Как выглядит выписка из егрн: Выписка ЕГРН на квартиру. Какие сведения содержит и для чего нужна

¹ Департамент биофизики и фармакологии, UFRN, Av. Senador Salgado Filho, S / N, Campus Universitário, Lagoa Nova, Natal, RN 59072-970, Бразилия

² Департамент фармацевтических наук, UFPE, Ресифи, PE Бразилия

³ Департамент фармацевтики, UFRN, Natal, RN Brazil

⁴ UFRN, Natal, RN Brazil

⁵ Департамент морфологии, UFRN, Natal, RN Brazil

Поступило 24 июля 2017 г .; Принято 23 февраля 2018 г.

Abstract

Предпосылки

Это исследование показало фитохимический состав и оценило противовоспалительную и обезболивающую активность неочищенного экстракта (CE) и фракций из E. uniflora листьев Linn.

Методы

Полифенолы, присутствующие в неочищенном экстракте (CE), во фракциях, обработанных водным (AqF) и этилацетатом (EAF), из E.uniflora Листья Linn были показаны с помощью хроматографического анализа с целью проведения фитохимической характеристики. Антибактериальную активность оценивали на основании минимальных ингибирующих концентраций (МИК), определенных с использованием метода разведения в агаре. Дозы 50, 100 и 200 мг / кг CE и фракций применялись для проведения моделей in vivo (самцы мышей Swiss, возраст 8–10 недель). Экспериментальную модель перитонита индуцировали каррагенаном после определения активности миелопероксидазы (MPO), общего глутатиона и малонового диальдегида (MDA), IL-1β и TNF-α с помощью спектроскопического анализа U V / VIS.Антиноцицептивную активность оценивали на основе модели абдоминальных корчей и теста с горячей пластиной. Результаты были статистически оценены с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони. Уровень статистической значимости составил p <0,05.

Результаты

Высокоэффективная жидкостная хроматография с детектором на фотодиодной матрице (HPLC-DAD) обнаружила различные концентрации галловой кислоты, эллаговой кислоты и мирицитрина в CE и фракциях, полученных из E. uniflora Linn листья (0,05–0,87% мас., 0,20–0,32% и 1,71–6,56% мас., соответственно). В целом, CE имел более низкие значения MIC, чем фракции, включая самые низкие значения MIC против штамма MRSA. CE и AqF также значительно снижали миграцию лейкоцитов и активность MPO ( p <0,05). Кроме того, AqF значительно снижал уровни IL-1β и TNF-α ( p <0,05). Кроме того, ХЭ и фракции проявляли антиоксидантный эффект ( p <0.05) и периферической анальгетической активности ( p <0,05).

Выводы

CE и фракции из листьев E. uniflora Linn проявляли антибактериальную, противовоспалительную, антиоксидантную и анальгетическую активность в проведенных анализах.

Ключевые слова: Eugenia uniflora Linn, противовоспалительное, антиноцицептивное, окислительный стресс, антибактериальный

Предпосылки

Eugenia uniflora Linn (Myrtaceae) — это вид, который известен как питанга и обычно Суринамская вишня) или питангейра (бразильская вишня). Кустарник встречается на Среднем Западе, Северо-Востоке, Юго-Востоке и Юге Бразилии [1, 2]. В бразильской народной медицине листья E. uniflora Linn используются в настоях, отварах и спиртовых экстрактах для лечения диареи, боли в животе, колик, кишечных инфекций, паразитов, лихорадки, гриппа, кашля, бронхита, беспокойства, высокого кровяного давления. и диабет [3, 4]. В других этноботанических исследованиях, в которых не указывалась используемая растительная часть, сообщалось об использовании этого вида для лечения лихорадки, гриппа, воспаления горла, воспаления зубов, головной боли, высокого артериального давления и высокого холестерина [5].

Согласно проведенным предварительным фитохимическим исследованиям, листьев E. uniflora Linn содержат алкалоиды, тритерпены, дубильные вещества, флавоноиды и антрахиноны [6]. В более подробных исследованиях гидролизуемые танины (эугифлорины D1 и D2, камптотин A, эноотеин B, гемин D, гиппоманин A), флавоноиды (афзелин, десмантин-1, мирицитрин, кверцитрин и гликозиды мирицетина и кверцетина (β) и терпеноиды) -ситостерин, бетулиновая кислота и центеллозид C) были идентифицированы и в некоторых случаях изолированы [7].

Хотя во многих исследованиях изучали E. uniflora , лишь в нескольких исследованиях изучалась возможная корреляция между фитохимическим составом этого двудольного растения и его биологической активностью. Исследование Schumacher et al. (2015) показали, что листьев E. uniflora Linn снижают индекс воспалительного инфильтрата в островках поджелудочной железы, поддерживая уровни инсулина в сыворотке крови и глутатиона в печени и снижая перекисное окисление липидов в сыворотке, а также снижая риск диабета у диабетиков без ожирения (NOD ) мыши [8].Богатая флавоноидами фракция (HE-Bu), полученная из листьев E. uniflora , снижает уровни TNF-α и IL-1β в сыворотке и заметно снижает экспрессию белков iNOS и COX-2 клетками подвздошной кишки в экспериментальной модели сепсиса in vivo [7 ]. Эфирное масло листа и изолированные терпеноиды из Eugenia uniflora Linn продемонстрировали анальгетический эффект in vivo, используя тест на сокращение живота у мышей, индуцированный уксусной кислотой и тестом с горячей пластиной [2].

Целью настоящего исследования было провести фитохимическую характеристику E.uniflora Linn листья, а также оценивают цитотоксичность, антибактериальную, противовоспалительную и обезболивающую активность неочищенного экстракта (CE) и полученных фракций из листьев E. uniflora Linn.

Методы

Травяной материал

Образец листьев E. uniflora Linn был собран в городе Ипожука (штат Пернамбуку, Бразилия). Вид был идентифицирован в гербарии доктором Ритой де Касиа Перейра, а образцы ваучера были депонированы в Агрономическом институте Пернамбуку (IPA) под номером 89989.Названия растений проверены http://www.theplantlist.org/.

