюдения.Консультация косметолога или специализированной медсестры по косметической маскировке может быть полезной для пациентов с витилиго, поражающим открытые участки. К ним относятся косметические средства на основе основы и продукты для автозагара, содержащие дигидроксиацетон, который обеспечивает стойкость цвета до нескольких дней.

    Было опубликовано несколько руководств по лечению витилиго [142, 167-169]. В 2008 году Британская ассоциация дерматологов опубликовала удобные для пользователя клинические рекомендации по диагностике и лечению витилиго [142], которые были созданы на основе первого Кокрановского обзора и консенсуса экспертов по витилиго, отражающих выбор пациента и клинический опыт [169, 170].Кокрановские обзоры 2010 и 2015 годов подчеркивают отсутствие излечения от витилиго и неспособность существующих вариантов лечения ограничить распространение болезни на длительный срок [170-172]. Однако в большинстве рандомизированных контролируемых испытаний (РКИ), включенных в обзор, участвовало менее 50 участников. Они пришли к выводу, что из-за неоднородности дизайна испытаний и небольшого числа участников невозможно дать твердые клинические рекомендации.

    Подкомитет по витилиго Европейского дерматологического форума опубликовал рекомендации по ведению и лечению витилиго, основанные на наилучших доступных доказательствах в сочетании с мнением экспертов [167].Лечение классифицировали от вариантов первой до четвертой линии. Лечение первой линии состоит из местного лечения (кортикостероиды и ингибиторы кальциневрина). Лечение второй линии состоит из фототерапии (NB-UVB и псоралена и UVA [PUVA]) и системного лечения стероидами. Лечение третьей линии состоит из хирургических методов трансплантации и четвертой линии лечения депигментации. Подробный алгоритм, обобщающий терапевтические методы и предлагающий поэтапный подход, показан на рисунке 7.

    Рис.7.

    Терапевтический алгоритм витилиго. TCS, актуальные кортикостероиды; TCI, местный ингибитор кальциневрина; UVB, ультрафиолет B.

    При NSV у пациентов может наблюдаться быстрое прогрессирование заболевания с депигментированными пятнами, распространяющимися в течение нескольких недель или месяцев. Это требует срочного вмешательства с помощью системных пероральных минипульс-стероидов, лечение, которое состоит из введения кортикостероидов только два раза в неделю [142, 173]. В одном исследовании пероральные мини-импульсы бетаметазона или дексаметазона (5 мг однократно) 2 дня подряд в неделю в течение нескольких месяцев привели к остановке прогрессирования витилиго у 32 из 36 пациентов с активным заболеванием через 1–3 месяца лечения [173]. ].

    Топические кортикостероиды (TCS) используются с 1950-х годов из-за их противовоспалительного и иммуномодулирующего действия. Нет исследований, оценивающих оптимальную продолжительность лечения ТКС. Одни авторы предлагают его ежедневное применение в течение 2–3 мес, другие предлагают прерывистую схему (применение один раз в сутки в течение 15 дней в месяц в течение 6 мес [167]). При ограниченных формах витилиго как ТКС, так и топические ингибиторы кальциневрина (TCI) в настоящее время широко используются в качестве препаратов первой линии [174].TCI обычно применяются два раза в день.

    Недавний систематический обзор и метаанализ оценили эффективность TCI по сравнению с TCS при лечении витилиго. 13 исследований были включены в качественный анализ, а данные 11 исследований с участием 509 пациентов с витилиго подходили для метаанализа. TCI не уступали TCS в достижении не менее 50% или не менее 75% репигментации, особенно у детей [175]. Другой недавний метаанализ 46 исследований, включающих 1499 пациентов, показал, что монотерапия ТХИ, по-видимому, оказывает значительное терапевтическое воздействие на витилиго и вызывала как минимум легкий ответ у 55 пациентов.0% пациентов, по крайней мере умеренный ответ у 38,5% и выраженный ответ у 18,1% после средней продолжительности лечения 3 месяца [176]. Ответы на лечение TCI в сочетании с фототерапией были выше, чем у монотерапии TCI и только фототерапии, что подтверждает синергетический эффект этой комбинированной терапии. Монотерапия TCI может быть полезна для лечения поражений лица и шеи, особенно у детей, когда фототерапия недоступна. Другой метаанализ 7 РКИ с участием 240 пациентов показал, что добавление TCI к NB-UVB не дает значительно лучших результатов по сравнению с монотерапией NB-UVB для лечения витилиго; за исключением лица и шеи, где добавление TCI к NB-UVB может улучшить результаты лечения [177].

    Рабочая группа по витилиго недавно опубликовала унифицированный набор рекомендаций по лечению витилиго фототерапией NB-UVB, основанный на практике назначений экспертов по фототерапии со всего мира [178]. К ним относятся протокол дозирования (начальная доза 200 мДж/см 2 независимо от конститутивного типа кожи, затем увеличение на 10–20% за курс лечения), частота введения (оптимально 3 раза в неделю), максимально допустимые дозы ( 1500 мДж/см 2 для лица, 3000 мДж/см 2 для тела), курс и последующее наблюдение.Они сообщили, что минимальное количество доз, необходимое для определения отсутствия ответа, составляло 48 облучений, и что из-за существования медленно реагирующих пациентов может потребоваться ≥72 облучений для определения отсутствия ответа на фототерапию [178].

    Благодаря хорошему профилю безопасности как для детей, так и для взрослых, а также отсутствию системной токсичности, NB-UVB стал препаратом выбора для начального лечения пациентов с витилиго, поражающим более 10% площади поверхности тела. Метаанализ 2017 года 35 рандомизированных и нерандомизированных исследований, включающих 1428 пациентов, сравнил частоту репигментации NB-UVB и PUVA в зависимости от продолжительности лечения.Для NB-UVB репигментация ≥75% была достигнута у 19 и 36% пациентов через 6 и 12 месяцев лечения соответственно, по сравнению с 9 и 14% при PUVA. Это подтвердило превосходство NB-UVB над PUVA и позволило предположить, что фототерапию следует продолжать не менее 12 месяцев для достижения максимального ответа [179].

    Целенаправленная фототерапия с использованием монохроматических эксимерных ламп или лазеров с длиной волны 308 нм полезна для лечения локализованного витилиго. Эти устройства доставляют свет высокой интенсивности только в пораженные участки, избегая воздействия на здоровую кожу и снижая кумулятивную дозу УФ-В.

    Систематический обзор 6 рандомизированных исследований (411 пациентов с 764 поражениями) показал, что эксимерные лампы и эксимерные лазеры столь же эффективны, как и NB-UVB, вызывая репигментацию на ≥50% и ≥75% [180]. Хотя более частые еженедельные процедуры приводят к большей репигментации, окончательная репигментация и окончательный результат, по-видимому, полностью зависят от общего количества сеансов лечения, а не от их частоты [181]. Как и в случае NB-UVB, TCI могут работать синергетически с таргетной фототерапией [182, 183].Мета-анализ, который включал 8 РКИ, включающих в общей сложности 425 пластырей/пациентов, показал, что TCI в сочетании с эксимерным светом/лазером более эффективны по сравнению с монотерапией эксимерным светом/лазером [184].

    Хирургические методы могут быть предложены в качестве терапевтического варианта для пациентов с СВ и пациентов с NSV со стабильным заболеванием после, по крайней мере, года задокументированного отсутствия ответа на медицинские вмешательства и отсутствия феномена Кебнера. Тест мини-трансплантата для оценки стабильности, распространения пигмента на реципиентном участке и отсутствия кебнеризации на донорском участке через 2–3 месяца также может помочь в отборе пациентов.Целью трансплантации является перенос на витилигинозную кожу резервуара здоровых меланоцитов для пролиферации и миграции в зоны депигментации [185]. Хирургические методы, упомянутые в европейских руководствах [167], включают тканевые трансплантаты (полнослойные перфорационные, расщепленные и аспирационные блистерные трансплантаты) и клеточные трансплантаты (аутологичные культуры меланоцитов и некультивированные эпидермальные клеточные трансплантаты). Другие методы включают культивирование эпидермальных суспензий [186, 187] и трансплантацию волосяных фолликулов [188-190].В тканевых трансплантатах используется необработанный пигментированный эпидермис и дерма, которые пересаживаются на депигментированные участки; они идеально подходят для лечения небольших участков [185]. Напротив, клеточные трансплантаты предполагают более сложную обработку трансплантатов перед операцией.

    В обзоре, основанном на фактических данных, сделан вывод о том, что расщепленные трансплантаты и блистерные трансплантаты являются наиболее эффективными и безопасными методами [185]. Старый систематический обзор рандомизированных исследований и обсервационных исследований методов аутологичной трансплантации при витилиго пришел к выводу, что наиболее эффективными и безопасными методами являются расщепленная толщина и пересадка эпидермальных пузырей [191].Обе группы лечения достигли репигментации в 90% случаев. Они не могли сделать выводы об эффективности методов культивирования, поскольку было изучено лишь небольшое количество пациентов. В некоторых исследованиях сообщалось о преимуществах трансплантации аутологичных культур меланоцитов и эпидермальных суспензий [186, 192, 193]. В РКИ, сравнивающем аутологичную некультивируемую клеточную суспензию эпидермиса с аспирационными волдырями у 41 пациента, обе группы лечения достигли репигментации ≥75% в более чем 85% поражений [193]. Тем не менее, больше поражений в группе некультивируемых суспензий эпидермальных клеток (70%) достигли 90-100% репигментации по сравнению с таковыми в группе аспирационных пузырей (27%) [193]. Важными преимуществами клеточной пластики являются возможность обработки больших площадей и лучшие косметические результаты, чем при использовании тканевых трансплантатов [194, 195]. Клеточные трансплантаты, по-видимому, вызывают менее частые побочные эффекты, чем перфорация, за которой следует расщепленная пластика [196].

    Депигментирующее лечение остаточных участков пигментации следует рассматривать только в отдельных случаях, таких как широко распространенное, рефрактерное и обезображивающее витилиго или хорошо заметное стойкое витилиго лица или рук [8].Монобензиловый эфир гидрохинона (монобензон) используется в качестве депигментирующего средства для пациентов с обширным витилиго с 1950-х годов [197]. Другие методы отбеливания кожи включают лазерное лечение (например, александрит с модуляцией добротности 755 нм или рубин с модуляцией добротности 694 нм) [198-200] и криотерапию [75].

    Надежные данные о лечении СВ ограничены, поскольку в большинстве исследований эти типы витилиго не различаются. Ранее считалось, что SV устойчив к лечению. Однако недавние исследования показали многообещающие результаты; особенно на ранней стадии.В течение первых 6 месяцев пациентам следует предлагать сильнодействующие ТКС или местные иммуномодуляторы в сочетании с NB-UVB, таргетной эксимерной лампой или лазером. Минипульс-терапия пероральными стероидами является еще одним вариантом, если поражение все еще находится в активной фазе. Напротив, если эти медицинские методы лечения неэффективны или на более поздней стадии заболевания, следует предложить хирургическое вмешательство. В целом, стабильный СВ является хорошим показанием для хирургической пластики, особенно потому, что наличие лейкотрихий в СВ делает его более устойчивым к стандартным медикаментозным методам лечения.

    Emerging Therapies

    Было показано, что афамеланотид, сильнодействующий синтетический аналог α-меланоцитостимулирующего гормона с более длительным действием, проявляет синергизм с NB-UVB в стимулировании репигментации [201, 202]. Простагландин E 2 контролирует пролиферацию меланоцитов посредством стимулирующего и иммуномодулирующего действия. В одном исследовании 56 последовательных пациентов со стабильным и ограниченным витилиго, репигментацией лечение простагландином E 2 0,25 мг/г геля два раза в день в течение 6 месяцев привело к репигментации у 40 пациентов; ответ был превосходным у 22 пациентов, а репигментация была полной у 8 [203].В РКИ было показано, что биматопрост, синтетический аналог простагландина F , одобренный для местного лечения глаукомы и гипотрихоза ресниц, обеспечивает более выраженную репигментацию, чем лечение мометазоном [204].

    Кроме того, ингибиторы JAK оказались многообещающими в лечении витилиго [116, 205]. Руксолитиниб является ингибитором JAK1 и JAK2. В фазе 2, подтверждающей концепцию, 1,5% крем руксолитиниба для местного применения применяли два раза в день у 11 взрослых пациентов с витилиго, поражающим не менее 1% площади поверхности тела, в течение 20 недель [206]. Восемь из 11 пациентов достигли ответа со средним улучшением индекса оценки площади витилиго на 23%. Наилучший ответ наблюдался у пациентов с лицевым витилиго. Затем пять пациентов, завершивших исследование, наблюдались через 6 месяцев после прекращения лечения, и у всех из них сохранялся ответ с максимальной продолжительностью >40 недель [205].

    Альтернативные варианты лечения

    Имеются ограниченные данные об использовании системных иммунодепрессантов, отличных от кортикостероидов, при лечении витилиго.Рандомизированное сравнительное исследование, проведенное на 52 пациентах с витилиго, показало, что метотрексат столь же эффективен, как пероральная минипульс-терапия с бетаметазоном или дексаметазоном в контроле активности заболевания, что позволяет предположить, что метотрексат можно использовать у пациентов с активным витилиго, если кортикостероиды противопоказаны [207]. Было показано, что пероральный прием циклофосфамида два раза в день (50 мг) вызывает репигментацию у 29 пациентов, включая трудно поддающиеся лечению области, такие как акральные области; однако сообщалось о значительных побочных эффектах [208]. Хотя некоторые авторы предположили, что анти-фактор некроза опухоли-α может стабилизировать заболевание при прогрессирующем витилиго [209], многие исследования продемонстрировали, что эти агенты не улучшают течение заболевания и даже могут вызывать начало и ухудшение заболевания. 210-214].

    Обогащенная тромбоцитами плазма (PRP) представляет собой аутологичный препарат тромбоцитов в концентрированной плазме, который содержит различные факторы роста. Предполагается, что эти факторы роста способствуют стимуляции меланоцитов [215].Более ранние исследования показали противоречивые результаты. Лим и др. [216] сообщили, что PRP сама по себе неэффективна при лечении витилиго. Однако Ибрагим и др. [217] провели исследование, сравнивающее комбинацию PRP с NB-UVB, и обнаружили лучшие результаты, чем лечение только NB-UVB. Семьдесят пять процентов пациентов в группе NB-UVB и PRP не имели более 50% репигментации по сравнению с ни одним из пациентов в группе NB-UVB. Совсем недавно проспективное открытое рандомизированное исследование показало, что сочетание фракционного лазера CO 2 с инъекцией PRP привело как минимум к 50% репигментации у всех пациентов, тогда как в группах, получавших только PRP и фракционный лазер CO 2 один показал минимальный ответ [218]. Наконец, простое слепое сравнительное клиническое исследование показало, что комбинация эксимерного лазера с инъекцией PRP приводила к хорошему ответу у 50% пациентов и отличному ответу у 35% пациентов, тогда как в группе, получавшей только лечение эксимерным лазером, не было никакого ответа. у 65% пациентов и только хороший ответ у 35% пациентов [219].

    В целом эти исследования показывают, что PRP при дополнительном использовании в комбинации может давать лучшие результаты при лечении витилиго. Тем не менее, клиницисты должны быть осторожны при интерпретации результатов этих исследований, в которых использовалось сочетание улучшенного режима терапии с незначительным вмешательством [220].Кроме того, повторные инъекции через короткие промежутки времени являются болезненной процедурой и могут вызвать кёбнеризацию [221]. Для подтверждения этих результатов необходимы дальнейшие более крупные РКИ с более длительным периодом наблюдения.

    Учитывая роль оксидативного стресса в патогенезе витилиго, для лечения витилиго использовали несколько продуктов с антиоксидантными ферментами (например, супероксиддисмутаза, каталаза). Хотя обоснование использования местных антиоксидантов при витилиго является убедительным, исследования показали противоречивые результаты, вероятно, из-за сложности доставки активных антиоксидантов непосредственно в кожу.В некоторых исследованиях изучалось использование местных антиоксидантов в качестве монотерапии; однако в большинстве случаев местные антиоксиданты использовались в сочетании с фототерапией. В одном рандомизированном парном двойном слепом исследовании сравнивали эффект местного 0,05% бетаметазона с местным супероксидом каталазы/дисмутазы [222]. После 10 месяцев лечения статистических различий между двумя группами не было. Другие исследования показали, что пероральные антиоксиданты оказывают значительное влияние на репигментацию, хотя уровень доказательств ограничен [223].Витамин Е [224, 225], Polypodium leucotomos [226, 227] и Ginkgo biloba [228, 229] кажутся полезными, особенно в сочетании с фототерапией. Необходимы дальнейшие двойные слепые контролируемые испытания для дальнейшего изучения роли антиоксидантов в лечении витилиго.