Получение КЭ и обогащенных фракций

E. uniflora Linn-листья ( 50 г) сушили, измельчали ​​и затем экстрагировали (10%, масс. / v ) смесью ацетон: вода (7: 3, v / об) путем турбо-экстракции в течение 20 мин при 5-минутные интервалы, каждый с 30-секундными циклами. Затем раствор концентрировали при пониженном давлении (RV10 Basic, IKA®).Полученный остаток замораживали (-80 ° C, 3 дня), а затем лиофилизировали (модель L101, Liotop®) с получением CE (выход 10 г). Приблизительно 10 г CE восстанавливали в воде (100 мл). Полученную водную фракцию распределяли еще двенадцать раз с помощью 10 мл этилацетата. Эти водные (выход 4 г) и этилацетатные (выход 2 г) фракции (далее называемые AqF и EAF) концентрировали, замораживали и лиофилизировали.

Приготовление растворов для анализа с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

50 мг КЭ и фракций взвешивали и переносили в мерные колбы на 25 мл.После добавления 20 мл сверхчистой воды (Elga®) в каждую колбу колбы переносили в ультразвуковую баню (Ultracleaner, Unique®) для достижения полного растворения. Через 15 мин каждую фракцию КЭ и каждую разбавляли до 1 мг / мл сверхчистой водой. Галловая кислота (чистота 96%, Sigma®) [8], эллаговая кислота из коры дерева (чистота 95%, Sigma®) [8] и мирицитрин (чистота 99%, Sigma®) [7] были использованы в качестве эталонов. СЕ, фракции и стандарты фильтровали через поливинилидендифторид (PVDF) 0.Мембрана 45 мкм (Macherey-Nagel®) перед анализом ВЭЖХ. Анализы ВЭЖХ проводили в трех экземплярах.

Хроматографические условия

Система Thermo Scientific (Ultimate 3000 Thermo Fisher Scientific®), оснащенная DAD (Thermo Fisher Scientific®), бинарным насосом (HPG-3x00RS, Thermo Fisher Scientific®), дегазатором и автоматическим пробоотборником, оснащенным 20 Петлю мкл (ACC-3000, Thermo Fisher Scientific®) использовали для проведения анализов ВЭЖХ. Программное обеспечение Chromeleon 6.8 (Dionex®) использовалось для сбора и обработки данных.

Хроматографическое разделение выполняли с помощью колонки C ₁₈ (внутренний диаметр 250 мм × 4,6 мм, 5 мкм; Dionex®), которая была защищена защитной колонкой из того же материала (Phenomenex®). Градиентное элюирование достигалось изменением соотношения растворителя B (метанол с 0,05%, об., / об., Трифторуксусная кислота) к растворителю A (вода с 0,05%, об. / Об., Трифторуксусная кислота) при скорости потока 0,8 мл. / мин, в соответствии со следующей программой градиента: 10–25% B (10 мин), 25–40% B (5 мин), 40–70% B (10 мин), 75% B (5 мин) и 75 –10% B (1 мин).Разделение проводили в термостате колонок при температуре 23 ± 2 ° C. Длины волн 254 нм, 270 нм и 350 нм использовались для обнаружения эллаговой кислоты, галловой кислоты и мирицитрина, соответственно, в соответствии с максимальным поглощением, измеренным DAD.

Исследование in vitro

Антибактериальная активность

Антибактериальная активность CE и фракций была протестирована против важных с медицинской точки зрения грамположительных и грамотрицательных бактерий, имеющихся в Лаборатории медицинской бактериологии, UFRN, Бразилия.Грамположительная группа включала: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis INCQS 00016, Enterococcus faecalis ATCC 29212 и метициллин-резистентный штамм Staphylocuccus aureus, бразильский эпидермальный штамм [Mephelocuccus aureus ] . Грамотрицательная группа включала: Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis INCQS 00258 и Pseudomonas aeruginosa ATCC. Все эти бактерии предварительно поддерживались при -20 ° C и были реактивированы в бульоне для инфузии сердца мозга (BHI, HiMedia®, Индия) при 37 ° C в течение 24 часов.Бактериальные суспензии были стандартизированы до мутности, эквивалентной 0,5 стандартной пробирке МакФарланда, перед проведением антибактериального тестирования.

Минимальные ингибирующие концентрации (МПК) определяли методом разбавления агаром в соответствии с документом M07-A9 Института клинических и лабораторных стандартов [10] с некоторыми изменениями. Сначала готовили исходные водные растворы в ДМСО (50%, v / v) CE и фракций (25 мг / мл), которые затем фильтровали через стерильный раствор 0.Шприцевые фильтры с размером пор 22 мкм (Kasvi®, Бразилия). Затем последовательные объемы этих исходных растворов переносили в стерильные 15 мл пробирки, содержащие агар Мюллера-Хинтона (MHA, HiMedia®, Индия), разжиженный при 50 ° C. Затем растворы гомогенизировали и переносили в стерильные чашки Петри (диаметром 6 мм). Концентрация этих образцов варьировалась от 0,039 мг / мл до 2,5 мг / мл, при этом конечная концентрация ДМСО при наивысшей концентрации образца составляла (5% об. / Об.). Затем стандартизованные бактериальные суспензии разбавляли 1:10, и 2 мкл каждой разбавленной суспензии переносили в среду, содержащую КЭ или фракции, и инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов.Кроме того, контроль роста (MHA + иннокулят), контроль растворителя (MHA, содержащий 5% ДМСО) и контроль стерильности (MHA) инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов. Цефалотин, гентамицин и ванкомицин (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) использовали в качестве контрольных антибиотиков. МИК считалась самой низкой концентрацией экстракта или фракции, которая предотвращала видимый рост бактерий.

Исследования in vivo

Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья. Протокол был одобрен Комитетом по этике экспериментов на животных UFRN ( CEUA , номер разрешения: 001/2015).

Мыши

Самцов мышей Swiss в возрасте 8–10 недель (40 ± 2,0 г), полученных из Центра биологических наук UFRN Vivarium, содержали в стандартных условиях (например, 12-часовой цикл свет / темнота, 22 ± 0,1 ° C и 50 –55% влажности) при условии правильного кормления и воды ad libitum. Животные были акклиматизированы и подвергались 12-часовому голоданию и воде ad libitum перед экспериментами.Эвтаназию проводили подкожным введением тиопентала натрия в дозе 90 мг / кг (0,5%, Тиопентакс, Кристалия, Сан-Паулу, Бразилия).

Модель перитонита, индуцированного каррагинаном.