    Фторурацил (5-ФУ) обладает антимитотической активностью с селективной цитотоксичностью в отношении быстро пролиферирующих кератиноцитов, что используется при лечении немеланомного рака кожи.Одним из его побочных эффектов является гиперпигментация [230]. Еще в 1985 г. Tsuji и Hamada [231] обнаружили, что хотя 5-FU сам по себе не оказывает никакого действия, его применение после эпидермальной абразии приводит к репигментации у большинства пациентов. С тех пор в нескольких исследованиях была показана эффективность 5-ФУ при лечении витилиго с использованием различных способов применения, например, после лазерной абляции кожи в сочетании с фототерапией [232], после дермабразии [233] и в сочетании с микронидлингом [232]. 234, 235].Более недавнее исследование показало, что при локализованном НСВ внутрикожное введение 5-ФУ показало лучшее общее улучшение по сравнению с внутрикожным введением триамцинолона [236]. Его эффекты сохранялись в течение 6 мес, тогда как эффект триамцинолона прекращался через 1 мес после последней инъекции.

    Качество жизни

    Психосоциальный эффект витилиго важен и хорошо известен [1, 8, 160]. Кожа играет важную роль в нашем взаимодействии с миром, и видимые кожные заболевания могут ограничивать здоровое психосоциальное развитие из-за стигматизации, создаваемой этими расстройствами.Исторически сложилось так, что кожные заболевания и люди, которых они поражают, подвергались стигматизации [237, 238]. Существует значительное количество литературы, свидетельствующей о витилиго с древних времен и в различных культурных и религиозных условиях. Гиппократ (460–355 до н. э.) не различал витилиго и проказу. К сожалению, эта путаница с проказой сохраняется во многих сообществах мира до сегодняшнего дня, где люди с витилиго страдают от социальной стигматизации так же, как и люди, страдающие проказой [8].В древней буддийской литературе (624–544 гг. до н.э.) говорилось, что люди с витилиго не имеют права на рукоположение [160]. С древних времен мужчин и женщин с витилиго часто лишали права вступать в брак, а появление витилиго считалось дефектом брака, дающим вескую причину для развода [8, 160]. Степень стигматизации варьируется в зависимости от культуры, что приводит к различиям в дерматологическом индексе качества жизни (DLQI) [239].

    Качество жизни и бремя витилиго можно измерить с помощью общих инструментов оценки, таких как Short Form-12 [240] и DLQI, или с помощью более конкретных инструментов, таких как Шкала воздействия витилиго [241], специфическое для витилиго качество, связанное со здоровьем Life Instrument [162] или шкалы Vitiligo Impact Patient [242].Хотя общие инструменты, такие как DLQI или Short Form-12, могут дать общую картину ухудшения качества жизни, они, как правило, не позволяют выявить нюансы того, как пациенты справляются с общим бременем витилиго [3, 243, 244]. Портер и др. [245] впервые описали серьезное влияние витилиго на качество жизни пациентов еще в конце 1970-х годов. С тех пор появляется все больше данных, подтверждающих, что витилиго оказывает серьезное влияние на качество жизни пациентов [3, 160, 161, 169, 243, 246-248].Недавний метаанализ, в который были включены 1799 человек с витилиго, подтвердил ухудшение качества жизни у пациентов с витилиго по сравнению со здоровыми людьми из контрольной группы [249]. Пациенты с витилиго часто имеют несколько психологических проблем, таких как депрессия, тревога и чувство стыда, которые могут привести к низкой самооценке и социальной изоляции [161, 245]. Один недавний метаанализ показал, что у людей с витилиго распространен ряд психологических исходов, включая депрессию и тревогу [244], а два других метаанализа подтвердили высокую распространенность депрессии у пациентов с витилиго [250, 251].Эти пациенты испытывают значительное бремя, связанное с болезнью, и самоощущение стресса, независимо от фототипа [3]. Витилиго оказывает негативное влияние на сексуальную жизнь [246, 252]. Пациенты с витилиго сообщают о недостаточной поддержке со стороны своих врачей, друзей и семьи [245, 246, 252, 253]. Пациенты с витилиго испытывают дискриминацию, так как многие люди боятся или чувствуют себя некомфортно с другими людьми, у которых есть витилиго.

    Начало витилиго в подростковом возрасте является фактором риска ухудшения качества жизни [246, 254].Витилиго, возникающее в детстве, может иметь долгосрочное влияние на самооценку человека и может быть связано со значительной психологической травмой [254]. Было замечено, что дети с витилиго ограничивают свою физическую активность, избегают ношения одежды, которая обнажает очаги витилиго, и пропускают больше школьных дней, чем дети без витилиго [254]. Витилиго вызывает больше смущения и неловкости по мере взросления этих детей: витилиго беспокоило 95% подростков (15–17 лет) по сравнению с 50% детей (6–14 лет) [254].

    По сравнению с пациентами с другими кожными заболеваниями, такими как псориаз и атопический дерматит, у пациентов с витилиго общее влияние на качество жизни ниже [246, 249]. Степень поражения лица, рук, ног и кистей коррелирует с более низким DLQI [246]. Однако наличие видимых поражений, по-видимому, не влияет на общую картину, что означает, что ухудшение качества жизни больше связано с активностью заболевания, чем с поражением открытых участков, и что пациенты испытывают дискомфорт, вторичный по отношению к неконтролируемому прогрессированию заболевания. их заболевание, а не наличие поражений на открытых участках [1, 255].

    Этот психосоциальный стресс и сопутствующие психиатрические заболевания следует принимать во внимание при лечении витилиго, поскольку стресс может быть провоцирующим фактором [1]. Действительно, лечение витилиго не должно ограничиваться клинической тяжестью заболевания, но должно также учитывать качество жизни пациента [256]. Социальную тревожность, вызванную витилиго, можно уменьшить с помощью когнитивно-поведенческой терапии самопомощи [257]. Пападопулос и др. [258] предоставили предварительные доказательства того, что когнитивно-поведенческая терапия может оказывать положительное влияние на прогрессирование самого состояния.

    Заключение

    Витилиго — распространенное многофакторное заболевание кожи с очень сложным патогенезом. Хотя в последнее время в нашем понимании витилиго был достигнут значительный прогресс, причина и патогенез витилиго остаются неясными. Остается неясным, что в конечном итоге вызывает разрушение меланоцитов, и необходимы дальнейшие исследования для полного выяснения патогенеза витилиго. Выявление биологических медиаторов и молекулярных механизмов, которые приводят к метаболическим дефектам и, следовательно, к дегенерации меланоцитов и аутоиммунитету, важно для определения новых терапевтических целей и лекарств, которые могли бы предотвратить, остановить прогрессирование заболевания или даже вылечить витилиго.Опыт системной биологической терапии, нацеленной на цитокины, такой как при псориазе, предполагает, что аналогичный подход может быть успешно использован при витилиго. Таким образом, нацеливание на ось IFN-γ-хемокинов с помощью существующих или разрабатываемых лекарств является заманчивым и многообещающим.

    Кроме того, еще одним важным вопросом в области витилиго является повышение актуальности будущих клинических испытаний витилиго и возможность их сравнения. Существует значительная неоднородность показателей результатов, используемых в РКИ по витилиго.Действительно, Элефтериаду и др. [259] сообщили, что для измерения репигментации в 54 контролируемых исследованиях использовалось 48 различных инструментов для измерения результатов. Существует 11 инструментов измерения результатов для измерения аспектов витилиго [260, 261]. Следуя вышеизложенному, были проведены два международных консенсуса e-Delphi по основному набору исходов для витилиго [262, 263]. Они определили успешный процент репигментации как ≥80% [262, 263]. Наконец, недавно были проведены три семинара с пациентами с витилиго в соответствии с рекомендациями Кокрановской группы по определению основных результатов лечения кожи и Согласительной группы по глобальным проблемам витилиго [264].Авторы рекомендовали использовать процент квартилей репигментации (0-25, 26-50, 51-79, 80-100%) и Шкалу заметности витилиго [265-267]. Эти постоянные усилия по созданию набора основных результатов улучшат возможность использования результатов испытаний для метаанализа и в конечном итоге приведут к большей уверенности в решениях относительно надлежащего лечения пациентов с витилиго [264-267].

    Key Message

    Витилиго является наиболее распространенным депигментирующим заболеванием кожи с очень сложным патогенезом, и его лечение до сих пор остается одной из самых сложных дерматологических проблем.

    Заявление о раскрытии информации

    У авторов нет конфликта интересов, о котором следует заявить.

    Источники финансирования

    Эта статья не получила никакого финансирования.

    Вклад автора

    Кристина Бергквист написала рукопись. Халед Эззедин руководил работой и редактировал рукопись для критического пересмотра важного интеллектуального содержания.

    Авторское право: Все права защищены. Никакая часть данной публикации не может быть переведена на другие языки, воспроизведена или использована в любой форме и любыми средствами, электронными или механическими, включая фотокопирование, запись, микрокопирование или любую систему хранения и поиска информации, без письменного разрешения издателя. .
    Дозировка препарата: авторы и издатель приложили все усилия, чтобы гарантировать, что выбор препарата и дозировка, указанные в этом тексте, соответствуют текущим рекомендациям и практике на момент публикации. Тем не менее, в связи с продолжающимися исследованиями, изменениями в правительственных постановлениях и постоянным потоком информации, касающейся лекарственной терапии и реакций на лекарства, читателю настоятельно рекомендуется проверять вкладыш в упаковке для каждого лекарства на предмет любых изменений в показаниях и дозировке, а также для дополнительных предупреждений. и меры предосторожности.Это особенно важно, когда рекомендуемый агент является новым и/или редко используемым лекарственным средством.
    Отказ от ответственности: заявления, мнения и данные, содержащиеся в этой публикации, принадлежат исключительно отдельным авторам и участникам, а не издателям и редакторам. Появление рекламы и/или ссылок на продукты в публикации не является гарантией, одобрением или одобрением рекламируемых продуктов или услуг или их эффективности, качества или безопасности.Издатель и редактор(ы) отказываются от ответственности за любой ущерб людям или имуществу в результате любых идей, методов, инструкций или продуктов, упомянутых в содержании или рекламе.

    Психологическое воздействие «экранного времени» и «зеленого времени» на детей и подростков: систематический обзорный обзор

    Поиск литературы выявил 8 369 исследований; 8 179 исследований были удалены, поскольку они либо дублировали друг друга (n = 2 544), либо не соответствовали критериям включения на основании информации в заголовке (n = 4 709) или аннотации (n = 926). Полный текст 190 исследований был оценен на предмет приемлемости, из которых 114 соответствовали критериям включения. Скрининг референсных списков включенных 114 исследований привел к выявлению еще 60 подходящих исследований. Эти исследования не были включены в первоначальный поиск, поскольку в них не использовались ключевые слова или индексные термины, связанные либо с (а) психологическими последствиями (например, исследования, в основном сосредоточенные на ожирении или индексе массы тела (ИМТ), физической активности или сне), б) детство или юность (т.g., выборки включали людей всех возрастов) или (c) ST (например, когда ST был просто вторичной переменной в более крупном исследовании или был классифицирован как «сидячий образ жизни», который может отличаться от ST). Двенадцать дополнительных исследований были получены путем ручного поиска литературы. Следовательно, в обзор было включено в общей сложности 186 исследований (см. рис. 1).

    3.1 Описание литературы по ST и GT

    Исследования, включенные в систематический обзорный обзор, представлены в таблице 2 в совокупности в виде количества и процента по нескольким описательным категориям. Описательные характеристики отдельных исследований можно найти в файле S3.

    3.1.1 Исследования по годам и темам.

    На рис. 2 представлены включенные исследования по теме исследования и году публикации (n = 186). Количество исследований, оценивающих ST, GT или и то, и другое, значительно увеличилось с течением времени. В целом, мы выявили почти вдвое больше исследований, оценивающих ST (n = 114; 61%), чем GT (n = 58; 31%), и только 14 исследований (7,5%), оценивающих оба воздействия; из них большинство было опубликовано за последние пять лет.

    3.1.2 Географическое распределение исследуемых выборок.

    Дети и подростки в странах с высоким уровнем дохода, таких как США (n = 58), Великобритания (n = 37), Австралия и Новая Зеландия (n = 25), Канада (n = 17) и по всей Европе (n = 61) были наиболее широко представлены в литературе (табл. 2).

    3.1.3 Условия исследования и размеры выборки.

    Размер выборки варьировался от 11 до 388 275 участников, в среднем 969 человек. Из включенных исследований три (<2%) охватили несколько стран, 40 (21%) представляли собой национальные репрезентативные выборки, семь (4%) были репрезентативными для штат или аналогичная юрисдикция внутри страны, а остальные либо представляли собой меньшую территорию, такую ​​как регион или город, либо использовали участников в выбранных школах, организациях или с определенными характеристиками (например,г., тучная молодежь).

    3.1.4 Дизайн исследования.

    Кросс-секционные исследования были, безусловно, наиболее распространенным дизайном исследований, на которые приходилось 74% исследований ST (n = 85), 42% исследований GT (n = 24) и 57% исследований, в которых изучались как ST, так и ГТ (n = 8). Продольные исследования были относительно более распространены в литературе по ST (n = 26; 23%), в то время как дизайн исследований GT был значительно более вариативным из-за использования различных претест-посттестов (в основном без контрольной группы) и квазиэкспериментальных исследований. конструкций (табл. 2).

    3.1.5 Возрастные группы.

    Чаще всего изучались подростки раннего возраста (n = 51 исследование; 27%), за ними следовали школьники (n = 44 исследования; 24%), подростки старшего возраста (n = 20 исследований; 11%) и дети младшего возраста (n = 14). учеба; 7%).

    3.1.6 Измерение психологических результатов.

    Более чем в половине включенных исследований изучались показатели плохого психического здоровья (n = 100; 54%), за которыми следовали показатели положительного психического здоровья, которые оценивались в 45% исследований (n = 84).Показатели как плохого, так и положительного психического здоровья изучались в 25% исследований (n = 46). Меньшее количество исследований касалось результатов, связанных с успеваемостью (n = 40; 21,5%) или когнитивными функциями (n = 34; 18%). В трех исследованиях (<2%) также изучались другие переменные, измеряющие связанность или родство с природой, которые не попали в четыре категории.

    3.
    1.7 Концептуализация и измерение ST и GT в литературе.

    На рис. 3 показан язык, используемый для концептуализации и измерения ST (выделено синим цветом) и GT (выделено зеленым цветом) во включенных исследованиях.Как видно из крупного текста, «традиционные» экранные действия, такие как просмотр телевизора, видеоигры и использование компьютера, широко представлены в литературе. Терминология, используемая для ST, разнообразна, с регулярными ссылками на «время перед экраном», «сидячий образ жизни» и «использование средств массовой информации». Парки, зеленые насаждения и игры на свежем воздухе обычно оценивались в литературе по GT, наряду с использованием нормализованного индекса различий растительности (NDVI), который измеряет озеленение территории с помощью спутниковых изображений [60].Переменные окружающей среды часто измерялись в районах, школах или домах и вокруг них.

    3.2 Текущие данные – связь между ST, GT и психологическими последствиями

    Ниже представлен обзор ассоциаций между ST или GT и психологическими исходами во включенных исследованиях. В разделе 3.2 исследуется общая согласованность результатов по возрастным группам. В этом разделе не делается различий между дизайнами исследований, хотя эту информацию можно найти в таблицах.Подробное рассмотрение исследований с лонгитюдным, экспериментальным или интервенционным компонентом, когда они позволяли изучить причинно-следственные связи (например, имели сопоставимые группы, включали исходные психологические профили и рассматривали конкурирующие объяснения или смешанные переменные), представлены в разделе 3.3.

    3.2.1 Маленькие дети (
    <5 лет).

    В таблице 3 представлены результаты исследований, изучающих связь между ST (8 исследований) или GT (5 исследований) и психологическими исходами у детей младшего возраста [61–73].Исследования детей раннего возраста включали в общей сложности 30 476 участников исследований ST (плюс 483 семьи с неуказанным количеством), 2836 участников исследований GT и 575 участников исследований, изучающих как ST, так и GT вместе.

    В этой возрастной группе воздействия ЗТ чаще всего изучались в связи с когнитивным функционированием и в целом, по-видимому, продемонстрировали пагубные ассоциации с когнитивным развитием [69, 71], усилием контроля [68], речью [63, 67, 69, 71]. ] и коммуникативные [63] способности.Неблагоприятные связи между ST и поведенческими проблемами [65], общими трудностями [72], саморегуляцией [70] и просоциальным поведением [72] также были продемонстрированы в ряде поперечных и лонгитюдных исследований. Только в двух исследованиях в этой возрастной группе не сообщалось о статистически значимой связи между воздействием ЗТ и психологическим исходом [65, 67].

    Исследование ГТ было менее последовательным: в некоторых исследованиях сообщалось об отсутствии статистически значимой связи между воздействием ГТ и психологическими последствиями [62, 64, 66, 73] наряду с благоприятными ассоциациями [61, 62, 66, 73].В одном исследовании случайная ГТ, такая как расстояние до зеленых насаждений, не была связана с психическим здоровьем маленьких детей [66]. Однако в этом и других исследованиях зеленый образовательный контекст [61, 62], удовлетворенность зелеными насаждениями [66] и жилая зелень [66] положительно ассоциировались с рядом психологических результатов. Это включало снижение депрессивного аффекта, проблемы интернализации, проблемы со сверстниками и общие трудности, а также превосходное просоциальное поведение, когнитивное, языковое, эмоциональное и социальное развитие.Кроме того, в одном исследовании сообщалось, что определенные подгруппы, такие как маленькие дети из этнических меньшинств (дети британцев из Южной Азии), получили пользу от этих воздействий ГТ в большей степени, чем белые британские дети [66]. Наконец, экспериментальное исследование показало, что по сравнению с ходьбой по городу прогулка на природе привела к более высокой пространственной рабочей памяти у маленьких детей [73].

    3.2.2 Школьники (5–11 лет).

    В таблице 4 представлены результаты исследований, изучающих связь между ST (18 исследований) или GT (22 исследования) и психологическими исходами у школьников [28, 73–111].Исследования школьников включали в общей сложности 58 861 участника исследований ST, 252 826 участников исследований GT (плюс 1 940 школ с неуказанным количеством учащихся) и 15 356 участников исследований, изучающих как ST, так и GT вместе.

    В целом результаты исследований были противоречивыми: 11 исследований ST [79, 80, 83, 88, 91, 99, 100, 102, 103, 105, 106] и 15 исследований GT [73–76, 78, 82, 85, 89, 92, 94–96, 104, 107, 108], в которых не сообщается об отсутствии статистически значимой связи между хотя бы одним воздействием и измеренной переменной психологического результата.Однако там, где сообщалось о статистически значимых ассоциациях, воздействие ST обычно ассоциировалось с неблагоприятными психологическими исходами ( n = 16 исследований), в то время как воздействие GT обычно ассоциировалось с благоприятными психологическими исходами ( n = 18 исследований).

    В большинстве исследований изучалось влияние общего ST, и в доступной литературе неясно, оказывает ли конкретный тип экранной активности наибольшее влияние на школьников.ST чаще всего ассоциировался с неблагоприятными исходами по показателям плохого психического здоровья, таким как депрессия/симптомы депрессии [83, 93, 100], проблемы с поведением [80, 88, 99, 102], эмоциональные проблемы [80, 88, 99] , негативный аффект [100], общие трудности [90, 101], вспыльчивость, бессонница, озвучивание соматических жалоб [100]. В некоторых исследованиях стратификация ST по выходным и будним дням, отчетам детей и родителей или по полу выявила дифференциальные психологические ассоциации.В целом выходной [83] и самооценка ST [79] были связаны с более широким спектром неблагоприятных психологических последствий, однако это значительно различалось в зависимости от пола. ST также был связан с различными показателями когнитивного функционирования, включая ухудшение внимания [87, 105, 106] и исполнительного функционирования, языка, памяти, обучения и зрительно-пространственной обработки [105] у школьников. Кроме того, в некоторых исследованиях более высокий ST был связан с уменьшением счастья [84] и более плохими академическими результатами [79, 86, 98].

    У школьников был рассмотрен широкий спектр воздействий ГТ. Образование за пределами класса и лесные школы (n = 4 исследования) были отмечены как в значительной степени полезные, поскольку они связаны с уменьшением гнева [104], более здоровыми профилями кортизола (указывающими на снижение стресса) [28], повышением энергии [104], счастьем [104]. ] и просоциальное поведение [78], наряду с улучшением общего психического здоровья мальчиков [89]. В одном исследовании школьники, которые воспринимали свой школьный двор как более восстанавливающий, испытывали больший положительный эффект после перемены [75].Озеленение школьного двора привело к восстановлению повышенного внимания [108], в то время как эксперимент показал, что короткая прогулка на природе была связана с повышенным вниманием [73].

    В некоторых исследованиях более высокая степень зелени в окружении ребенка, измеренная с помощью NDVI, была связана с лучшим психическим здоровьем (меньше эмоциональных проблем, проблем с гиперактивностью/невнимательностью и общими трудностями [74]), лучшим когнитивным функционированием (улучшение внимания [74]). 74, 82], превосходная рабочая память [82] и рабочая память [82]), а также лучшая успеваемость по языку/искусству и математике в школе [110].Однако эти ассоциации отличались жилой и школьной озелененностью. Кроме того, в одном исследовании было показано, что более зеленая среда приносит пользу детям в учебе в городских школах, но не в сельских школах [107]. Одно исследование показало, что более высокий уровень зелени был связан с более низкой успеваемостью в школе [77]; однако было предложено, чтобы это отражало связь зеленых насаждений с более низкими сообществами SES в Новой Зеландии.

    Жилая близость к крупным зеленым насаждениям не была связана с какими-либо психологическими последствиями в одном поперечном исследовании [74], в то время как доступ к частному саду и парку был связан с более низким поведением, гиперактивностью/невнимательностью и проблемами со сверстниками в лонгитюдном исследовании. исследование [85].В том же перекрестном исследовании [74] время игры в зеленом пространстве было связано с более низкими эмоциональными проблемами, проблемами со сверстниками и общими трудностями.

    3.2.3 Ранние подростки (12–14 лет).

    В таблице 5 представлены результаты исследований, изучающих связь между ST (39 исследований) или GT (11 исследований) и психологическими исходами у подростков раннего возраста [112–161]. Исследования ранних подростков включали в общей сложности 97 820 участников исследований ST, 4 100 участников исследований GT и 20 122 участника исследований, изучающих как ST, так и GT вместе.

    Двадцать четыре исследования ST [113, 114, 117, 119, 121, 122, 126–128, 130, 136–138, 140, 142–144, 148–150, 153, 155, 157, 159] и 10 ГТ исследования [123, 125, 131–133, 139, 145, 147, 160, 161] сообщили по крайней мере об одной ассоциации с психологическим исходом, которая не была статистически значимой. Однако там, где сообщалось о статистически значимых ассоциациях, воздействие ST обычно ассоциировалось с неблагоприятными психологическими исходами ( n = 32 исследования), в то время как воздействие GT обычно ассоциировалось с благоприятными психологическими исходами ( n = 8 исследований).

    Время просмотра телевизора в значительной степени не было связано со всеми психологическими последствиями в этой возрастной группе. Исследования, измеряющие общий ST, были наиболее распространены и, как правило, сообщали о неблагоприятных связях с рядом психологических исходов. Общее ST было связано с показателями плохого психического здоровья, такими как более выраженные симптомы тревоги [118, 142], депрессия/депрессивные симптомы [116, 118, 134, 142], депрессивный аффект (у девочек) [157], экстернализирующие проблемы [152] проблемы с интернализацией [152], жалобы на здоровье [135] и общие проблемы с психическим здоровьем [152].

    Общее ST также было связано со снижением положительного психического здоровья, такого как более низкое состояние здоровья [135], качество жизни, связанное со здоровьем [141, 146], качество жизни [135], психологическое благополучие [113], школьная деятельность [ 128], удовлетворенность школьной жизнью [118], снижение эмоционального функционирования [128] и самооценки [148] (особенно у девочек [128, 157]). В двух исследованиях сообщалось о важном различии между малоподвижным поведением screen и сидячим поведением без экрана (например, ).g., чтение), при этом малоподвижное поведение за экраном было связано с более низкой самооценкой, а малоподвижное поведение без экрана — нет [148, 157]. Кроме того, исследование, в котором сравнивались «кластеры» различных типов пользователей технологий [156], показало, что подростки раннего возраста, которые были обозначены как «инструментальные пользователи компьютеров» (характеризующиеся как пользователи электронной почты и компьютеры в целом), имели более благоприятные показатели самоэффективности и настроения. по сравнению с «мультимодальными электронными игроками» и «компьютерными электронными игроками», хотя некоторые гендерные различия присутствовали.

    В целом, более высокий общий ST был связан с более низкой успеваемостью [112, 121, 129, 154], средним баллом [158], языковой успеваемостью [149] и успеваемостью по математике [149]. В то время как связь между ST и показателями когнитивного функционирования была менее четкой, видеоигры ассоциировались с лучшими зрительно-пространственными способностями в двух исследованиях, поперечном [137] и продольном [138] для подростков раннего возраста. В других исследованиях использование компьютера было связано с более низкими показателями внимания в поперечном разрезе [159], в то время как многозадачность в медиа была связана с более низким вниманием в лонгитюдном масштабе [115]. В том же лонгитюдном исследовании не было обнаружено обратного влияния проблем с вниманием на мультизадачность с течением времени [115]. В поперечном исследовании мультизадачность не была связана с торможением, переключением внимания или рабочей памятью при измерении с помощью объективных когнитивных тестов; однако, когда ранние подростки сообщали о своих ежедневных трудностях в этих подкомпонентах исполнительной функции, было обнаружено, что многозадачность в СМИ неблагоприятно ассоциировалась с этими самоотчетами [114].

    В этой возрастной группе были обнаружены противоречивые данные о воздействии GT. Образовательные программы на открытом воздухе и походные лагеря были связаны с повышением удовлетворенности жизнью [147], внимательности [147] и самооценки [145]. Мероприятия по озеленению школьного двора были связаны со снижением физиологического стресса и улучшением самочувствия [139], в то время как внесение растений в классы не повлияло на тревожность, самочувствие или успеваемость в раннем подростковом возрасте в другом исследовании [132]. Обучение на свежем воздухе было связано с большим улучшением математических навыков в квазиэксперименте [123], но эти результаты следует интерпретировать с осторожностью из-за значительных исходных различий между группами.

    Более высокий процент парковых зон в районах был связан с более низким восприятием стресса у подростков в поперечном географическом исследовании [124], но в РКИ просмотр сцен естественной среды на экране не был связан с изменениями настроения или самочувствия. -уважение [161]. Выводы, касающиеся воздействия зеленых насаждений в раннем подростковом возрасте и психологических последствий, были противоречивыми, причем результаты варьировались в зависимости от качества и количества зеленых насаждений, а также от того, сообщали ли психологические переменные сами, родители или учителя [125, 131, 160].В целом, для этой возрастной группы было выявлено несколько исследований, посвященных влиянию ГТ на когнитивные функции и успеваемость.

    3.2.4 Подростки старшего возраста (15–18 лет).

    В таблице 6 представлены результаты исследований, изучающих связь между ST (13 исследований) или GT (4 исследования) и психологическими исходами у подростков старшего возраста [22, 42, 162–176]. Исследования подростков старшего возраста включали в общей сложности 155 418 участников исследований ST, 1053 участника исследований GT и 2065 участников исследований, изучающих как ST, так и GT вместе.

    Десять исследований ST [162–166, 168–171, 176] и два исследования GT [173, 175] не сообщили об отсутствии статистически значимой связи между хотя бы одним воздействием и измеренным психологическим исходом. Там, где сообщалось о статистически значимых ассоциациях, они, как правило, были неблагоприятными для ST ( n = 13 исследований) и благоприятными для GT ( n = 3 исследования).

    СТ в основном исследовали в отношении показателей неблагополучия психического здоровья подростков старшего возраста. Результаты исследований, демонстрирующих связь между воздействием ST и психологическими последствиями, в первую очередь предполагают, что высокие уровни ST связаны с более плохим психическим здоровьем при различных воздействиях и исходах. В частности, высокий ST в основном был связан с более высоким уровнем депрессии/депрессивных симптомов [162, 164, 165, 168–170, 174] и симптомов тревоги/тревоги [165, 170, 176] у подростков старшего возраста. Одно исследование обнаружило нелинейную U-образную связь между ST и психическим здоровьем, согласно которой просмотр телевизора, игры, использование компьютеров и использование смартфонов выше точки перегиба были связаны с более плохим психическим здоровьем, но участие в деятельности ST в умеренных диапазонах оказалось быть связанным с психическим благополучием [22].Единственным исключением в том же исследовании было использование смартфона в выходные дни, что было связано с ухудшением психического самочувствия на всех уровнях использования [22].

    В целом результаты по показателям положительного психического здоровья были менее четкими; однако оказывается, что некоторые виды деятельности, такие как просмотр телевизора [163, 166, 171], менее важны, чем другие. Например, исследования показали, что высокий уровень игры в видеоигры был связан с более низким эмоциональным функционированием [163], качеством жизни, связанным со здоровьем [163, 171], психосоциальными показателями [163] и качеством жизни [171]. Это также было связано с более плохой успеваемостью в школе для мальчиков, которые больше играли в видеоигры во время школьных семестров [166]. Напротив, одно исследование показало, что большее количество просмотров телевизора связано с лучшим качеством жизни, связанным со здоровьем [171]. В исследованиях редко рассматривалось влияние ЗТ на когнитивные функции в этой возрастной группе, и только одно исследование показало неблагоприятную связь между игрой и вниманием у подростков старшего возраста [170]. Из трех исследований, посвященных академической успеваемости, большинство экспозиций ST, включая использование социальных сетей, были связаны с более низкой успеваемостью [167, 174, 176].

    В этой возрастной группе исследовались программы на свежем воздухе, походы в лагеря и экспедиции в дикую природу. Хотя в значительной степени это не связано с большинством психологических результатов, было обнаружено, что эти переживания ГТ повышают самоэффективность [173] и позитивную идентичность [172], а также уменьшают долгосрочные общие трудности [175] и тревогу [173]. В другом исследовании [42] обобщены 126 подходов к моделированию путей, связывающих переменные зеленых насаждений с последствиями для психического здоровья подростков, посредством комбинации анализов одиночного, параллельного и последовательного опосредования, подчеркивая сложность взаимосвязи между природной средой и психическим здоровьем.

    3.2.5 Исследования смешанных возрастных групп.

    Как упоминалось ранее, каждое исследование было отнесено к категории возрастной группы; однако в некоторых исследованиях участвовал широкий возрастной диапазон участников без указания доминирующей возрастной группы. Следовательно, они были классифицированы как исследования смешанных возрастных групп [177–229]. Тридцать шесть исследований со смешанными возрастными группами рассматривали ST как воздействие, а 17 таких исследований рассматривали GT как воздействие. Исследования смешанных возрастных групп включали в общей сложности 883 732 участника исследований ST, 68 783 участников исследований GT (плюс 320 школ с неуказанным количеством учащихся) и 7 468 участников исследований, изучающих как ST, так и GT.

    Индивидуальные характеристики этих исследований смешанных возрастных групп можно найти в файле S3. Результаты исследований этих смешанных возрастных групп представлены в файле S4. В целом, некоторые из этих исследований противоречили ранее представленным связям между ST, GT и психологическими исходами. Результаты исследований смешанных возрастных групп с лонгитюдным, экспериментальным или интервенционным компонентом более подробно рассматриваются в разделах 3.3.1 и 3.3.2, поскольку они позволяют изучить причинно-следственные связи.

    3.3 Изучение основы причинно-следственных связей

    При изучении того, могут ли связи между ST, GT и психологическими последствиями быть причинно-следственными (Цель 2), были рассмотрены элементы дизайна исследования и ключевые переменные, используемые в анализе (как указано в разделе 2.4). Является ли связь между ST, GT и психологическими результатами причинно-следственной или нет, это важный вопрос, например, для обоснования инвестиций в GT для улучшения психологического благополучия. Ключевым соображением является не направление причинно-следственной связи, а наличие доказательств причинно-следственной связи.На психологическое благополучие могут влиять как ST, так и GT, и, в свою очередь, психологическое благополучие может в некоторой степени влиять на участие людей в ST и GT. В то время как двунаправленность предлагает возможности для укрепления здоровья путем вмешательства в петлю обратной связи, если ассоциации являются артефактами, созданными предвзятостью или смешением, это не было бы целесообразным направлением для укрепления здоровья.

    Хотя эксперименты и рандомизированные контролируемые испытания считаются золотым стандартом для демонстрации причинно-следственной связи в психологии, они не всегда осуществимы или этичны при исследовании воздействий окружающей среды.Таким образом, в эпидемиологии окружающей среды возобновились дискуссии о том, как делать выводы о причинно-следственных связях на основе наблюдений (например, [230–232]). Имеются предыдущие примеры серьезных угроз для здоровья и окружающей среды, в отношении которых разумные действия были отложены, когда, задним числом, появились ранние предупреждения в данных наблюдений (например, последствия для здоровья (респираторные заболевания) и экологические издержки (деградация лесов), связанные с загрязнение серы в результате «кислотных дождей»[233]). Это отражает необходимость наилучшим образом использовать несовершенные данные при оценке взаимосвязей между окружающей средой и здоровьем человека.