Мышей случайным образом распределяли на двенадцать групп ( n = 5 / группа). Чтобы оценить влияние CE и фракций на рекрутирование лейкоцитов в брюшную полость, мышей предварительно перорально обрабатывали носителем (0,9% физиологический раствор) / группой каррагинана, CE или фракциями (50, 100 и 200 мг / кг). ) или диклофенак (10 мг / кг).Через 30 мин внутрибрюшинно (внутрибрюшинно) вводили 0,25 мл 1% раствора каррагинана (Sigma-Aldrich, Сан-Паулу, Бразилия). Имитационная группа получала носитель (1 мл воды / 10 г, перорально) и 0,9% стерильный физиологический раствор внутрибрюшинно (0,1 мл / 10 г) [11]. Затем мышей умерщвляли через 4 часа передозировкой тиопентала натрия 90 мг / кг. Затем в каждую брюшную полость вводили по три мл физиологического раствора, собирали перитонеальную жидкость и разбавляли (1:20) раствором Турка. Общий подсчет лейкоцитов проводился для каждого образца с помощью счетной камеры Neubauer.Образцы хранили при -80 ° C для последующего анализа активности миелопероксидазы (MPO), а также уровней малонового диальдегида (MDA) и общего глутатиона.

Определение активности миелопероксидазы

Активность МПО измеряли согласно методике, описанной Krawisz et al. [12]. Аликвоту (100 мкл) каждого образца разбавляли в 2 мл гексадецилтриметиламмонийбромидного буфера (HTAB, Sigma Aldrich, Сан-Паулу, Бразилия) и гомогенизировали. Образцы обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут, затем центрифугировали при 10000 об / мин в течение 15 минут при 4 ° C, а затем подвергали трехкратному замораживанию-оттаиванию.Биохимические измерения проводились в двух экземплярах. Затем к контрольным образцам и образцам супернатанта в 96-луночных планшетах добавляли 7 мкл буфера HTAB. Затем в каждую лунку добавляли 200 мкл окрашивающего реагента (о-дианизидин дигидрохлорид) и регистрировали значения поглощения при 450 нм с помощью анализа Spectrocopical U V / VIS (Biotek, Сан-Паулу, Бразилия). Активность фермента МПО рассчитывалась на основе интерполяции стандартной кривой, построенной для МПО нейтрофилов человека и пероксидазы хрена.Единица MPO (U) была определена для разложения 1 нмоль / мин перекиси водорода при 25 ° C. Следовательно, результаты, полученные в анализах, выражали в единицах / мкл образца.

Определение общего содержания глутатиона

В соответствии с методом, описанным в [13], 100 мкл каждого воспалительного лаважа разбавляли 5% раствором трихлоруксусной кислоты (TCA) / дистиллированной воды, а затем гомогенизировали и центрифугировали при 10000 об / мин в течение 15 мин при 4 ° C. Каждое стандартное разведение (20 мкл), раствор TCA (20 мкл, Vetec, Сан-Паулу, Бразилия) для холостого опыта и супернатант каждого образца (20 мкл) добавляли в 96-луночные планшеты в двух экземплярах.Кроме того, в каждую лунку добавляли 15 мкл PBS-EDTA, 20 мкл раствора дитиобиснитробензойной кислоты (DTNB) и 140 мкл NADPH. После стадии инкубации при 30 ° C в течение 5 минут в каждую лунку добавляли 15 мкл раствора фермента и GSH-редуктазы (Sigma Aldrish, Сан-Паулу, Бразилия). Значения поглощения при 412 нм регистрировали с помощью анализа Spectrocopical U V / VIS (Biotek) в течение 3 минут. Общее содержание глутатиона рассчитывали на основе интерполяции стандартной кривой, которая была построена с очищенным глутатионом (γ-L-глутамил-L-цистеинил-глицин, GSH, Sigma Aldrish, São Paulo Brazil, G4251).Результаты этих анализов выражаются в нмоль / мкл образца.

Определение содержания МДА

Для оценки перекисного окисления липидов продуцирование МДА измеряли согласно [14]. Сначала 50 мкл каждого образца разбавляли 250 мкл 20 мМ буфера Tris HCl (Trizma hydrochloride, Sigma Aldrich, Сан-Паулу, Бразилия) в дистиллированной воде (20 мМ, pH 7,4). Образцы перитонеальной жидкости гомогенизировали и центрифугировали при 10000 об / мин в течение 10 минут при 4 ° C. Затем 750 мкл хромогенного реагента (10.К каждому образцу добавляли 3 мМ 1-метил-2-фенилиндол в ацетонитриле 3: 1) и 225 мкл HCl (37%). После стадии инкубации на водяной бане в течение 40 минут при 45 ° C образцы центрифугировали при 10000 об / мин в течение 5 минут при 4 ° C. Значения поглощения при 586 нм регистрировали с помощью спектроскопического анализа U V / VIS (Biotek, Сан-Паулу, Бразилия), и результаты интерполировали по стандартной кривой, которая была построена с 1,1,3,3-тетраэтоксипропаном (соединение который гидролизуется с образованием MDA при инкубации с HCl при 45 ° C).Результаты этих анализов выражаются в нмоль / мкл образца.

Анализ IL-1β и TNF-α

Перитонеальная жидкость (C-каррагинан, D-диклофенак, неочищенный экстракт CE, водная фракция AqF и фракция, обработанная EAF-этилацетатом) хранили при -70 ° C после экстракция, гомогенизация и обработка, как описано в другом месте [15]. Уровни IL-1β (диапазон обнаружения: 62,5–4000 пг / мл; нижний предел обнаружения: 12,5 нг / мл рекомбинантного мышиного IL-1β) и TNF-α (диапазон обнаружения: 62,5–4000 пг / мл; нижний предел обнаружения: обнаружение: 50 нг / мл рекомбинантного мышиного TNF-α) определяли с использованием коммерческих наборов для ELISA (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, USA ), как описано ранее [16].

Сначала планшеты для микротитрования покрывали в течение ночи при 4 ° C антителами против мышиного TNF-α и IL-1β. После того, как планшеты были заблокированы, образцы и стандарты добавляли в различных разведениях в двух экземплярах и инкубировали при 4 ° C в течение 24 часов. Планшеты промывали 3 раза буфером и затем в лунки добавляли антитела (биотинилированные овечьи поликлональные анти-TNF-α, анти-IL-1β, разведенные 1: 1000 1% буфером для анализа BSA). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, промывали и добавляли 50 мкл авидин-HRP (1: 5000).Цветной реагент о-фенилендиамин (50 мкл) добавляли через 15 мин и планшеты инкубировали в темноте при 37 ° C в течение 15–20 мин. Ферментативную реакцию останавливали с помощью H ₂ SO ₄ и измеряли оптическую плотность при 490 нм. Значения выражены в пг / мл.