    Определение причинно-следственной связи не обязательно зависит от одного метода, но может включать в себя объединение доказательств из ряда методов и источников данных; это было сформулировано как «триангуляция доказательств» [232]. Если большинство доказательств указывает на один и тот же вывод, существует большая вероятность того, что отношения случайные. В этой области важно обратить внимание на исследования, в которых источники предвзятости различны и потенциально могут влиять на результат в нетипичных направлениях.Имея это в виду, несмотря на сложность синтеза доказательств, неоднородность способов концептуализации и измерения ST и GT является полезным аспектом литературы. Точно так же множество различных контекстов, в которых исследовались ассоциации, является сильной стороной и дает некоторые основания для признания того, что ассоциации не являются артефактами, несмотря на то, что формальное рассмотрение предвзятости и смешения в этой литературе ошибочно. В совокупности обилие результатов и их относительная согласованность с точки зрения в основном благоприятных ассоциаций между ГТ и психологическими исходами и в основном неблагоприятных ассоциаций между СТ и психологическими исходами позволяют предположить, что ассоциации (а) не случайны, (б) не связаны с публикацией. предвзятость (даже если такая степень могла иметь место) и (c) возможно причинно-следственная.

    Семейное неблагополучие остается наиболее важным источником путаницы и, вероятно, применимо почти во всех условиях. Наш запланированный акцент на изучении дифференциального воздействия СЭС в рамках исследований (Цель 3, раздел 3.4) представляет собой как оценку смешения (решаемую путем стратификации), так и вопрос с последствиями социальной справедливости. Однако, прежде чем приступить к тщательному изучению этого аспекта литературы, мы предоставим отчет об исследованиях, которые имеют лонгитюдный, экспериментальный или интервенционный компонент, и рассмотрим, как они поддерживают или опровергают доводы в пользу причинно-следственной связи. Когортные исследования позволяют продемонстрировать, что воздействие связано с результатом, ковариантным во времени. Если исходная переменная измеряется на исходном уровне, то можно оценить изменение исхода для различных уровней воздействия, а эффект «доза-реакция» может подтвердить причинно-следственную связь после устранения источников систематической ошибки и смешения. Теоретически смешение устраняется в интервенционных исследованиях и экспериментах за счет случайного распределения участников по группам.На практике систематические различия все еще могут присутствовать, особенно в относительно небольших исследованиях, поэтому важно изучить, были ли группы сходными на исходном уровне.

    3.3.1 Исследования ST.

    Девятнадцать лонгитюдных исследований ST, включенных в этот систематический предварительный обзор, дали представление об исходных психологических профилях и надлежащим образом учли их в анализе (например, психологические профили были учтены путем использования изменений по сравнению с исходными или эквивалентных подходов). Эти исследования позволяют изучить причинно-следственные связи между ST и психологическими последствиями. Ниже приводится краткое описание каждого исследования.

    В двух из этих лонгитюдных исследований ST рассматривалась ассоциация с показателями положительного психического здоровья. Один продемонстрировал, что ST не был связан с удовлетворенностью жизнью в течение 6-месячного периода для 10-17-летних, после учета исходной удовлетворенности жизнью [127]. В другом сообщалось, что использование компьютера и рекреационная ST были связаны со снижением психологического благополучия в 7-м классе [113].Одно исследование с отставанием во времени оценивало связь между ST и психологическим благополучием (измеряемым самооценкой, удовлетворенностью жизнью и счастьем) для 8 90 583, 90 584, 10 90 583, 90 584 и 12 90 583, 90 584 учащихся в период с 1991 по 2016 год. [197]. Используя анализ причинно-следственной связи по Грейнджеру (который позволяет оценить, изменялось ли воздействие ST до психологического благополучия или наоборот), исследование показало, что увеличение использования социальных сетей, Интернета, текстовых сообщений и игр привело к снижению уровня психологических расстройств у подростков. благополучия с течением времени [197].

    Шесть лонгитюдных исследований ST, рассматривающих когнитивные функции, дали неоднозначные результаты. В трех исследованиях с последующим наблюдением через год сообщалось, что ST был связан с повышенными проблемами внимания. В эти исследования были включены дети в возрасте 6–12 лет [106], 9–10 лет [87] и ранние подростки [115]. Одно исследование с использованием данных для детей в возрасте от 3 до 11 лет не выявило статистически значимой связи между ST и общим когнитивным функционированием с течением времени [201]. В двух других исследованиях сообщалось о различных результатах, как неблагоприятных, так и благоприятных, в зависимости от экранной деятельности, пола, этнической принадлежности и конкретных когнитивных задач [224, 225].В частности, одно исследование показало, что в возрасте от 6 до 12 лет девочки получают больше когнитивных преимуществ от использования компьютера, чем мальчики, а чернокожие дети получают больше пользы, чем белые дети [224]. Напротив, более активное участие в видеоиграх было связано с улучшением способности решать прикладные задачи для чернокожих девочек с течением времени, но было связано с уменьшением выполнения вербальных задач для девочек всех включенных этнических групп [224]. В течение 5-летнего периода более активное онлайн-общение и использование Интернета наносили ущерб словарному запасу и способностям к чтению у 10-18-летних в другом исследовании [225].Напротив, компьютерные игры были связаны с повышением показателей чтения и решения задач, особенно у девочек и детей из числа меньшинств [225]. Кроме того, более широкое использование компьютера для учебы было связано с повышением результатов тестов у девочек, но не у мальчиков в том же исследовании [225].

    Результаты также были противоречивыми в семи лонгитюдных исследованиях ST, оценивающих показатели плохого психического здоровья. При рассмотрении результатов, оцененных с помощью Опросника сильных и трудных сторон (SDQ), более частое использование компьютера в будние дни примерно в 4-летнем возрасте было связано с повышенным риском эмоциональных проблем у девочек в возрасте 6 лет, в то время как другие действия перед экраном не были связаны с баллами SDQ. со временем [205].В исследовании 14-летних только просмотр телевизора был связан с повышенными психологическими трудностями (общие баллы SDQ) в течение учебного года [113]. В двух дополнительных исследованиях, в которых оценивались дети в возрасте 5–7 лет [102] и 10–18 лет [192], сообщалось о различиях в лонгитюдном влиянии различных экранных действий на показатели SDQ. Исследование детей в возрасте 5–7 лет показало, что увеличение времени просмотра телевизора было связано с увеличением проблем с поведением, но использование электронных игр не было связано с какими-либо оценками SDQ с течением времени [102].С другой стороны, исследование 10-18-летних показало, что более активное использование компьютера и Интернета было связано с увеличением эмоциональных проблем, проблем в отношениях со сверстниками и общими трудностями с течением времени [192]. Эти исследования показывают, что различные экранные действия могут влиять на разные аспекты психологического функционирования детей и подростков на разных этапах жизни.

    При оценке общих психологических расстройств в одном исследовании сообщалось, что начальная ST в 13 лет не предсказывала изменения симптомов депрессии или тревоги и, наоборот, примерно до 20-летнего возраста [182].В исследовании с участием детей в возрасте 12–16 лет базовые видеоигры и использование компьютера не были связаны с повышенным уровнем депрессии в течение 1 года наблюдения, но более частое использование мобильных телефонов и просмотр телевизора были связаны [178].

    Смешанные результаты были также получены в пяти лонгитюдных исследованиях ST, в которых изучалась академическая успеваемость. В одном проспективном исследовании сообщалось, что у детей в возрасте 10–14 лет более высокий ST был связан с ухудшением успеваемости в школе в течение 2 лет [154]. В 4 исследованиях сообщалось, что на успеваемость по математике отрицательно влияют телевидение [181, 204], коммуникативная ST [184], использование ПК/Интернета [149] и общая ST [149].Показатели математических достижений не были связаны с использованием Интернета [184, 204], использованием видео/компьютерных игр [149, 181, 184], использованием мобильного телефона [149], текстовыми сообщениями, электронной почтой или обменом мгновенными сообщениями [184], телевидением/видео. время [149] или общее время ST [184] в тех же исследованиях. Напротив, в двух исследованиях сообщалось, что использование Интернета [204] и просмотр/просмотр телепередач или фильмов [184] были связаны с более высокими математическими достижениями. Эти исследования в основном касались подростков [149, 181, 184], а в одном исследовании участвовали дети в возрасте от 4 до 8 лет [204].Сроки наблюдения варьировали от 3 [181, 184] до 6 [149] лет.

    Сообщалось, что в отношении чтения и языковых предметов просмотр/потоковая передача телепередач или фильмов и серфинг в Интернете были связаны с более низкой успеваемостью старшеклассников старше 3 лет [184]. Другие занятия ЗП, такие как видео/компьютерные игры и ЗП, основанные на общении [184], а также время, проведенное в Интернете и на телевидении [204], не были связаны с чтением или языковыми достижениями учащихся начальных [204] или старших классов [184] с течением времени.

    При изучении ключевых переменных, используемых в анализе ST, в ряде исследований сообщалось о плохом сне [68, 72, 87, 169], сниженной физической активности [90, 118, 174, 203] и меньшем количестве личных социальных взаимодействий [67]. , 72, 197] были потенциальными посредниками между ST и рядом психологических последствий. Кроме того, в ряде исследований сообщается, что ассоциации различаются в зависимости от пола ребенка [80, 88, 99, 106, 115, 117, 119, 128, 130, 134, 141, 143, 155–157, 164, 170, 174]. , 177, 183, 190, 196, 205, 214, 220, 224, 225] и возраст [85, 93, 115, 186, 215, 223].Как показано на рис. 4, возраст и пол потенциально могут исказить ассоциации, поскольку они независимо влияют как на ST, так и на психологическое благополучие, в то время как переменные образа жизни считаются путями, посредством которых повышенный ST влияет на психологическое благополучие. Несмотря на эти доказательства, эти демографические переменные (возраст, пол) и образ жизни в целом контролировались (скорректировались) для анализа, а изучение посредничества или модификации эффекта было ограниченным. При простом контроле результаты будут отражать только один путь между ST и психологическим благополучием (как показано пунктирной линией на рис. 4).Это означает, что потенциальные механизмы и размеры эффекта отношений могут быть скрыты или уменьшены в литературе.

    3.3.2 ГТ-исследования.

    В этом систематическом предварительном обзоре было проведено десять исследований ГТ, которые позволили изучить причинно-следственные связи (в соответствии с критериями, изложенными в разделе 2.4) между ГТ и психологическими исходами. Пять из них были лонгитюдными исследованиями GT, которые давали представление и принимали во внимание исходные психологические профили. Остальные пять исследований имели экспериментальный или интервенционный компонент, а также эквивалентные группы сравнения.Ниже приводится краткое описание каждого исследования.

    Два лонгитюдных исследования изучали психологические эффекты природы в образовательном контексте. Проспективное лонгитюдное исследование 11-летних детей, включая группу сравнения с аналогичными исходными профилями, показало, что обучение на свежем воздухе в условиях леса было связано с более резким ежедневным снижением уровня кортизола (например, превосходные профили, свидетельствующие о снижении стресса) во всех возрастных группах. учебный год по сравнению с традиционными классами в помещении [28].Четырехлетнее продольное исследование маленьких детей показало, что посещение детского сада на природе (по сравнению с обычным детским садом) в возрасте 3 лет было связано с более низким уровнем невнимательности/гиперактивности в возрасте 4 и 6 лет. 208]. У детей, проводивших много времени на свежем воздухе в детских садах (по данным руководителей детских садов), также было меньше проблем с невнимательностью/гиперактивностью в возрасте 4, 5, 6 и 7 лет [208]. У этих детей с более высоким уровнем игр на свежем воздухе наблюдалось значительное снижение симптомов невнимательности/гиперактивности в возрасте 3–5 лет, сохраняющееся на низком уровне в возрасте 6 лет, но снова увеличивающееся, когда они пошли в школу в возрасте 7 лет.В том же исследовании дети с низким и высоким уровнем пребывания на открытом воздухе в детском саду не различались по результатам выполнения задания на объем пальцев в возрасте 3 лет; однако последняя группа демонстрировала стабильно более высокие результаты в возрасте 4–7 лет [208].

    Три дополнительных лонгитюдных исследования с упором на случайную ГТ способствовали установлению причинно-следственных связей посредством тщательного планирования и анализа. В проспективном когортном исследовании более высокий уровень зелени в детстве/подростковом возрасте был связан с более низкой частотой симптомов депрессии в более позднем возрасте [209].Стратифицированные модели показали, что эта связь была несколько сильнее у молодых людей с началом депрессии до 18 лет [209]. В другом исследовании жилые зеленые насаждения в возрасте 4–5 лет были связаны с благополучием в возрасте 12–13 лет [210]. Более высокий уровень благосостояния был связан с большим количеством зеленых насаждений; однако умеренное количество зеленых насаждений самого высокого качества оказалось наиболее полезным. Более высокое качество зеленых насаждений в ранние годы было связано с меньшими проблемами интернализации, но не проблемами экстернализации или общими трудностями в раннем подростковом возрасте. Кроме того, влияние возраста предполагает, что польза для благополучия от качества зеленых насаждений, по-видимому, усиливалась по мере взросления детей, в то время как польза для благополучия от количества зеленых насаждений, по-видимому, ослабевала в возрасте 10 лет. В лонгитюдном исследовании детей в возрасте 7–12 лет, проводившемся до и после перемещения, переход в новую домашнюю среду с повышенной естественностью был связан с увеличением способности направленного внимания после перемещения [219]. Изменение показателя естественности от прежней к новой домашней обстановке объясняло 19% дисперсии способности внимания после движения, помимо дисперсии, объясняемой способностью внимания до движения [219].

    Помимо исследований с лонгитюдным компонентом, в нескольких исследованиях с экспериментальным или интервенционным компонентом оценивались психологические эффекты естественного содержания в школьной среде, такого как комнатные растения [132] и зеленые виды в классе [187]. В исследовании, посвященном комнатным растениям, показатели успеваемости, беспокойства и благополучия не отличались между 13-летними в нерандомизированных классах контроля и вмешательства, которые получали комнатные растения в течение семестра [132]. Напротив, в рандомизированном контролируемом эксперименте с сопоставимыми группами на исходном уровне естественные виды из окна класса были связаны с повышенным восстановлением внимания и снятием стресса у старшеклассников [187].

    Помимо школьного двора, в одном исследовании изучались психологические эффекты ходьбы в естественных условиях по сравнению с городскими для детей [73]; контрольные группы не использовались в этом исследовании, так как участники выполнили оба условия исследования. После прогулки на природе у детей младшего возраста отмечалось усиление пространственной рабочей памяти, а у школьников — повышенное внимание по сравнению с городской прогулкой [73].В последнем исследовании почти не было выявлено различий в показателях самочувствия между старшеклассниками, участвовавшими в недельных приключенческих программах на свежем воздухе, и теми, кто этого не делал [175]. Несмотря на то, что они были квазиэкспериментальными, результаты считались надежными, поскольку использовались соответствующие контрольные группы [175].

    Несмотря на то, что в литературе по ГТ использовался более широкий спектр дизайнов исследований, в некоторых исследованиях были методологические недостатки, которые ограничивали выводы о причинно-следственных связях. Отсутствие контрольной группы в пре-пост исследованиях [62, 75, 76, 133, 147, 172, 173, 222], значительные исходные различия между группами [78, 108, 123, 145] и процедурные проблемы [78, 89]. , 221] были распространены во всех исследованиях.Например, образовательные эффекты и влияние на самочувствие школьников внеклассного образования могли быть недооценены в трех исследованиях, поскольку контрольные группы были либо «загрязнены» внеклассным образованием [78, 221], либо интервенционные школы имели заранее установленный интерес и использование образования вне классной комнаты [89]. Кроме того, потенциальные психологические эффекты мероприятий по озеленению школьного двора, возможно, были недооценены в двух исследованиях, поскольку учащиеся в школе с вмешательством в озеленение имели более высокие исходные исполнительные функции, чем учащиеся контрольной школы в одном исследовании [139], в то время как учащиеся вмешательства в другом исследовании сообщили, что им нравится их школьный двор. в большей степени на исходном уровне, чем у учащихся контрольных школ [108].В другом исследовании не сообщалось об отсутствии различий в оценках учащихся старших классов по показателям самооценки и настроения после просмотра сцен естественной среды и создания сцен окружающей среды на экране [161]. Учитывая технологически опосредованный опыт GT, представленный в этом исследовании, его было трудно сравнить с другими исследованиями, предлагающими полный сенсорный опыт GT.

    В исследованиях часто утверждалось, что ГТ связана с благоприятными психологическими последствиями в результате повышенной физической активности; однако в большинстве случаев это заявление официально не расследовалось.Только два исследования продемонстрировали, что связь между различными воздействиями ГТ и психологическими последствиями была опосредована физической активностью [42, 74], в то время как в двух других исследованиях сообщалось, что физическая активность не опосредовала связи между воздействием ГТ и психологическими последствиями [28, 85]. В относительно небольшом количестве исследований проводилась корректировка физической активности, когда это не казалось оправданным. Связь между превосходным когнитивным функционированием и более высоким GT была опосредована снижением загрязнения воздуха, связанного с дорожным движением, в одном исследовании [82].Как и в литературе по ST, было обнаружено, что связи между ГТ и психологическими исходами различаются в зависимости от пола ребенка [73, 77, 89, 173, 227] и возраста [73, 210], но во многих исследованиях эти переменные часто корректировались, а не учитывались. формируя основу для стратифицированного анализа или исследования взаимодействий.

    3.4 Изучение степени влияния ассоциаций на весь спектр социально-экономического статуса

    Нас особенно интересовало изучение влияния социально-экономического статуса (СЭС) на ассоциации между ST, GT и психологическими результатами (Цель 3).С одной стороны, как маркер доступа к материальным и общественным ресурсам и социальной поддержке, СЭС может спутать связи между высоким ST, низким GT и психологическим благополучием. Также возможно, что эти отношения могут различаться в зависимости от СЭС, что может иметь важные последствия для политики и социальной справедливости. Таким образом, при разработке исследований и статистического анализа необходимо уделять особое внимание роли СЭС. Пример того, как искажение SES может повлиять на результаты, было представлено в исследовании, в котором сообщалось, что принадлежность к группе с низким уровнем SES определяла как классификацию дошкольного учреждения ребенка как высококачественную или низкокачественную по категориям игровой среды на открытом воздухе, так и наличие у детей проблем с вниманием [95]. ].

    В целом дети и подростки с низким уровнем СЭС были недостаточно представлены во включенных исследованиях (см. файл S3 для показателей СЭС в каждом отдельном исследовании). Там, где в исследованиях сообщалось о различиях между участниками и неучастниками, участники с большей вероятностью имели более высокий уровень СЭС [99, 105, 117, 160, 207, 223]. Обычно сообщалось, что участники, выпавшие из-под наблюдения или исключенные из-за неполных данных, принадлежали к группе с низким уровнем СЭС, этническим меньшинствам или семьям с более низким уровнем образования, занятости и дохода [65, 101, 102, 119, 121, 128, 130]. , 131, 140, 154, 155, 171, 192, 202, 228, 234–237].В некоторых случаях были доступны данные, показывающие, что потерянные или исключенные участники также имели худшие психологические результаты, более низкие уровни физической активности, более высокие уровни ST и более низкие уровни GT [101, 105, 115, 130, 154–156, 192, 226, 235, 238]. Возможность набора и последующего наблюдения для лонгитудинальных исследований часто мотивирует использование выборок SES от среднего до высокого, при этом требуются как можно более полные данные высокого качества [239]. Это можно считать преимуществом для целей данного систематического предварительного обзора, поскольку оно ограничивает степень искажения результатов СЭС, учитывая относительное сходство психологических профилей среди молодежи со средним и высоким СЭС.Объяснить это можно тем, что связь между СЭС и психологическими последствиями не является линейной: существует крутой градиент между самой низкой и следующей категорией СЭС с точки зрения психологических проблем, но более плоский градиент между последующими приращениями СЭС [240, 241].

    С другой стороны, недостаточная представленность детей и подростков с низким уровнем СЭС в этой литературе означает, что данные для оценки возможных дифференциальных эффектов СЭС отсутствуют. Было проведено четыре исследования ST и пять исследований GT, в которых проводилось внутреннее сравнение детей и подростков с разным уровнем SES; они рассматриваются ниже.

    В целом, в этих четырех исследованиях высокие уровни ST, по-видимому, имели более сильную связь с плохими психологическими последствиями для детей и подростков с низким уровнем SES. Например, в одном исследовании сообщалось, что связь между высокими показателями ST и плохими результатами SDQ была наиболее сильной у детей из семей с низким доходом [215]. Точно так же, когда первичный анализ был стратифицирован по СЭС, неблагоприятные ассоциации между потреблением медиа и саморегуляцией были наиболее сильными для детей ясельного возраста из семей с низким СЭС [70].В другом исследовании большее количество просмотров телевизора было связано с более низкими результатами тестов по математике только для учащихся из второго нижнего квартиля SES [181]. В исследовании, проведенном в США, сообщалось о значительных СЭС и расовых различиях как в ST, так и в психологических исходах, что в некоторых случаях приводило к дифференциальной связи между ST и психологическими исходами с помощью SES [119].

    Сходные закономерности были обнаружены в пяти исследованиях ГТ, в которых проводилось внутреннее сравнение детей и подростков с разным уровнем СЭС, при этом связь между ГТ и психологическими последствиями оказалась наиболее сильной для детей и подростков с низким уровнем СЭС.Одно исследование показало, что высокий уровень СЭС защищает от развития эмоциональных проблем у маленьких детей в возрасте 3–5 лет [85]. В том же исследовании сообщалось, что при отсутствии социально-экономических преимуществ соседние зеленые насаждения могут защитить от развития эмоциональных проблем [85]. В частности, дети из неблагополучных семей с более высоким процентом зеленых насаждений в их районе имели меньше эмоциональных проблем в возрасте 3–5 лет по сравнению с детьми из неблагополучных семей в менее зеленых районах [85]. В другом исследовании сообщалось, что жизнь дальше от парка была связана с ухудшением психического здоровья детей в возрасте от 5 до 6 лет, чьи матери имели низкий уровень образования, но не детей, чьи матери имели более высокий уровень образования [203].

    Исследование, изучающее психологические эффекты обучения вне школьной программы, показало, что дети из более низких социальных слоев общества имели наибольшие улучшения в баллах SDQ, хотя этот результат не достиг статистической значимости, которую авторы приписали недостатку власти [78].Напротив, в другом исследовании время, проведенное в играх на свежем воздухе, было связано с более низкими оценками в школе и более высокими проблемами поведения у 10-12-летних детей с низким уровнем СЭС [242]. В этом исследовании сообщалось, что игры на свежем воздухе, как правило, отражали неструктурированную игру, когда они «на самом деле не занимались никакими делами, а просто слонялись без дела» [242]. При изучении связи между жилыми/школьными зелеными насаждениями и успеваемостью в одном последнем исследовании сообщалось, что стратификация по доходу домохозяйства не выявила каких-либо изменений эффекта [212]. Авторы исследования отметили, что семьи с низким доходом были недостаточно представлены в их аналитических выборках, что могло привести к недооценке ассоциаций. В целом, эти исследования показывают, что существует вероятность того, что высокий уровень ЗТ и недостаточный доступ или время, проведенное на природе, могут непропорционально сильно влиять на детей и подростков с низким уровнем СЭС. Эти результаты основаны на ограниченном количестве исследований и должны интерпретироваться с учетом этих ограничений.

    3.5 Описание взаимных эффектов ST и GT на психологические исходы

    ST и GT, по-видимому, по-разному связаны с психологическими последствиями; ST в основном связан с неблагоприятными психологическими последствиями, тогда как GT в основном связан с благоприятными психологическими последствиями.Сочетание высокого ST и низкого GT, наблюдаемое у современных детей и подростков, может быть особенно вредным для их психологического благополучия [19, 37]. Таким образом, важно учитывать взаимное влияние как ST, так и GT на психологические исходы детей и подростков (Цель 4).

    Четырнадцать исследований, указанных в этом систематическом обзорном обзоре, измеряли как ST, так и GT [234–238, 242–250]. Важно отметить, что в этих исследованиях не обязательно измерялись оба воздействия с целью определения влияния высокого ST и низкого GT на психологические исходы у детей и подростков, и не всегда было возможно определить взаимные эффекты обоих воздействий.По большей части эти исследования интересовались либо ST, либо GT, при этом альтернативное воздействие измерялось как вторичная переменная.

    Из 14 исследований два предоставили некоторое представление о связях между психологическими исходами и ST при наличии GT и наоборот. В одном предварительном исследовании [244] немецкие подростки приняли участие в 10-дневной программе приключений на свежем воздухе без доступа к технологиям. Они также сообщали о среднем ежедневном времени, которое они обычно тратили на различные экранные действия в свободное время.Исследование показало, что психологическая польза, полученная от программы приключений на свежем воздухе, сдерживалась уровнем типичного ежедневного времени, проводимого подростками перед экраном (высокий (>3 часов в день) или низкий/умеренный (≤3 часа в день)). Участие в программе приключений на свежем воздухе привело к улучшению психического здоровья по целому ряду параметров как у пользователей с низким/умеренным, так и с высоким уровнем ST, но размеры эффекта были больше у пользователей с высоким уровнем ST, что позволяет предположить, что они могли получить больше преимуществ от программы приключений на открытом воздухе.Также было значительное время группового взаимодействия для оценки удовлетворенности жизнью, при этом повышение удовлетворенности жизнью после программы приключений на свежем воздухе было значительно выше у подростков, которые регулярно занимались высокими уровнями ST. Это иллюстрирует потенциальные психологические преимущества GT, в частности, для пользователей с высоким ST [244].

    Рандомизированный эксперимент с подростками из Англии также позволил определить психологические последствия ST и GT [243]. Участники выполнили серию стрессовых задач, прежде чем их случайным образом распределили на открытом воздухе или в помещении, с другом или наедине с мобильным телефоном. После периода отдыха в назначенной им среде участники выполнили ряд когнитивных и эмоциональных измерений. Было обнаружено, что восстановление внимания и положительный эффект были выше у участников, которые отдыхали на открытом воздухе, по сравнению с теми, кто отдыхал в помещении. Кроме того, было обнаружено, что общение с другом более полезно, чем игра на мобильном телефоне. Самооценка внимательности снижалась быстрее при игре на мобильном телефоне по сравнению с игрой с другом, но это происходило только у подростков в помещении.Пребывание на открытом воздухе может в некоторой степени смягчать психологические последствия игры на мобильном телефоне, но для подтверждения этого необходимы дополнительные исследования [243].

    Три дополнительных исследования, измеряющих как ST, так и GT, позволили в некоторой степени изучить их взаимные эффекты. Одно исследование продемонстрировало психологические преимущества, предлагаемые прогулкой на свежем воздухе, помимо физической активности, для канадских подростков раннего возраста [236]. Респонденты опроса сообщили о времени, которое они проводили (а) за сидячими видеоиграми, (б) за активными видеоиграми и (в) за активными играми на свежем воздухе.Модели изовременной замены использовались для оценки того, будет ли замена времени, проведенного в сидячих видеоиграх и активных играх на свежем воздухе, активными видеоиграми, связана с изменениями в эмоциональных проблемах, просоциальном поведении и удовлетворенности жизнью. Исследование показало, что активные видеоигры связаны с лучшим психическим здоровьем, чем сидячие видеоигры, но активные игры на свежем воздухе превосходят активные видеоигры. Это дает некоторые ограниченные доказательства того, что связь между ST и психическим здоровьем выходит за рамки замены физической активности и что окружающая среда может оказывать уникальное положительное влияние на психическое здоровье.Другое исследование показало, что просмотр телепередач был обратно связан с подшкалой согласия в опроснике адаптивного социального поведения, в то время как время игры на свежем воздухе было положительно связано с тем же показателем (в той же модели) для детей в возрасте 2–5 лет [247]. Точно так же другое исследование показало, что просмотр телевизора по выходным был обратно пропорционален связанному со здоровьем качеству жизни детей в возрасте 9–11 лет, в то время как ряд показателей зеленых насаждений (таких как процент ландшафта и количество зеленых участков в пределах половины км детских домов) были положительно связаны с качеством жизни, связанным со здоровьем (в той же модели) [237].

    Планы анализа оставшихся девяти исследований не включали определение взаимных эффектов ST и GT на психологические исходы, и было невозможно исследовать это на основе результатов, представленных в этих исследованиях. В исследованиях либо оценивались эффекты воздействия в отдельных моделях [235, 250], с поправкой либо на ST [234, 245, 249], либо на GT [238, 246] в анализе, либо не сообщалось о соответствующих ассоциациях для определения реципрокных эффектов ST. и GT на психологические результаты [238, 242, 248].Это подчеркивает сложность понимания взаимных психологических эффектов ST и GT. Исследования, сообщающие о статистически значимых связях, как правило, обнаруживают, что независимые связи между ST или GT и психологическими исходами согласуются с более ранними выводами (разделы 3.2.1–3.2.4).

    Все ресурсы набора инструментов финансовой помощи | Федеральная помощь студентам

    Ресурсы ниже расположены в алфавитном порядке по названию.Чтобы найти ресурсы по типу ресурса, теме или аудитории, воспользуйтесь нашим инструментом фильтрации, который позволяет выполнять поиск среди наших инструментов и ресурсов финансовой помощи.


































    Поиск карьеры (Тип результата: Общий)
    Описание: Исследуйте потенциальные карьеры с помощью этого инструмента поиска карьеры с информацией о типичных обязанностях, необходимом образовании, средней зарплате и многом другом.
    Тип ресурса: Веб-ресурс или инструмент




    Оценочная карта колледжа (Тип результата: Общий)
    Описание: Учащиеся могут использовать этот интерактивный инструмент для поиска и сравнения колледжей с информацией о стоимости обучения в колледже, проценте выпускников и средней сумме, которую берут студенты.
    Тип ресурса: Веб-ресурс или инструмент














    Данные о завершении FAFSA (Тип результата: Общий)
    Описание: Консультанты могут использовать центр данных Федеральной помощи студентам для просмотра информации о завершении FAFSA в зависимости от средней школы, средней школы и штата.
    Тип ресурса: Веб-ресурс или инструмент


    Демонстрационный сайт FAFSA (Тип результата: Общий)
    Описание: Онлайн-инструмент для улучшения понимания консультантами fafsa.gov и для использования со студентами до того, как они подадут заявление. Заполните образец формы FAFSA или внесите исправления.
    Тип ресурса: Веб-ресурс или инструмент


























































































    Формула EFC, 2021–22 (Тип результата: PDF)
    Описание: Руководство, объясняющее ожидаемый семейный вклад (EFC), полученный в результате заполнения формы FAFSA. Рабочие листы формул EFC включены. [539 КБ]
    Тип ресурса: Практическое руководство

















    Границы | Цинк-зависимая протеаза AMZ-tk из термофильного археона — новый член семейства белков

    археметцинцина.

    Введение

    Большинство организмов обычно используют 2–4% своих генетических ресурсов для кодирования протеаз (EC 3.4.11-19/21-25/99), которые представляют собой один из наиболее распространенных классов ферментов и участвуют в широком спектре биологических процессов, включая прогрессирование клеточного цикла, передачу клеточных сигналов, пролиферацию и гибель, доставку белков и иммунный ответ. (Дэу и др., 2012; Ху и др., 2012). Протеазы различаются по таким свойствам, как субстратная специфичность, активный центр и каталитический механизм. Протеазы в широком смысле классифицируются как эндо- или экзоферменты на основании их места действия на белковые субстраты, а также на сериновые протеазы, аспарагиновые протеазы, цистеиновые протеазы или металлопротеазы на основе остатка или кофактора, необходимого для катализа (Rao и другие., 1998). Металлопротеазы содержат ион металла в своем активном центре, который действует как катализатор гидролиза пептидных связей. Большинству металлопротеаз требуется цинк (Zn 2+ ), но в активных центрах были обнаружены и другие переходные металлы, такие как кобальт (Co 2+ ) и марганец (Mn 2+ ) (Holmquist and Vallee, 1974; Häse). и Финкельштейн, 1993). Как правило, ионы металлов связаны в почти тетраэдрической конформации через три лиганда, которые различаются гистидином, глутаматом, аспартатом, лизином и аргинином.Четвертое координационное положение занимает лабильная молекула воды (Vallee, Auld, 1990). Среди металлопротеаз архемецинцин или архелизин (семейство MEROPS M54.001) является цинк-зависимой аминопептидазой, которая содержит консенсусную последовательность связывания цинка HExxHxxGx 3 Cx 4 CxMx 17 CxxC и консервативный остаток Met в активном состоянии. сайт. Археметцинцины, впервые идентифицированные у архей, также обнаруживаются у позвоночных, включая птиц, амфибий и рыб. У человека есть два члена, архемецинцин-1 и -2 (AMZ1 и AMZ2).AMZ1 в основном обнаруживается в печени и сердце, тогда как AMZ2 в основном экспрессируется в яичках и сердце; оба, как сообщается, разлагают синтетические субстраты и пептиды (Diaz-Perales et al., 2005). Предыдущий биоинформатический анализ не выявил ортологичных последовательностей у растений (Diaz-Perales et al., 2005). Однако по мере того, как стало доступно больше последовательностей генома, в растениях были идентифицированы архемецинцины; например, Pyrus bretschneideri (XP_009350639.1), который был аннотирован как неохарактеризованный белок (Wu et al., 2013).