Оценка антиноцицептивной активности

Тест с горячей пластиной

Тест с горячей пластиной использовался для измерения центральной анальгетической активности, и боль вызывалась теплом [17]. Мышей случайным образом распределяли на одиннадцать групп ( n = 5 / группа), и они получали: 10 мл / кг физиологического раствора (нормальная контрольная группа / без лечения), морфин (10 мг / кг, внутрибрюшинно) и CE, AqF. или EAF; с CE и группами фракций, получавших пероральные дозы 50 мг / кг, 100 мг / кг и 200 мг / кг их лечения.Затем каждую мышь помещали на горячую пластину (Insight, Сан-Паулу, Бразилия), поддерживающую температуру 55 ± 0,5 ° C. Регистрировали время, затрачиваемое животными на прыжок или лизание одной из задних лап. Задержки регистрировались с интервалами 30 мин, 60 мин, 90 мин и 120 мин после введения веществ.

Тест на спазмы в животе, вызванный уксусной кислотой

Боль вызывалась уксусной кислотой для измерения периферической анальгетической активности [18]. Мышей случайным образом распределяли на одиннадцать групп ( n = 5 на группу).Две группы получали пероральный физиологический раствор 10 мл / кг (нормальный контроль и контроль уксусной кислоты). Одна группа получала индометацин перорально (10 мг / кг). Остальные девять групп получали пероральные дозы CE (50, 100 или 200 мг / кг), AqF (50, 100 или 200 мг / кг) или EAF (50, 100 или 200 мг / кг). Ноцицепцию стимулировали i.p. инъекция уксусной кислоты (0,6% v / v), разведенной в сверхчистой воде, через 30 мин после обработки животных СЕ и фракциями, индометацином и контролем уксусной кислоты.Нормальный контроль получил i.p. введение физиологического раствора 10 мл / кг. После инъекции уксусной кислоты или физиологического раствора мышей помещали под перевернутые стеклянные воронки и записывали количество корчков, которые наблюдались в течение 20 минут.

Результаты экспериментов

Во время эксперимента регистрировали поведение и гибель животных.

Статистический анализ

Данные из контрольной группы считались исходными значениями. Все экспериментальные данные были записаны как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM).Результаты были статистически оценены с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони. Уровень статистической значимости составил p <0,05. Анализ результатов и построение графиков выполнялись с помощью GraphPadPrism версии 5.04.

Результаты

Хроматографические анализы CE и фракций

Хроматографические анализы были выполнены с использованием ВЭЖХ. Галловая и эллаговая кислоты (мономеры гидролизуемых танинов) и флавоноид мирицитрин были обнаружены в СЕ и фракциях E.uniflora Льняные листья. Время удерживания (RT) галловой кислоты, мирицитрина и эллаговой кислоты в этих образцах составляло 8,7 мин (рис.), 23,3 мин (рис.) И 25,1 мин (рис.), Соответственно. Идентичность стандартов в образцах подтверждали корреляцией их RT. Таким образом, пики, соответствующие стандартам, были определены в образцах из листьев E. uniflora следующим образом: CE (пики: 1, 2 и 3; рис.), AqF (пик: 1; рис.) И ДСП (пики: 1, 2 и 3; рис.).

Хроматографические профили галловой кислоты (A), мирицитрина (B), эллаговой кислоты (C), CE (D), AqF (E) и EAF (F) E.uniflora Linn листья, как определено с помощью ВЭЖХ. CE: неочищенный экстракт, AqF: водная фракция, EAF: фракция, обработанная этилацетатом. Время удерживания (RT) галловой кислоты, мирицитрина и эллаговой кислоты этих веществ составляло 8,7 мин (пик 1), 23,3 мин (пик 2) и 25,1 мин (пик 3).

Содержание галловой кислоты, мирицитрина и эллаговой кислоты в CE и фракции также определяли в трех повторностях с использованием калибровочных кривых стандартов (y = 1,3038 × + 0,6907; R ² = 0,9920; y = 1.4816 × — 2.200; ² = 0,9916; у = 3.0007 × + 3.9969; R ² = 0,9906 соответственно для галловой кислоты, мирицитрина и эллаговой кислоты). Эти значения приведены в таблице.

Таблица 1

Содержание химических маркеров, проанализированных в CE и фракциях листьев E. uniflora , как определено с помощью HPLC-DAD

Активность in vitro

Антибактериальная активность

В проведенных антибактериальных анализах КЭ и фракции E. uniflora Linn подавляли большинство тестируемых бактерий, за исключением MRSA, который не был восприимчив к CE на 2.5 мкг / мл, или Escherichia coli , который не был чувствителен ни к одному из тестируемых образцов (таблица). В целом, CE имел более низкие значения MIC, чем фракции, включая самые низкие значения MIC против штамма Staphylococcus epidermidis . Нормальный рост бактерий наблюдался во всех контрольных группах роста (MHA + иннокулят) и растворителях (MHA, содержащий 5% ДМСО). В контрольных группах стерильности (MHA) роста не наблюдалось.

Таблица 2

МИК КЭ и фракции E. uniflora Linn против грамположительных и грамотрицательных бактерий

Активность in vivo

Все животные имели отличное состояние здоровья, и они были включены в эксперименты. 100% рандомизированных животных экспериментальной модели включали в модель перитонита, индуцированного каррагенаном, тест с горячей пластиной и тест на спазмы брюшной полости, вызванные уксусной кислотой.Ни одно животное не было исключено из исследования. Побочных эффектов не обнаружено.

Миграция лейкоцитов

В анализах миграции лейкоцитов обработка CE, AqF и EAF во всех дозах приводила к значительному ингибированию миграции лейкоцитов по сравнению с группой каррагинана ( p <0,001 или p <0,01, рис.) .

Эффекты CE и фракций E. uniflora Linn в различных дозах на миграцию лейкоцитов в модели перитонита, индуцированного каррагинаном, по сравнению с группой каррагинана.Результаты выражены как среднее значение ± стандартная ошибка ( n = 5). Для расчета статистической значимости использовался тест ANOVA. ** p <0,01, *** p <0,001 по сравнению с группой каррагинана (C). S (имитация), C (каррагинан), D (диклофенак), CE (неочищенный экстракт), AqF (водная фракция), EAF (фракция, обработанная этилацетатом)

Активность MPO

Инфильтрация лейкоцитов оценивалась с обнаружением MPO уровни в перитонеальной жидкости. Как показано на фиг., Уровень МПО в группе положительного контроля был более чем в двенадцать раз выше (65 Ед / мкл), чем в группе отрицательного контроля / физиологический раствор (5 Ед / мл) ( P <0.001). После лечения диклофенаком наблюдалось значительное снижение уровней МПО по сравнению с группой положительного контроля ( P <0,001). Значительное снижение уровней активности МПО во всех дозах наблюдалось после лечения CE, AqF и EAF как следствие количества нейтрофилов.