    Протеазы являются одной из наиболее важных групп промышленных ферментов. Они представляют собой одну из трех крупнейших групп промышленных ферментов, на долю которых приходится примерно 60% общемировых продаж ферментов (Niehaus et al., 1999). Протеазы имеют широкий спектр применений, в основном в пищевой промышленности, кормах, извлечении металлов, моющих средств, обработке кожи, переработке отходов и химической промышленности, а также в медицинских целях. Протеазы также используются в фундаментальных исследованиях. Например, их свойство селективного расщепления пептидных связей используется для выяснения структурно-функциональных взаимосвязей (Rao et al., 1998).

    За последнее десятилетие Thermococcus kodakarensis KOD1, потенциальный промышленный источник ферментов, был преобразован в модельную систему для изучения молекулярных механизмов архей, что привело к значительному прогрессу в изучении метаболизма сахара (Guan et al., 2013; Han et al. al., 2013), синтез аминокислот (Rahman et al., 1998; Hiyama et al., 2014), транскрипция генов (Jager et al., 2014) и другие процессы (Jia et al., 2015). Хотя протеазы играют важную роль в клеточной жизни, только гомолог субтилизина из T.kodakarensis , KOD1 (Tk-SP), интенсивно изучается. Tk-SP сохраняет свою протеолитическую активность в присутствии неионных поверхностно-активных веществ и ЭДТА при 80°C (Foophow et al., 2010; Hirata et al., 2013). Tk-SP расщепляет аномальный прионовый белок, обладающий высокой устойчивостью к обычным процедурам стерилизации и протеолитическим ферментам (Koga et al., 2014). Большинство протеаз, предсказанных для T. kodakarensis KOD1, еще предстоит охарактеризовать как по их биохимическим свойствам, так и по их физиологическим функциям.В этом отчете мы клонировали и сверхэкспрессировали цинк-зависимую протеазу (Tk0512, аннотированную как пептидаза M54), которая является гомологом архемецинцина, из T. kodakarensis (названный AMZ-tk). Мы также биохимически охарактеризовали фермент и исследовали его ферментативные свойства.

    Материалы и методы

    Микроорганизмы и среды

    Thermococcus kodakarensis KOD1, любезно предоставленный Японской коллекцией микроорганизмов, Центр биоресурсов RIKEN, Япония, использовали для выделения геномной ДНК и культивировали в среде 280 Thermococcus (Fukui et al., 2005).

    Клонирование АМЗ-тк

    ПЦР с использованием геномной ДНК T. kodakarensis KOD1 в качестве матрицы была проведена для выделения AMZ-tk с использованием следующих олигонуклеотидных праймеров: прямой: 5′-CCG GAATTC ATG GAG TAC ATA GGC TTC ACA TAC G-3′ и реверс: 5′-CCG CTCGAG TTA ATC TTT CCC CTT GGT ATC TGC-3′ (подчеркнутые основания указывают сайты ферментов рестрикции для Eco RI и Xho I). Продукт ПЦР и вектор pET28-(a) расщепляли рестрикционными ферментами и лигировали.Конструкцию с N-концевой His-меткой трансформировали в клетки Escherichia coli BL21 (DE3) с помощью электропорации и подтверждали секвенированием.

    Экспрессия и очистка AMZ-tk

    Клетки Escherichia coli BL21 (DE3), содержащие плазмиду pET28a-AMZ-tk, культивировали в 2 л бульона LB, содержащего канамицин (30 мкг/мл -1 ), при 37°C в течение 3 часов. Когда OD 600 достигала 0,7, добавляли изопропил-β- D -тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 1 мМ для индуцирования экспрессии белка.После 4 ч культивирования при встряхивании клетки собирали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин при 4°С. Осадки клеток ресуспендировали в лизирующем буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 300 мМ NaCl, 20 мМ 2-меркаптоэтанол и 20 мМ имидазол. Суспензию клеток обрабатывали ультразвуком и нагревали при 65°С в течение 1 часа. Термостабильные компоненты супернатанта собирали после центрифугирования и наносили на колонку Ni-NTA. После промывки колонки буфером для лизиса AMZ-tk элюировали градиентом имидазола (50–250 мМ).Очищенный AMZ-tk визуализировали после разделения с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с 12% додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). После диализа с 50 мМ трис-HCl-буфером (pH 8,0), содержащим 300 мМ NaCl и 20 мМ 2-меркаптоэтанола, для удаления любого иона металла очищенные белки хранили при -80°C. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда с использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Bradford, 1976).

    Для одноаминокислотного мутанта использовали следующие праймеры: h282D, прямой праймер, 5′-GGC ATG CTC GAC GAG ATT GGG; обратный праймер, 5′-CCC AAT CTC GTC GAG CAT GCC; h286D, прямой праймер, 5′-GAG ATT GGG GAC TCT TTC GGG; обратный праймер, 5′-CCC GAA AGA GTC CCC AAT CTC; h292D, прямой праймер, 5′-GGG CTG GAA GAC TGT CCC AAC, обратный праймер, 5′-GTT GGG ACA GTC TTC CAG CCC; E183Q, прямой праймер, 5′-ATG CTC CAC CAA ATT GGG CAC; обратный праймер, 5′-GTG CCC AAT TTG GTG GAG CAT.ПЦР проводили с использованием полимеразы Pfu, параметры циклирования: 95°С в течение 5 мин (один цикл), 95°С в течение 30 с и 68°С в течение 12 мин (12 циклов). После амплификации смесь ПЦР расщепляли Dpn I и затем электропорацией трансформировали в E. coli BL21(DE3). Мутанты были подтверждены секвенированием ДНК. Мутантные белки очищали с использованием того же метода, что и для очистки дикого типа.

    Анализы активности протеаз

    Протеолитическую активность очищенных белков определяли с использованием казеина в качестве субстрата.Реакционный объем 500 мкл готовили в микроцентрифужной пробирке, содержащей очищенный AMZ-tk (25 мкг) и казеин (325 мкг), растворенные в 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), содержащем 300 мМ NaCl и 0,8 мМ Zn 2+. или указанное количество ионов других металлов. После инкубации при 55°С в течение 30 мин реакцию останавливали добавлением 50 мкл 50%-ной трихлоруксусной кислоты для осаждения непрореагировавших субстратов. После удаления осадка центрифугированием (12000 g , 10 мин) ферментативные продукты в супернатанте определяли количественно при 280 нм с помощью спектрофотометра УФ-видимого диапазона (Shimadzu, Япония).Удельную активность фермента (ед.мг -1·мин -1) выражали как количество фермента, необходимое для получения 1 мкМ тирозина в условиях анализа.

    Влияние pH на активность AMZ-tk определяли по протоколу, описанному выше, за исключением замены буфера Tris-HCl на 50 мМ ацетата натрия (pH 3,0–5,0), 50 мМ MES (pH 5,0–7,5), 50 мМ HEPES (рН 8,0–8,5) или 50 мМ глицина (рН 9,0–10,0). Все анализы проводились при оптимальной температуре.Для определения влияния температуры на ферментативную активность образцы инкубировали при температуре от 30 до 80°С в течение 30 мин. Термостабильность исследовали после инкубации образцов при различных температурах при оптимальном рН. Через различные промежутки времени образцы отбирали и измеряли ферментативную активность.

    Влияние различных ионов металлов, ЭДТА и других химических веществ на гидролитическую активность AMZ-tk определяли путем измерения активности в отношении казеина и флуорогенного субстрата (MCA-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-DNP-Dpa-Ala). -Arg-Nh3, FS-6) (Sigma, США) (Neumann et al., 2004). Казеин и АМЗ-тк инкубировали при 55°С в течение 30 мин в присутствии указанного количества реагентов. Активность по отношению к казеину определяли, используя спектрофотометрический метод, описанный выше, или протеолиз определяли с помощью 12% SDS-PAGE. Для протеолитического расщепления FS-6 3,75 ЕД AMZ-tk и 0,5 мкМ FS-6 инкубировали при 55°C в течение 5 мин в присутствии указанного количества реагентов. Активность контролировали на флуоресцентном спектрофотометре (Agilent, США) с возбуждением и эмиссией флуоресценции при 328 и 393 нм соответственно.

    Метод

    SDS-PAGE использовали для обнаружения саморасщепления AMZ-tk. 15 ед.мл -1 очищенного AMZ-tk инкубировали с различными ионами металлов и ЭДТА при 55°C в течение 30 мин. Смеси были обнаружены с помощью 12% SDS-PAGE, а плотность полос была дополнительно проанализирована с помощью ImageJ (Schneider et al., 2012).

    Для кинетических исследований начальные скорости ферментативных реакций изучали путем изменения концентрации казеина (от 0,4 до 60 мг/мл -1 ) в оптимальных условиях. Кажущееся значение постоянной Михаэлиса ( K m ) и максимальная скорость ( V max ) были получены путем математических расчетов с помощью программы Origin pro (8.0) программное обеспечение. Все данные об активности были определены в трех отдельных экспериментах с не менее чем тремя техническими повторами.

    Влияние детергентов на стабильность АМЗ-тк

    Пригодность фермента в качестве моющей добавки была определена путем изучения его стабильности в присутствии 2% поверхностно-активных веществ, таких как додецилсульфат натрия (SDS), Triton X-100, Tween 80 и некоторых коммерческих моющих средств для стирки (OMO, Liby, Ariel). , Wheel и Surf Excel). Эндогенные ферменты в коммерческих детергентах инактивировали нагреванием разбавленных детергентов в течение 30 мин при 100°C перед добавлением фермента AMZ-tk.AMZ-tk инкубировали с этими добавками в течение 60 мин при 37°C, а затем определяли остаточную активность фермента в оптимальных условиях анализа. Каждый эксперимент был протестирован в трехкратной повторности с не менее чем тремя техническими повторами.

    Антибактериальная активность АМЗ-тк

    Антибактериальную активность измеряли с помощью жидкостного анализа ингибирования роста, проводимого в 96-луночных титрационных микропланшетах (Tsuji et al., 1998). Очищенный АМЗ-тк с конечной концентрацией 3,75 ед.мл -1 добавляли к 100 мкл логарифмической фазы культуры тестируемых бактерий, разведенной до 10 4 колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл в 300 мМ NaCl. , 0.8 мМ ZnCl 2 , рН 7,5. Контрольные лунки засевают тем же объемом солевого раствора. Микробный рост измеряли как увеличение оптической плотности при 600 нм (OD 600 ) с помощью устройства для считывания микропланшетов (MRX, Dynex, США) после инкубации при 25°C в течение 12 часов. Антибактериальную специфичность AMZ-tk оценивали путем добавления 10 мкл протеазы с конечными концентрациями в диапазоне 0,75–15 ЕД/мл -1 . Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) выражены в виде интервалов концентраций: [а]–[б]; где [a] — это самая высокая проверенная концентрация, при которой бактерии растут, а [b] — самая низкая концентрация, вызывающая 100% ингибирование роста (без изменений в OD 600 ) (Rai and Mukherjee, 2009).Каждый эксперимент был протестирован в трехкратной повторности с не менее чем тремя техническими повторами.

    Количественная обратная транскрипция-ПЦР (RT-qPCR)

    Культуры T. kodakarensis KOD1 проводили в трех повторностях в культурах по 40 мл в 50-мл флаконах с сывороткой при 85°C в анаэробных условиях в инкубаторе со встряхиванием (150 об/мин). Клетки в среднелогарифмической фазе шокировали воздействием при 45, 55, 65, 75, 85, 95°С и инкубацией в течение 1 ч (Jia et al., 2015). Клетки собирали и получали РНК с реагентом TRIzol (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США).Для обеспечения полного удаления любой загрязняющей ДНК все препараты РНК обрабатывали ДНКазой (Thermo Scientific Fermentas, Германия). РНК определяли количественно на спектрофотометре, кДНК синтезировали с помощью системы синтеза кДНК Universal RiboClone (Promega, США) в соответствии с протоколами производителя. Продукты реакции серийно разбавляли, чтобы найти адекватную концентрацию для ПЦР-анализа в реальном времени с использованием следующих праймеров: 5′-GTA TCC GAA AGG GTT GAG GA-3′ и 5′-CCT TCT GGT GTT TCA AGG GT-3′.ПЦР в реальном времени проводили в системе CFX96 Real-Time PCR System (Bio-Rad, США) с использованием SYBR Green PCR Master Mix (Toyobo, Япония). Относительные изменения кратности определяли по пороговым значениям цикла (C T ). с использованием метода ΔΔC T . Реакции для определения уровней 16S рРНК (TKr05) использовали для нормализации между различными образцами, которые амплифицировали с праймерами: 5′-GTC CTG GCT GTA AAG GAT GC-3′ и 5′ -CCG CCA ATT CCT TTA AGT TT-3′ Эксперименты были проанализированы в трех независимых анализах, по крайней мере, с тремя техническими повторами, включенными в каждую ПЦР для обеспечения воспроизводимости.

    Анализ биоинформатики

    Множественное выравнивание белковых последовательностей выполняли с использованием программы ClustalW (версия 2) (Larkin et al., 2007). Филогенетические деревья без корней были построены с помощью MEGA 5.0 с использованием методов Neighbour-Joining (NJ), Minimal Evolution (ME) и Maximum Parsimony (MP) и теста начальной загрузки, выполненного с 1000 итераций (Tamura et al., 2011). Взаимодействия белок-белок были предсказаны с использованием набора STRING с высокой достоверностью (Franceschini et al., 2013), а Cytoscape использовался для визуализации сети (Shannon et al., 2003). Функция белка была предсказана с помощью BLAST (Altschul et al., 1997), SMART (Letunic et al., 2015) и I-TASSER (Zhang, 2008).

    Трехмерная структура AMZ-tk была смоделирована с использованием программного обеспечения I-TASSER (Zhang, 2008) с использованием в качестве шаблона кристаллической структуры архемеццина из Methanopyrus Kandleri (код PDB: 2X7M). Ионы цинка стыковались с АМЗ-тк с помощью Autodock Vina версии 1.1.2 (Тротт и Олсон, 2010 г.). Для стыковки Vina использовались параметры по умолчанию, как описано в руководстве Autodock Vina. Поза, получившая наивысшее место по оценке стыковки Vina, подвергалась визуальному анализу с использованием программного обеспечения PyMOL 1.7 (www.pymol.org).

    Статистический анализ

    Все данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (SD). Анализ данных проводили с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием программного обеспечения EXCEL. ANOVA использовали для определения статистически значимых различий.Если вероятность была меньше 0,05, а именно р < 0,05.

    Результаты

    Биоинформатический анализ АМЗ-тк

    AMZ-tk был аннотирован как цинк-зависимая протеаза в исходном отчете о геноме (Fukui et al., 2005). Поиск последовательности с помощью NCBI BLAST-P выявил наиболее значительную гомологию (64–35% идентичности) в семействе архей Thermococcaceae , включая Palaeococcus , Pyrococcus и Thermococcus (дополнительный рисунок S1).Следуя белкам семейства Thermococcaceae , AMZ-tk также подобен архемеццинам других организмов, таким как два архемеццина человека и TK1178 T. kodakarensis KOD1, который был аннотирован как архемеццин. Чтобы изучить эволюционную связь AMZ-tk и других аннотированных археметцинцинов, с помощью программы MEGA5 было построено филогенетическое дерево с использованием данных аминокислотной последовательности для архемецинцина из животных, растений, грибов, бактерий и архей (рис. 1А).Номер доступа этих белков указан в дополнительной таблице S1 в дополнительном материале. Хотя значения бутстрапа были несколько низкими из-за большого количества последовательностей, более значительные значения бутстрапа в дистальных ветвях позволили сделать вывод, что белки сходных видов произошли от общего предка, а AMZ-tk ближе к археям, чем к бактериям. и эукарии. Более того, положение белков на дендрограмме не зависит от методов филогенетической реконструкции (данные не показаны).Эти результаты кластеризации позволяют предположить, что AMZ-tk является новым архемеццином, который тесно связан с некоторыми белками архей.

    РИСУНОК 1. Филогенетический, последовательность и структурный анализ AMZ-tk и других архемецинцинов. (A) Филогенетическое дерево с соединением соседей без корней для 50 археметцинцинов архей, бактерий и эукариот (различные цвета), созданное с использованием MEGA5. Показано оптимальное дерево с суммой длин ветвей = 13,47550492. Рядом с ветвями показан процент повторяющихся деревьев, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (1000 повторений). (B) Выравнивание последовательностей консервативного цинксвязывающего мотива AMZ-tk и других гомологов. Консервативное цинково-связывающее мотива архемеццина из Archaea (TK0512 (AMZ-TK), YP_182925.1; TK1178, YP_183591.1; Methanopyrus Kandleri , WP_011018918.1; Archaeoglobus Fulgidus , WP_010877837.1), Бактерии ( Flavobacterium chungangense , WP_031453746.1), грибы ( Aspergillus flavus , XP_002379891.1), растения ( Pyrus bretschneideri , XP_009350639.1), а животные ( Homo sapiens , NP_001275985.1) были выровнены ClustalW. Уровень консервации каждого остатка указывается высотой столбцов над каждым остатком. Логотип последовательности был создан с помощью WebLogo (http://weblogo.berkeley.edu/). (C) Моделирование гомологии AMZ-tk. Структура была получена путем гомологического моделирования с использованием архемецинцина из M. Kandleri (код PDB: 2X7M) в качестве матрицы. ( а ) Общая структура (слева) и цинксвязывающие остатки (справа) в архемеццине из М.Кандлери . (b) Трехмерная модельная структура (слева) и цинксвязывающие остатки (справа) в AMZ-tk.