Влияние CE и фракций (50, 100 или 200 мг / кг) E. uniflora Linn на активность МПО в модели перитонита, индуцированного каррагенаном, по сравнению с группой каррагинана.Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 5). Тест ANOVA был использован для расчета статистической значимости *** p <0,001 по сравнению с группой положительного контроля. S (имитация), C (каррагинан), D (диклофенак), CE (неочищенный экстракт), AqF (водная фракция), EAF (фракция, обработанная этилацетатом)

Общее содержание глутатиона

Общие уровни глутатиона определялись в перитонеальной жидкости образцы, чтобы оценить влияние КЭ и фракций E.uniflora Linn на окислительно-восстановительный гомеостаз. В группе положительного контроля общий уровень глутатиона снизился примерно в 8 раз по сравнению с группой отрицательного контроля. Напротив, введение CE и фракций в дозах 50 мг / кг, 100 мг / кг и 200 мг / кг увеличивало общий уровень глутатиона на 84% по сравнению с группой положительного контроля ( P <0,001) ( Инжир. ). Эти результаты предполагают, что CE и фракции E. uniflora Linn опосредуют антиоксидантную активность.

Эффекты CE и фракций (50, 100 или 200 мг / кг) E. uniflora Linn на уровни общего глутатиона (нмоль / мкл) в модели перитонита, индуцированного каррагинаном, по сравнению с группой каррагинана. Результаты выражены как среднее значение ± стандартная средняя ошибка ( n = 5). Тест ANOVA был использован для расчета статистической значимости *** p <0,001 по сравнению с группой положительного контроля. S (имитация), C (каррагинан), D (диклофенак), CE (неочищенный экстракт), AqF (водная фракция), EAF (фракция, обработанная этилацетатом)

Содержание MDA

MDA является одним из основных вторичных продуктов перекисное окисление липидов и является широко используемым биомаркером для оценки окислительного стресса.MDA — это диальдегид, который является побочным продуктом окисления полиненасыщенных жирных кислот путем бета-расщепления пероксидазы и, в основном, арахидоновой кислоты. Как показано на фиг. 1, уровни MDA были выше в группе положительного контроля по сравнению с обработанной группой и группой отрицательного контроля. Однако CE и фракции во всех дозах были способны значительно снижать уровни MDA ( p <0,001), тем самым указывая на то, что защитный эффект на перекисное окисление липидов опосредуется E. uniflora Linn листьями.

Влияние CE и фракций (50, 100 или 200 мг / кг) E. uniflora Linn на уровни MDA в модели перитонита, индуцированного каррагинаном, по сравнению с группой каррагинана. S (имитация), C (каррагинан), D (диклофенак), CE (неочищенный экстракт), AqF (водная фракция) и EAF (фракция, обработанная этилацетатом). Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 5). Для расчета статистической значимости использовался тест ANOVA, * p <0,05), *** p <0.001 по сравнению с группой положительного контроля. ^# указывает на значительную разницу между группами, получавшими экстракты.

Влияние CE и фракций

Группы, подвергнутые CE, и фракции E. uniflora. Linn показал снижение уровней провоспалительного цитокина IL-1β (диклофенак, CE и фракции E. uniflora CE для всех доз, p <0,001, за исключением EAF при 200 мг / кг, p <0.01) и TNF-α (диклофенак, p <0,01, и AgF, все дозы, p <0,05) по сравнению с контролем каррагинана (фиг.).

Уровни воспалительных цитокинов IL-1β и TNF- -α . C (каррагинан), D (диклофенак), CE (неочищенный экстракт, 50, 100 или 200 мг / кг), AqF (водная фракция, 50, 100 или 200 мг / кг), EAF (фракция, обработанная этилацетатом, (50 , 100 или 200 мг / кг). Тест ANOVA был использован для расчета статистической значимости, * p <0,05), ** p <0.01 по сравнению с контрольной группой каррагинана. ^# указывает на значительную разницу между группами, получавшими экстракты.

Оценка антиноцицептивной активности.

В тесте горячей пластиной группа, получавшая морфин, проявляла центральное обезболивающее действие во всех временных интервалах; однако только доза группы, получавшей 200 мг / кг AqF, проявляла центральное обезболивающее действие с интервалом в 90 минут. Группа, получавшая AqF, не имеет дозозависимого профиля, и поэтому это может не быть связано с фармацевтической активностью AqF.Ни одна из других групп в другие промежутки времени не проявляла значимого центрального анальгетического действия (таблица).

Таблица 3

Оценка анальгетической активности E. uniflora CE и фракций в различных дозах

Абдоминальное введение уксусной кислоты анализ корчей, введение физиологического раствора в нормальном контроле, индометацина, CE, AqF и EAF E.uniflora Linn привело к значительному снижению количества спазмов в животе по сравнению с контролем с уксусной кислотой ( p <0,001, рис. 7). Уксусная кислота показала статистически значимые различия, которые также наблюдались для нормального контроля ( p <0,001, рис.).

Антиноцицептивное действие индометацина, СЕ и фракций (50, 100 или 200 мг / кг) E. uniflora Linn в различных дозах на количество абдоминальных искривлений, наблюдаемых после введения уксусной кислоты.Данные выражены как среднее значение ± стандартная средняя ошибка ( n = 5). Для расчета статистической значимости использовался тест *** p <0,001 по сравнению с нормальным контролем; ### p <0,001 по сравнению с уксусной кислотой. NG (нормальная контрольная группа), AA (уксусная кислота), I (индометацин), CE (неочищенный экстракт), AqF (водная фракция), EAF (фракция, обработанная этилацетатом)

Результаты экспериментов

Нет записей об изменении поведения или смерть были обнаружены во время экспериментов на животных моделях.

Обсуждение

Результаты, полученные в настоящем исследовании, создают научную основу для использования E. uniflora в народной / традиционной медицине. Как для тестов in vitro, так и in vivo, CE и фракции из листьев E. uniflora Linn проявляли действие на жизнеспособность клеток, антибактериальную, противовоспалительную и антиноцицептивную активность.