    Для дополнительной проверки того, что AMZ-tk представляет собой архемецинцин, выравнивание последовательностей с помощью ClustalW было выполнено с использованием репрезентативных последовательностей архей, бактерий и эукариот. Результаты показывают, что аминокислотная последовательность AMZ-tk идентична только на 21,74% с TK1178 в T. kodakarensis KOD1. Идентичность последовательностей гомологам из M. kandleri, Archaeoglobus fulgidus , Penicillium expansum и Homo sapiens также низкая (20.79, 18,75, 13,04 и 14,35% соответственно). Однако AMZ-tk и другие архемецинцины обладают высококонсервативным мотивом HExxHxxGx 3 Cx 4 CxMx 17 CxxC с консервативным остатком глутамата в качестве каталитического основания, которые являются основными характеристиками белков семейства архемецинцинов (рис. 1В). В мотиве HExxHxxGxxH с тремя остатками гистидина координирует первый ион Zn 2+ (Waltersperger et al., 2010). Второй ион цинка связан с четырьмя цистеинами, что напоминает мотив цинкового пальца.Существует также консервативный метионин, который структурно поддерживает активный сайт (Waltersperger et al., 2010; Graef et al., 2012).

    Для дальнейшего подтверждения наличия консервативных структурных мотивов трехмерная структура AMZ-tk была предсказана методами гомологического моделирования с использованием в качестве матрицы археметцинцина из M. Kandleri (код PDB: 2X7M) (Salamone et al., 2015). Предсказанная трехмерная структура (рис. 1C) показала, что С-конец AMZ-tk для связывания ионов Zn 2+ является более консервативным по структуре.А N-конец AMZ-tk предпочитает образовывать петлевую структуру. Остатки, связывающие ионы Zn 2+ , абсолютно консервативны. В структуре архемецинцина из M. Kandleri первый ион Zn 2+ хелатирован с остатками His125, His129 и His135, тогда как другое хелатирование наблюдается между Zn 2+ и остатками Cys136, Cys141, Cys160, и Цис163. В AMZ-tk хелатирование наблюдается между первым Zn 2+ и остатками His182, His186 и His192, тогда как второй Zn 2+ хелатируется с остатками Cys193, Cys197, Cys216 и Cys219.

    Экспрессия и очистка AMZ-tk из

    E. coli

    Чтобы изучить функцию AMZ-tk, мы сначала экспрессировали ген с помощью индукции IPTG в бактериальной системе (рис. 2). Как показано на дорожке 3, после индукции IPTG была обнаружена полоса белка с молекулярной массой приблизительно 28 кДа, что соответствовало предсказанной молекулярной массе (27,6 кДа) AMZ-tk. После культивирования клеток E. coli ресуспендировали в требуемом буфере и обрабатывали ультразвуком. После центрифугирования рекомбинантный AMZ-tk был эффективно очищен с помощью аффинной хроматографии Ni-NTA, которая дала одну полосу в геле SDS-PAGE (рис. 2).

    РИСУНОК 2. Экспрессия и очистка AMZ-tk из Escherichia coli . Дорожка М, белковый маркер; стандарты молекулярной массы указаны слева. Дорожка 1, экстракт неочищенного белка из неиндуцированных клеток; Дорожка 2, экстракт неочищенного белка из IPTG-индуцированных клеток; Дорожка 3, растворимый экстракт клеток, индуцированных IPTG, после нагревания при 70°C в течение 1 ч; Дорожка 4, несвязанные белки, элюированные с колонки Ni-NTA; дорожка 5, белки, элюированные 20 мМ имидазолом; Дорожка 6, белки, элюированные 300 мМ имидазолом.

    Ферментативная характеристика AMZ-tk

    Результаты анализа последовательности показали, что AMZ-tk представляет собой архемецинцин. Для выяснения его характеристик была проведена серия анализов активности фермента. Во-первых, активность оценивали в присутствии различных двухвалентных ионов, что является одним из многих внешних факторов, влияющих на каталитическую активность этих ферментов (Shivanand and Jayaraman, 2011). AMZ-tk обладал протеолитической активностью в присутствии Zn 2+ , Ca 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ , Ba 2+ и Ni 2+ на основе казеина-84. спектрофотометрические анализы; добавление Zn 2+ вызывало наибольшую активность.ЭДТА, хелатор металлов, вызывает значительное снижение активности. Аналогичный результат был показан при использовании в качестве субстрата флуоресцентного пептида (табл. 1). Затем мы исследовали способность AMZ-tk протеолизировать казеин с помощью SDS-PAGE (рис. 3А). Когда казеин инкубировали с AMZ-tk в присутствии Zn 2+ , его концентрация резко снижалась. Аналогичное снижение наблюдалось и в присутствии других двухвалентных ионов. Эти результаты позволяют предположить, что очищенная протеаза представляет собой протеазу металлов, что согласуется с анализом последовательности.Интересно, что в SDS-PAGE не было видно продуктов деградации, даже БСА использовался в качестве субстрата (данные не показаны). Мы предполагаем, что, возможно, продукты слишком малы, чтобы их можно было обнаружить в SDS-PAGE. Между тем, мы постоянно наблюдали заметное снижение количества AMZ-tk независимо от присутствия или отсутствия казеина. Добавление хелатора было необходимо для предотвращения самодеградации AMZ-tk (рис. 3B). Кроме того, не было обнаружено саморазложения при температуре реакции ниже 40°С (данные не представлены).Таким образом, AMZ-tk не только способен расщеплять другие белки-субстраты, но также проявляет активность саморасщепления.

    ТАБЛИЦА 1. Влияние различных ионов металлов и ингибиторов протеазы (с 0,8 мМ ZnCl 2 ) на активность AMZ-tk.

    РИСУНОК 3. Деградация казеина с помощью AMZ-tk и активность саморасщепления очищенного AMZ-tk проанализированы с помощью SDS-PAGE. (A) Разложение казеина под действием AMZ-tk. Очищенный AMZ-tk инкубировали с казеином при 55°С в присутствии О.08 мМ двухвалентных ионов или 5 мМ ЭДТА в течение 30 мин. В качестве контроля использовали только казеин. Образцы анализировали с использованием 12% SDS-PAGE и окрашивания кумасси бриллиантовым синим. (Б) Саморасщепление очищенного АМЗ-тк. Очищенный AMZ-tk инкубировали при 55°С в присутствии 0,08 мМ двухвалентных ионов или 5 мМ ЭДТА в течение 30 мин. В качестве контроля использовали свежий очищенный белок. Образцы анализировали с использованием 12% SDS-PAGE и окрашивания кумасси бриллиантовым синим. На верхней панели показана плотность белковых полос. р < 0.05 по сравнению со свежим очищенным белком.

    Для изучения влияния pH протеазную активность очищенного фермента исследовали при значениях pH от 6,0 до 11,0 с использованием казеина в качестве субстрата при температуре анализа 55°C. Профиль pH очищенного AMZ-tk показан на рисунке 4A. Фермент был наиболее активен при значениях рН 7,0–10,0 с максимальной активностью при рН 8,0–9,0. Активность протеазы составляла примерно 50% от максимальной активности при анализе при рН 10,0 и значительно снижалась ниже рН 7.0. Замечательная активность при pH выше 7,0 указывает на сильнощелочную природу этой протеазы, что делает ее пригодной для применения в щелочной среде.

    РИСУНОК 4. Анализ активности фермента AMZ-tk. (A) Оптимальный pH AMZ-tk. В этом анализе использовали разные буферы для растворов с разным pH. Буфер MES использовали при pH 5,0–7,5; Буфер HEPES использовали для pH 8 и 8,5; глициновый буфер использовали для рН 9,0 и 10,0; и буфер Na 2 HPO 4 использовали для pH 11.0. Значения, полученные при рН 8,5, принимали за 100%. (Б) Оптимальная температура АМЗ-тк. Значения, полученные при 55°С, принимали за 100%. (C) После инактивации AMZ-tk при 70°C (закрашенные ромбы) и при 80°C (закрашенные квадраты) в течение 1–4 ч активность фермента определяли при 55°C, как описано в разделе « Материалы и методы.» (D) Влияние концентрации субстрата на скорость AMZ-tk. Анализы проводили, как описано в разделе «Материалы и методы». (E) Относительная активность AMZ-tk, h282D, h286D, h292D и E183Q дикого типа с казеином в качестве субстрата.В нижней части показаны соответствующие белки, определенные с помощью SDS-PAGE. Приведенные здесь параметры являются средними значениями трех определений. ∗∗ p < 0,01 по сравнению с AMZ-tk дикого типа.

    В экспериментах по температурной активности протеазную активность AMZ-tk измеряли при температуре от 30°C до 80°C при постоянном pH 7,5. Результаты показали, что оптимальная температура для фермента составляет 55°C (рис. 4В). В оптимальных каталитических условиях AMZ-tk может разлагать казеин с удельной активностью 74.7 ЕД мг -1 ( n = 12). Сравнение каталитических свойств AMZ-tk и термофильных протеаз из других организмов показано в дополнительной таблице S2.

    Термостабильность протеазы исследовали путем измерения остаточной активности при 55°С после инкубации фермента без Zn 2+ при 70 и 80°С в течение 1–4 ч. При 70°С фермент сохранял практически полную активность через 4 ч инкубации. При 80°C 30% исходной активности было потеряно через 4 часа инкубации (рис. 4C).Эти результаты предполагают, что AMZ-tk является термостабильным, что является одной из хороших характеристик протеазы.

    Кинетику рекомбинантного AMZ-tk анализировали с использованием казеина в качестве субстрата путем изменения его концентрации. Уравнение Михаэлиса-Ментен было использовано для расчета кинетических параметров (рис. 4D). Казеин, катализируемый AMZ-tk, с кажущейся K m = 4,4 ± 0,2 мг/мл -1 и V max = 90,4 ± 3,2 U мг -1 (n

  • 4).

    Для проверки функции предсказанных активных аминокислотных остатков в анализе последовательности три точечных мутанта в сайте связывания цинка (h282D, h286D и h292D) и один мутант в каталитическом основании (E183Q) были очищены с использованием тех же методов, что и для дикого -типа АМЗ-тк (рис. 4Е). Гидролизующая активность по отношению к казеину у точечных мутантов в сайте связывания цинка (h282D, h286D и h292D) составляла примерно 20% от активности AMZ-tk дикого типа. Обнаруживаемая активность мутанта с одной аминокислотой может быть вызвана тем, что мутант все еще может связывать Zn 2+ , но не так эффективно, как белок дикого типа.Мутант E183Q проявлял минимальную ферментативную активность, что указывает на то, что связывание цинка и каталитическое основание являются важными остатками в AMZ-tk.

    Для определения природы AMZ-tk было исследовано влияние различных ингибиторов ферментов, таких как хелатирующий агент и реагент специфической группы, на активность фермента (таблица 1). Ингибитор цистеиновой протеазы [5,5-дитиобис (2-нитробензойная кислота), DTNB] и ингибитор сериновой протеазы (фенилметилсульфонилфторид, PMSF) не влияли на активность очищенного фермента.Однако фермент полностью ингибировался ингибиторами металлоферментов ЭДТА и ЭГТА, что указывает на принадлежность ферментов к семейству металлопротеаз.

    Совместимость с моющими средствами АМЗ-тк

    Для проверки совместимости и стабильности AMZ-tk по отношению к детергентам ферменты предварительно инкубировали в присутствии различных лабораторных или коммерческих стиральных порошков при 37°C в течение 1 ч (табл. 2). Примечательно, что AMZ-tk сохранял активность >50% в присутствии 2% лабораторных поверхностно-активных веществ (SDS и Triton).Кроме того, АМЗ-тк показал более высокую стабильность в коммерческих стиральных порошках. Фермент сохранил 88% своей начальной активности с Ariel, за ним следовали Wheel, OMO, Liby, Surf excel и Tide (70–65%). Полученные результаты ясно показали, что AMZ-tk подходит для различных промышленных применений, исходя из характеристик ферментов в моющих средствах.

    ТАБЛИЦА 2. Влияние различных детергентов на активность АМЗ-тк.

    Антибактериальная активность АМЗ-тк

    Мы изучили антибактериальную активность и специфичность протеазы AMZ-tk, оценив ингибирование роста различных микроорганизмов (таблица 3).Протеаза ингибировала рост как грамотрицательных бактерий ( е. Coli , Yersinia EnterOcolitica и Klebesilla Pneumoniae ) и Klebesilla Pneumoniae ) и граммоположительные бактерии ( Staphylococcus aureus , Bacillus Cereus и Listeria Monocytogenes ), как показано в таблице 3. И AMZ-tk показал значительно более высокое ингибирование роста грамположительных бактерий, чем у грамотрицательных бактерий. Значение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) для грамотрицательных бактерий также было выше, чем для грамположительных бактерий в наших условиях анализа, что позволяет предположить, что грамположительные бактерии очень чувствительны к этому ферменту.

    ТАБЛИЦА 3. Антимикробная активность и специфичность протеазы AMZ-tk.

    Экспрессия гена

    AMZ-tk

    Поскольку AMZ-tk показал оптимальную температуру при 55°C, что ниже оптимальной температуры роста T. kodakarensis KOD1 (85°C), уровень экспрессии гена был изучен с помощью RT-PCR для изучения физиологической роли AMZ. -тк. РНК выделяли из клеток T. kodakarensis KOD1 при температуре 45–95°С.Относительные паттерны экспрессии AMZ-tk при различных температурах (45–95°C) показаны на рис. 5. Самый низкий уровень транскрипции наблюдается при 95°C, что выше оптимальной температуры роста. С понижением температуры уровень экспрессии увеличивался и достигал максимального уровня транскрипции при 65°С. Затем уровень транскрипции несколько снижался при 45°C и 55°C. Следовательно, физиологическая функция AMZ-tk , по-видимому, связана с адаптацией к холоду.

    РИСУНОК 5. Уровень экспрессии гена AMZ-tk при различных температурах. Относительное количество мРНК AMZ-tk из клеток T. kodakaraensis KOD1, обработанных при разных температурах, измеряли с помощью RT-qPCR и выражали как кратную разницу от значения для клеток, растущих при 85°C, которое принимали как 1. Столбики погрешностей указывают стандартные отклонения от трех независимых экспериментов. р < 0.05 и ∗∗ р < 0,01 по сравнению с уровнем экспрессии АМЗ-тк при 85°С.

    Обсуждение

    Анализ последовательности AMZ-tk позволил предположить, что белок содержит активный центр архемеццина и является протеазой металла. Однако прямых доказательств его протеолитической активности не было. В этой работе мы очистили и охарактеризовали AMZ-tk для решения этой проблемы. Очищенная протеаза была способна расщеплять казеин и проявляла активность саморасщепления.Эти реакции зависели от присутствия цинка и ингибировались ЭДТА. Эти результаты показали, что AMZ-tk представляет собой металлопротеазу цинка. Активность очищенного фермента была выше при щелочном рН. АМЗ-тк был термостабилен при 80°С, хотя его оптимальная каталитическая температура составляла 55°С.

    Хотя наше понимание каталитических механизмов архемецинцина улучшается, многие его физиологические роли остаются неизвестными (Waltersperger et al., 2010). AMZ-tk показал оптимальную каталитическую температуру при 55°C, что ниже оптимальной температуры роста клетки.Некоторые белки термофильных архей также показали оптимальные низкотемпературные каталитические характеристики, такие как циклодекстриназа из T. kodakarensis (Sun et al., 2015). Кроме того, уровень транскрипции AMZ-tk также увеличивался при низкой температуре. Используя эти результаты, мы предполагаем, что AMZ-tk может функционировать в «холодных» условиях. С другой стороны, два архемецинцина в T. kodakarensis KOD1 (AMZ-tk и TK1178) содержат один и тот же мотив связывания цинка, предсказание белок-белкового взаимодействия (оценка> 80%) указывает на то, что AMZ-tk и TK1178 могут взаимодействовать. с разными белками (дополнительная фигура S2).AMZ-tk может взаимодействовать с детоксицирующими белками, в то время как TK1178 может регулировать метаболизм ДНК. Оба они могут взаимодействовать с N -ацетилтрансферазой и лейцил-тРНК-синтетазой. Таким образом, AMZ-tk и TK1178 могут играть разные физиологические роли.

    Эволюция архемецинцинов также сложна. Например, архемецинцин из растений находится в одном кластере с белками грибов, а архемецинцин из термофильных бактерий ( Dictyoglomus thermophilum ) более тесно связан с белками из архей (рис. 1).У T. kodakarensis KOD1 и других Thermococcaceae имеется два архемецинцина, что объясняется дупликацией генов (Diaz-Perales et al., 2005). Однако дупликации генов в геноме T. kodakaraensis редки, и дублированные гены всегда имеют высокую идентичность. Например, TK0298, TK0495 и TK0850 идентичны на 87–90% на уровне аминокислот (Fukui et al., 2005). Однако AMZ-tk и TK1178 показали только 20% идентичности последовательностей. Согласно филогенетическому анализу, AMZ-tk более тесно связан с белками из класса Haloarchaea , а TK1178 находится в кластере белков из Archaeoglobi .Основываясь на анализе последовательности, ожидается, что появление AMZ-tk у T. kodakarensis KOD1 возникло не только в результате дупликации гена, но и в результате латерального переноса гена.

    Многие промышленные микробные протеазы представляют собой металлопротеазы, такие как Thermoase PC10F (Amano Enzyme Inc., Япония) и Neutrase (Novo Nordisk, Дания), которые широко используются в пищевой, медицинской, пивоваренной, кожевенной, пленочной и хлебопекарной промышленности ( Ву и Чен, 2011). Также сообщалось о ряде термостабильных металлопротеаз из Vibrio , Sulfolobus , Bacillus и Thermomicrobium (Murao et al., 1991; Коломбо и др., 1992; Фукуда и др., 1998 г.; Акел и др., 2012). Сравнение этих ферментов показано в дополнительной таблице S2. Среди них протеаза из Bacillus является единственной нейтральной протеазой; все остальные представляют собой щелочные протеазы. Благодаря лучшим очищающим свойствам протеазы по сравнению с обычными синтетическими детергентами, щелочные протеазы стали ключевыми ингредиентами в составах моющих средств (Rai and Mukherjee, 2009). Недавно сообщалось о потенциальном применении некоторых протеаз в качестве добавок к моющим средствам для стирки (Venugopal and Saramma, 2007; Jaouadi et al., 2008; Манни и др., 2010; Джейн и др., 2012). АМЗ-тк также показал ценные перья как добавку в стиральный порошок. Интересно, что AMZ-tk ингибирует рост нескольких патогенных организмов, что позволяет предположить, что AMZ-tk имеет множество применений в пищевой промышленности, заменяя другие протеазы для контроля присутствия патогенных бактерий и продления срока годности свежих и обработанных пищевых продуктов. Хотя AMZ-tk обладает активностью саморазложения, реакцию можно наблюдать только при температуре выше 40°C. Благодаря упомянутым выше преимуществам (термостойкость, устойчивость к детергентам и антибактериальная активность) АМЗ-тк также может быть потенциальным биокатализатором для промышленного применения.

    Вклад авторов

    Придумал и спроектировал эксперименты: BJ и CJ. Проведены эксперименты: BJ, ZL и JL. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты анализа: YS, XJ, YX и JZ. Написал статью: BJ.

    Заявление о конфликте интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Благодарности

    Этот проект был поддержан Стратегической инициативой по микробиомам в сельском хозяйстве и продовольствии Министерства сельского хозяйства, продовольствия и сельских дел Республики Корея (в рамках (межведомственной) программы преобразования геномных технологий в бизнес), Фондом новых учителей из Министерство образования Китая (20120061120103) и Фонд естественных наук Цзилиня, Китай (20130522063JH).

    Дополнительный материал

    Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.01380

    .

    Каталожные номера

    Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., et al. (1997). Gapped BLAST и PSI-BLAST: новое поколение программ поиска белковых баз данных. Рез. нуклеиновых кислот. 25, 3389–3402. doi: 10.1093/нар/25.17.3389

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Акель, Х., Аль-Кадан, Ф., и Юсеф, Т.К. (2012). Новая нейтральная протеаза из термофильного штамма Bacillus HUTBS62. J. BioSci. Биотехнолог. 1, 117–123.

    Брэдфорд, Массачусетс (1976). Быстрый и чувствительный метод количественного определения белка в микрограммах, использующий принцип связывания белка с красителем. Анал. Биохим. 72, 248–254. дои: 10.1016/0003-2697(76)

    -3

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Коломбо, С., Д’Аурия, С., Fusi, P., Zecca, L., Raia, C.A., and Tortora, P. (1992). Очистка и характеристика термостабильной карбоксипептидазы из экстремально термофильной архебактерии Sulfolobus solfataricus. евро. Дж. Биохим. 206, 349–357. doi: 10.1111/j.1432-1033.1992.tb16934.x

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Деу, Э., Вердоэс, М., и Богио, М. (2012). Новые подходы к анализу функций протеаз для улучшения разработки зондов и открытия лекарств. Нац. Структура Мол. биол. 19, 9–16. doi: 10.1038/nsmb.2203

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Диас-Пералес, А., Кесада, В., Пейнадо, Дж. Р., Угальде, А. П., Альварес, Дж., Суарес, М. Ф., и соавт. (2005). Идентификация и характеристика человеческих архемеццинов-1 и -2, двух новых членов семейства металлопротеаз, широко распространенных у архей. Дж. Биол. хим. 280, 30367–30375. doi: 10.1074/jbc.M504533200

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Фухоу, Т., Танака С., Кога Ю., Такано К. и Каная С. (2010). Субтилизин-подобная сериновая протеаза гипертермофильных архей Thermococcus kodakaraensis с N- и С-концевыми пропептидами. Белок Eng. Дес. Сел. 23, 347–355. doi: 10.1093/белок/gzp092

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Franceschini, A., Szklarczyk, D., Frankild, S., Kuhn, M., Simonovic, M., Roth, A., et al. (2013). STRING v9.1: сети взаимодействия белок-белок с увеличенным охватом и интеграцией. Рез. нуклеиновых кислот. 41, Д808–Д815. doi: 10.1093/nar/gks1094

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Фукуда К., Хамагути Н., Ода Т., Ишимацу А. и Мурамацу Т. (1998). Гемагглютинирующая активность внеклеточных щелочных металлоэндопептидаз из Vibrio sp. НУФ-БПП1. Бионауч. Биотехнолог. Биохим. 62, 1157–1160. doi: 10.1271/bbb.62.1157

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Фукуи, Т., Атоми Х., Канаи Т., Мацуми Р., Фудзивара С. и Иманака Т. (2005). Полная последовательность генома гипертермофильного архея Thermococcus kodakaraensis KOD1 и сравнение с геномами Pyrococcus . Рез. генома. 15, 352–363. doi: 10.1101/гр.3003105

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Грэф, К., Шахерль, М., Вальтерспергер, С., и Бауманн, У. (2012). Кристаллические структуры архемецинцина обнаруживают способный к формированию сайт связывания субстрата. PLoS ONE 7:e43863. doi: 10.1371/journal.pone.0043863

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Guan, Q., Guo, X., Han, T., Wei, M., Jin, M., Zeng, F., et al. (2013). Клонирование, очистка и биохимическая характеристика органического растворителя, детергента и термостабильной амилопуллуланазы из Thermococcus kodakarensis KOD1. Процесс. Биохим. 48, 878–884. doi: 10.1016/j.procbio.2013.04.007

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Хан, Т., Zeng, F., Li, Z., Liu, L., Wei, M., Guan, Q., et al. (2013). Биохимическая характеристика рекомбинантной пуллуланазы из Thermococcus kodakarensis KOD1. Письмо. заявл. микробиол. 57, 336–343. doi: 10.1111/lam.12118

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Häse, C.C., and Finkelstein, R.A. (1993). Бактериальные внеклеточные цинксодержащие металлопротеазы. Микробиолог. Ред. 57, 823–837.

    Академия Google

    Хирата, А., Hori, Y., Koga, Y., Okada, J., Sakudo, A., Ikuta, K., et al. (2013). Ферментативная активность гомолога субтилизина, Tk-SP, из Thermococcus kodakarensis в детергентах и ​​его способность расщеплять аномальный прионный белок. Биотехнология BMC. 13:19. дои: 10.1186/1472-6750-13-19

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Хияма, Т., Сато, Т., Иманака, Т., и Атоми, Х. (2014). Паралоги бета-субъединицы триптофансинтазы TrpB1 и TrpB2 в Thermococcus kodakarensis оба участвуют в биосинтезе триптофана и утилизации индола. FEBS J. 281, 3113–3125. doi: 10.1111/февраль 12845

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Холмквист Б. и Валле Б. Л. (1974). Замещения металлов и ингибирование термолизина: спектры фермента кобальта. Дж. Биол. хим. 249, 4601–4607.

    Резюме PubMed | Академия Google

    Hu, Y., Peng, N., Han, W., Mei, Y., Chen, Z., Feng, X., et al. (2012). Белок архей, эволюционно законсервированный у прокариот, представляет собой цинк-зависимую металлопротеазу. Бионауч. 32, 609–618. doi: 10.1042/bsr20120074

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Джагер, Д., Форстнер, К.У., Шарма, К.М., Сантанджело, Т.Дж., и Рив, Дж.Н. (2014). Первичная карта транскриптома гипертермофильного археона Thermococcus kodakarensis . BMC Genomics 15:684. дои: 10.1186/1471-2164-15-684

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Джайн, Д., Панча, И., Мишра С.К., Шривастав А. и Мишра С. (2012). Очистка и характеристика галощелочной термоактивной, устойчивой к растворителям и SDS-индуцированной протеазы из Bacillus sp.: потенциальной добавки для моющих средств для стирки. Биоресурс. Технол. 115, 228–236. doi: 10.1016/j.biortech.2011.10.081

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Жауади, Б., Эллуз-Чаабуни, С., Рими, М., и Бежар, С. (2008). Биохимическая и молекулярная характеристика устойчивой к детергентам сериновой щелочной протеазы из Bacillus pumilus CBS с высокой каталитической эффективностью. Biochimie 90, 1291–1305. doi: 10.1016/j.biochi.2008.03.004

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Цзя Б., Лю Дж., Ван Дуйет Л., Сунь Ю., Суан Ю. Х. и Чеонг Г. В. (2015). Протеомное профилирование реакций на тепловой, окислительный и солевой стресс у Thermococcus kodakarensis KOD1. Фронт. микробиол. 6:605. doi: 10.3389/fmicb.2015.00605

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Кога Ю., Танака С., Сакудо А., Тобиуме М., Араниши М., Хирата А. и др. (2014). Протеолиз аномального прионного белка термостабильной протеазой из Thermococcus kodakarensis KOD1. Заяв. микробиол. Биотехнолог. 98, 2113–2120. doi: 10.1007/s00253-013-5091-7

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Ларкин, М. А., Блэкшилдс, Г., Браун, Н. П., Ченна, Р., Макгеттиган, П. А., Маквильям, Х., и соавт. (2007). Clustal W и Clustal X версии 2.0. Биоинформатика 23, 2947–2948. doi: 10.1093/биоинформатика/btm404

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Манни Л., Джеллули К., Горбель-Беллаай О., Агреби Р., Хаддар А., Селлами-Камун А. и др. (2010). Устойчивая к окислению и растворителю протеаза, продуцируемая Bacillus cereus SV1: применение при депротеинизации отходов жизнедеятельности креветок и в качестве добавки к стиральному порошку. Заяв. Биохим. Биотехнолог. 160, 2308–2321.doi: 10.1007/s12010-009-8703-z

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Мурао С., Номура Ю., Нагамацу К., Хираяма К., Ивахара М. и Шин Т. (1991). Очистка и некоторые свойства термостабильной металлопротеиназы, продуцируемой Thermomicrobium sp. Штамм КН-22. Сельскохозяйственный. биол. хим. 55, 1739–1744 гг. дои: 10.1271/bbb1961.55.1739

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Нойманн, Ю., Кубота Х., Фрей К., Гану В. и Лепперт Д. (2004). Характеристика Mca-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-Nh3, флуорогенного субстрата с повышенными константами специфичности для коллагеназ и фермента, превращающего фактор некроза опухоли. Анал. Биохим. 328, 166–173. doi: 10.1016/j.ab.2003.12.035

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Нихаус, Ф., Бертольдо, К., Калер, М., и Антраникян, Г. (1999). Экстремофилы как источник новых ферментов для промышленного применения. Заяв. микробиол. Биотехнолог. 51, 711–729. дои: 10.1007/s002530051456

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Рахман Р. Н., Фудзивара С., Такаги М. и Иманака Т. (1998). Анализ последовательности глутаматдегидрогеназы (ГДГ) гипертермофильного археона Pyrococcus sp. KOD1 и сравнение ферментативных характеристик нативных и рекомбинантных GDH. Мол. Генерал Жене. 257, 338–347. дои: 10.1007/s004380050655

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Рай, С.К. и Мукерджи А.К. (2009). Экологическое значение и биотехнологическое применение стабильной в органических растворителях щелочной сериновой протеазы из штамма DM-04 Bacillus subtilis. Биоресурс. Технол. 100, 2642–2645. doi: 10.1016/j.biortech.2008.11.042

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Рао М.Б., Танксейл А.М., Гатге М.С. и Дешпанде В.В. (1998). Молекулярные и биотехнологические аспекты микробных протеаз. Микробиолог. Мол. биол. Ред. 62, 597–635.

    Академия Google

    Саламоне, М., Никосия, А., Бенничи, К., Катрини, П., Катания, В., Маццола, С., и др. (2015). Комплексный анализ внеклеточной сериновой протеазы VpSP37 штамма Vibrio parahaemolyticus . PLoS ONE 10:e0126349. doi: 10.1371/journal.pone.0126349

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Шнайдер, К.А., Расбанд, В.С., и Элисейри, К.В. (2012). NIH image to imageJ: 25 лет анализа изображений. Нац. Методы 9, 671–675. doi: 10.1038/nmeth.2089

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Шеннон, П., Маркиэль, А., Озиер, О., Балига, Н.С., Ван, Дж.Т., Рэймидж, Д., и соавт. (2003). Cytoscape: программная среда для интегрированных моделей сетей биомолекулярного взаимодействия. Рез. генома. 13, 2498–2504. doi: 10.1101/gr.1239303

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Шивананд, П.и Джаяраман Г. (2011). Выделение и характеристика металл-ион-зависимой щелочной протеазы из галотолерантного штамма Bacillus aquimaris VITP4. Индиан Дж. Биохим. Биофиз. 48, 95–100.

    Резюме PubMed | Академия Google

    Сунь, Ю., Лв, X., Ли, З., Ван, Дж., Цзя, Б. и Лю, Дж. (2015). Рекомбинантная циклодекстриназа из Thermococcus kodakarensis KOD1: экспрессия, очистка и ферментативная характеристика. Археи 2015:8.дои: 10.1155/2015/397924

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Тамура К., Петерсон Д., Петерсон Н., Стечер Г., Ней М. и Кумар С. (2011). MEGA5: молекулярно-эволюционный генетический анализ с использованием методов максимального правдоподобия, эволюционного расстояния и максимальной экономии. Мол. биол. Эвол. 28, 2731–2739. doi: 10.1093/molbev/msr121

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Тротт О. и Олсон А.Дж. (2010). AutoDock Vina: повышение скорости и точности стыковки с помощью новой функции подсчета очков, эффективной оптимизации и многопоточности. Дж. Вычисл. хим. 31, 455–461. doi: 10.1002/jcc.21334

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Цудзи Ю., Накадзима Ю., Хомма К.-И. и Натори С. (1998). Антибактериальная активность новой сериновой протеазы с молекулярной массой 26 кДа в желтом теле куколок Sarcophaga peregrina (мясной мухи). ФЭБС Письмо. 425, 131–133.doi: 10.1016/S0014-5793(98)00217-8

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Валле, Б.Л., и Олд, Д.С. (1990). Координация цинка, функция и структура ферментов цинка и других белков. Биохимия 29, 5647–5659. дои: 10.1021/bi00476a001

    Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

    Венугопал, М., и Сарамма, А.В. (2007). Щелочная протеаза из Bacillus circulans BM15, недавно выделенная из мангровых зарослей: характеристика и применение в составах моющих средств для стирки. Indian J. Microbiol. 47, 298–303. doi: 10.1007/s12088-007-0055-1

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Вальтерспергер С., Видмер К., Ван М. и Бауманн У. (2010). Кристаллическая структура археметцинцина амза из Methanopyrus kandleri при разрешении 1,5 Å . Белки 78, 2720–2723. doi: 10.1002/прот.22777

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    Ву, Дж., Ван, З., Ши З., Чжан С., Мин Р., Чжу С. и др. (2013). Геном груши (Pyrus bretschneideri Rehd.). Рез. генома. 23, 396–408. doi: 10.1101/гр.144311.112

    Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

    .
  • Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.