Мирицитрин — это рамнозное гликозидное производное мирицетина, встречающегося в природе флавонола, экстрагированного из плодов, коры или листьев растений.Кроме того, мирицитрин может быть дегликозилирован до агликон мирицетина [19].

Мирицитрин проявил несколько биологических функций, которые представляют потенциальную пользу для здоровья, включая антимутагенную [20], антиоксидантную [21, 22], противовоспалительную [22–24] и антиноцицептивную [25] активность в экспериментальных моделях. Также было обнаружено, что мирицитрин защищает от рака кожи, сильно ингибируя индуцированную опухолью трансформацию неопластических клеток посредством ограничения активности киназ MEK, JAK1, Akt и MKK4 [26].Кроме того, было показано, что мирицитрин ослабляет индуцированную опухолью активацию c-fos и протеина-активатора-1 [27], а также ингибирует пути JAK1 / STAT3 [28].

В исследовании Fiuza et al. (2008), гидроэтанольный экстракт из листьев E. uniflora Linn был подвергнут методу разбавления агаром, и было обнаружено, что он ингибирует рост штаммов Pseudomonas aeruginosa . Однако соответствующие значения МИК 2,18 [29], 4,37 [30], 8,75 [30] и 17,50 мг / мл [29] были примерно в 2–7 раз выше, чем концентрации, указанные в настоящем исследовании [31].В другом исследовании, в котором определялись значения MIC для гидроэтанольного экстракта E. uniflora Linn с использованием метода микроразведения в бульоне, было обнаружено, что экстракт подавляет рост P. aeruginosa , хотя и в более низкой концентрации (10 мкг / мл). Кроме того, последний экстракт не подавлял эталонный штамм S. aureus [32], что противоречит настоящим результатам. В других исследованиях сообщалось об ингибировании штаммов S. aureus , включая эталонный штамм ATCC 25923, с более низкими значениями МИК, чем указанные здесь.Сообщалось также об ингибировании штаммов E. coli , включая E. coli ATCC 25922, однако в настоящем исследовании этого не наблюдалось [33, 34]. Аналогичная МИК против штаммов S. aureus , включая АТСС 25923, была сообщена только в одном другом исследовании, при этом МИК 2,187 мг / мл сообщалось для гидроэтанольного экстракта методом разбавления агаром [35]. Эти расхождения могут быть связаны с химической сложностью исследуемых образцов, особенно с учетом того, что состав вторичных метаболитов у растительных видов является динамичным в зависимости от множества переменных, связанных с периодом до сбора урожая (место сбора урожая, время, высота над уровнем моря, погода) и после сбора урожая. (способ консервирования растительного материала, способ экстракции, вид экстракционной жидкости) условия.

В проведенных анализах ВЭЖХ EAF имеет более высокое содержание эллаговой кислоты, галловой кислоты и мирицитрина. Эти результаты предполагают, что EAF в целом имеет более высокое содержание фенольных соединений, включая гидролизуемые галлотаннины, эллагитанины и флавоноиды. Ранее было продемонстрировано, что полифенолы, включая галловую кислоту, эллаговую кислоту, дубильные вещества и флавоноиды, проявляют антибактериальную активность против многих штаммов бактерий [36, 37]. Поэтому мы предположили, что EAF будет более активным из-за более высокого содержания в нем эллаговой кислоты, галловой кислоты и мирицитрина.Несмотря на предыдущий отчет о том, что EAF, содержащий флавоноиды и дубильные вещества, был более активен, чем экстракт [35], CE, исследованный в настоящем исследовании, имел более низкое значение MIC, чем другие подготовленные фракции. Таким образом, возможно, что антибактериальная активность, наблюдаемая для исследуемого здесь CE, обусловлена ​​синергическим эффектом множества веществ, которые могли отсутствовать после процедуры фракционирования.

Окислительный стресс — это событие, которое характерно для многих заболеваний человека, включая воспаление и рак.Окислительный стресс может быть результатом дисбаланса между уровнями активных форм кислорода (АФК) и антиоксидантов, которые отвечают за клеточную защиту (например, глутатиона, супероксиддисмутазы). В воспалительном процессе окислительный стресс опосредуется фагоцитами, содержащими МПО, и это приводит к избыточной продукции АФК, которая преодолевает окислительную защиту, такую ​​как присутствие GSH, трипептида, обычно участвующего в предотвращении окислительного повреждения тканей. Таким образом, способность GSH поддерживать восстановленную внутриклеточную среду делает его важным маркером антиоксидантной активности.

Благоприятное влияние CE и фракций E. uniflora Linn на воспалительный процесс было подтверждено на основании наблюдаемого снижения миграции лейкоцитов. Как важный маркер миграции нейтрофилов, активность МПО также снижалась после лечения. Защитный эффект CE в отношении окислительного стресса был продемонстрирован его способностью предотвращать снижение уровня общего глутатиона и MDA (маркера перекисного окисления липидов). Противовоспалительная способность флавоноида мирицитрина была ранее продемонстрирована на основании его ингибирования продукции простагландинов, индуцированной липополисахаридом (ЛПС) [28].Также было обнаружено, что мирицитрин ингибирует продукцию LPS-стимулированного оксида азота, провоспалительных цитокинов, продукцию простагландина E2 и уровни белка индуцибельной синтазы оксида азота и циклооксигеназы-2 в макрофагах RAW 264.7 [23].

В модели абдоминальных корчей все экстракты во всех дозах проявляли явную периферическую антиноцицептивную активность, демонстрируя, что уменьшение воспалительного процесса сопровождалось явным уменьшением боли на периферическом уровне.Ноцицептивный механизм, вызываемый уксусной кислотой, включает различные механизмы, такие как высвобождение метаболитов арахидоновой кислоты посредством циклооксигеназы и биосинтез простагландинов и гистаминов, среди прочего [38]. В последнее десятилетие было показано, что воспалительные стимулы не стимулируют напрямую высвобождение первичных гиперноцицептивных медиаторов, но их высвобождению предшествует каскад цитокинов. Существует каскадный выброс цитокинов, который представляет собой связь между повреждениями и высвобождением первичных гиперноцицептивных медиаторов [39].Эта концепция позволяет нам понять, почему ингибирование одного (IL-1β или TNF-α) или нескольких (глюкокортикоиды) цитокинов вызывает обезболивание [39]. Наше исследование смогло показать эту связь между CE и фракцией, снижение уровней IL-1β и TNF-α и снижение периферической антиноцицептивной активности.

С другой стороны, тест с горячей пластиной заключается в оценке реакции лекарственного средства на термогенный стимул [40]. В этом тесте тепловой стимул активирует ноцицепторы (немиелинизированные волокна типа C), которые передают информацию в определенные области центральной нервной системы, вызывая, таким образом, ноцицептивный ответ [41].Этот тест эффективен для определения анальгетической активности опиоидных агонистов [42]. Реакция CE и фракций в тесте с горячей пластиной предполагала, что он не продемонстрировал опиоидного действия.

Полифенольные компоненты, такие как дубильные вещества, обладают антиоксидантными и противовоспалительными свойствами. В предыдущем исследовании водного экстракта E. uniflora Linn были идентифицированы гидролизуемые танины (например, галловая кислота и эллаговая кислота), и экстракт применялся на модели острого диабета [8].У животных, которым вводили экстракт, наблюдался пониженный индекс воспалительного инфильтрата с уменьшением инфильтрации воспалительными клетками с 25% до 80%, наблюдаемых у необработанных животных по сравнению с обработанными, соответственно. Уровни воспалительных цитокинов, особенно TNF-α, были значительно снижены в группе, получавшей AqF, при всех дозах с высоким содержанием эллаговой кислоты и мирицитрина. В макрофагах мирицитрин снижает продукцию провоспалительных медиаторов, таких как NO, iNOS, TNF-α, IL-6 и IL-12, за счет подавления активации NF-κB и STAT1 [43].Предварительная обработка эллаговой кислотой снижала экспрессию провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли α (TNF-α), интерлейкин 6 (IL-6) и интерлейкин 1β (IL-1β). Эти результаты предполагают, что эллаговая кислота защищает от опосредованного Т-клетками гепатита посредством TLR и сигнальных путей митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) / NF-κB [44].

Этот противовоспалительный эффект можно частично объяснить снижением перекисного окисления липидов, что означает, что антиоксидантный эффект опосредуется внутриклеточным снижением потребления глутатиона.Обезболивающие эффекты, связанные с CE и фракциями E. uniflora Linn в настоящем исследовании, согласуются с антиноцицептивной активностью, наблюдаемой в исследовании эфирных масел, которые были выделены из листьев E. uniflora Linn и подавляли сужение животных 48 % при пероральной дозе 200 мг / кг. Было показано, что пентановая фракция листьев E. uniflora Linn опосредует значительный антиноцицептивный эффект, который включал подавление сужений животных на 70% при той же дозе [2].

Ранее сообщалось, что мирицитрин оказывает значительный анальгетический эффект в тесте на реакцию корчей, вызванную уксусной кислотой [45]. В настоящем исследовании CE и фракции вызывали значительно больший обезболивающий эффект. Это наблюдение может быть связано с содержанием мирицитрина, галловой кислоты и эллаговой кислоты, которые были обнаружены в CE и фракции листьев E. uniflora Linn.

Выводы

Относительно антибактериального действия E.uniflora Linn листья, вариабельность результатов, представленных в литературе, в сочетании с неожиданными результатами, полученными в настоящем исследовании, указывает на то, что необходимы дальнейшие исследования для определения активного антибактериального соединения, которое присутствует в листьях E. uniflora Linn. Эти исследования могут включать оценку антибактериальной активности экстрактов листьев, собранных из разных мест, одновременно с подробным фитохимическим анализом. Цель состоит в том, чтобы определить, какие вещества присутствуют или отсутствуют в активных экстрактах, а какие — в менее активных.СЕ и полуочищенные фракции листьев E. uniflora Linn проявляли противовоспалительную и анальгезирующую активность. Лечебные дозы также ингибировали миграцию клеток, как подтверждено в анализах MPO, и проявляли противовоспалительную активность со сниженными уровнями IL-1β (CE и все фракции), но AqF (все дозы) снижали уровни TNF-α. Кроме того, согласно определениям уровней общего глутатиона и МДА, очевидно, что E. uniflora Экстракт листьев Linn может опосредовать антиоксидантную активность.AqF может быть связан с более высоким содержанием мицитрина, галловой кислоты и эллаговой кислоты и вызывать значительно больший обезболивающий эффект по сравнению с CE и фракциями.

Благодарности

Мы благодарим Pro-Reitoria de Pesquisa и программу последипломного образования фармацевтических наук / УФРН / Бразилия.

Финансирование

Эта работа была поддержана Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco / FACEPE (APQ-0493-4.03 / 14; BIC-0200-4.03 / 15; IBPG-0557-4.15 марта) и Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CNPq (308386 / 2015–9).

Наличие данных и материалов

Данные доступны у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Аббревиатуры

Вклад авторов

TRF, AAA, GCBG, LALS, RTMR, ICFB, MRAF, MASN, MCNM, RFAJ, ACVAG и JSM: внесли существенный вклад в концепцию и дизайн или сбор данных, или анализ и интерпретацию данных; TRF, AAA, GCBG, LALS, MRAF, MASN, MCNM, RFAJ: принимали участие в составлении рукописи или критическом ее пересмотре на предмет важного интеллектуального содержания; TRF, AAA, GCBG, LALS, RTMR, ICFB, MRAF, MASN, MCNM, RFAJ, ACVAG и JSM: окончательно утверждена версия, которая будет опубликована.Каждый автор должен в достаточной степени участвовать в работе, чтобы нести общественную ответственность за соответствующие части содержания; и TRF, AAA, GCBG, LALS, RTMR, ICFB, MRAF, MASN, MCNM, RFAJ, ACVAG и JSM: согласились нести ответственность за все аспекты работы в обеспечении того, чтобы вопросы, связанные с точностью или целостностью любой части работа должным образом исследована и решена.

Примечания

Одобрение этики и согласие на участие

Это исследование было одобрено Комитетом по этике использования животных / CEUA / Федеральным университетом Риу-Гранди-ду-Норти / UFRN, протокол № 01/2015) Федерального университета Рио. Гранд-ду-Норти, Бразилия.Используемые протоколы ухода за животными и исследований были основаны на принципах и рекомендациях, принятых в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных.

Согласие на публикацию

Не применимо.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Примечание издателя

Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий на опубликованных картах и ​​принадлежностей организаций.

Информация для авторов

Тамирес Роша Фалькао, электронная почта: moc.liamtoh @ oaclafrserimat.

Ауригена Антунес де Араужо, электронная почта: rb.tenrfu@anegirua.

Луис Альберто Лира Соарес, электронная почта: rb.moc.lou@hcethp.

Райанн Тас де Мораес Рамос, электронная почта: [email protected].

Изабель Кристин Ферраз Безерра, электронная почта: rb.moc.oohay@52_eelleb.

Магда Райанни Ассунсао Феррейра, электронная почта: moc.liamtoh@inan_adgam.

Маноэль Андре де Соуза Нето, электронная почта: moc.liamtoh@erdnaleonam.

Мария Селеста Нуньес Мело, электронная почта: мос.liamg @ olemlec.

Раймундо Фернандес де Араужо младший, электронная почта: rb.nrfu.bc@rjojuara.

Андреза Консейсао Верас де Агиар Герра, электронная почта: moc.liamg@demoibhazed.

Юлиана Сильва де Медейрос, электронная почта: moc.liamg@264soriedemanailuj.

Герлан Коэльо Бернардо Герра, электронная почта: moc.liamtoh@arreugenalreg.

Ссылки

Был описан химический состав Coccoloba ; он содержит тритерпены, дитерпены, антрахиноны, фитостероиды, алкалоиды, бензоиды, сапонины, флавоноиды, дубильные вещества, галловую кислоту, эпигаллокатехин, галлат, миристин-3-O-8-рамнозид, β -ситостерол, -ситостерол бетулиновые кислоты, карбоновые кислоты, сложные эфиры, альдегиды, эллаговая кислота, бензойная кислота, или -кумаровая кислота, рутин, мирицетин и кверцетин [10–12].Виды C. uvifera , C. cereifera и C. mollis были оценены как ларвицидные агенты против комаров Aedes aegypti [13], а также противогрибковые [14], цитотоксические [15], противомикробные препараты. [10], древесные биофунгицидные и фитопатогенные бактериальные [12].

Coccoloba alnifolia , широко известная как «pau-de estalo» или «cabuçu», является одним из эндемичных бразильских видов этого рода. Несмотря на все эти способы использования в традиционной народной медицине, нет никакой научной информации о составе вторичных метаболитов C.alnifolia , ни об их возможной биологической активности. Целью этого исследования было охарактеризовать химический состав и антиоксидантную активность экстрактов C. alnifolia с использованием моделей in vitro и in vivo . Пять экстрактов листьев были получены путем последовательной экстракции (с использованием аполярных растворителей в полярные растворители), а шестой экстракт был приготовлен только с водой (исходя из народного использования). В целом эти экстракты не влияли на жизнеспособность шести различных клеточных линий млекопитающих.Кроме того, анализы in vitro, и in vivo, показали четыре полярных экстракта, EE, ME, WEE и WE, которые были источниками молекул антиоксидантов. Более того, экстракты EE и WE не влияли на плодовитость нематод Caenorhabditis elegans , использованных в качестве тестовой модели. Таким образом, листья Coccoloba alnifolia имеют отличный потенциал для разработки лекарственных средств на травах и в качестве антиоксидантных продуктов.

2. Материалы и методы

2.1. Реагенты

Феррицианид калия, сульфат железа II, трихлоруксусная кислота и серная кислота были приобретены в компании Merck (Дармштадт, Германия).Нитро-синий тетразолий (NBT), моносахариды, диаминоэтантетрауксусная кислота (EDTA), D-глюкоза, галловая кислота, аскорбиновая кислота, белок бычьего сывороточного альбумина, аскорбиновая кислота, метионин, 3- (4,5-диметилтиазолил-2) -2,5 — дифенилтетразолийбромид (МТТ), пирокатехиновый фиолетовый, рибофлавин, молибдат аммония и трет-бутилпероксид водорода (t-BOOH) были приобретены у Sigma-Aldrich Co. (Сент-Луис, Миссури, США). Бикарбонат натрия, заменимые аминокислоты и фосфатно-солевой буфер (PBS) были приобретены у Invitrogen Corporation (Burlington, ON, Canada).Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), и фетальная бычья сыворотка (FBS) были получены от CULTILAB (Campinas, SP, Brazil). Пенициллин и стрептомицин были получены от Gibco (Форт-Уэрт, Техас, США). Все остальные растворители и химические вещества были аналитической чистоты от Synth (Diadema, SP, Бразилия).

2.2. Растительный материал

Coccoloba alnifolia зрелых листа были собраны в мае 2015 года с образца, расположенного в Парке дас Дунас, Натал, RN, Бразилия (зона UTM 250257315 м E08 м N — GPS Garmin Etrex).Этот регион соответствует биому Атлантического леса. После идентификации в Гербарий УФРН был депонирован чек за номером: УФРН 17133. Исследование было зарегистрировано в Гербарии УФРН. 54064-1, SISGEN нет. A39FD4C.

2.3. Приготовление экстрактов

После сбора урожая свежие листья были разделены на мелкие кусочки и перенесены в колбу в соотношении 1:10 () (100 г свежих листьев на 1000 мл растворителя) для мацерации в течение 24 часов для каждого использованного растворителя. . Метод последовательной экстракции был осуществлен с использованием различных растворителей в следующем порядке от аполярных до полярных растворителей, таких как гексан (HE), хлороформ (CE), этанол (EE), метанол (ME) и водный экстракт (WEE).Подход, использованный для приготовления экстрактов, заключался в последовательной экстракции с использованием различных растворителей, при которой листья мацерировали, и добавляли каждый растворитель (аполярный к полярным растворителям) в течение 24 часов. Затем листья фильтровали и возвращали в колбу, и добавляли следующий растворитель. Таким образом, водный экстракт (WEE) соответствует последнему растворителю, используемому для этой последовательной экстракции. Идея последовательной экстракции отделила соединение на основе растворителя. Кроме того, экстракт, приготовленный с использованием только воды — WE — был основан на народном использовании.

Для предотвращения легкого разложения колбу покрывали алюминиевой фольгой. Затем его помещали на встряхивающий стол при 150 об / мин на 24 ч при 24 ° C (Tecnal Shacker). Экстракт фильтровали через ватман № 1. Листья переносили обратно в колбу со следующим растворителем после серийной экстракции в тех же условиях. Экстракты сушили в ротационном испарителе (Tecnal – TE 210) при 40 ° C. Экстракты восстанавливали в 1% ДМСО (Merck), затем лиофилизировали (Labconco FreeZone 4.5). Все экстракты ресуспендировали в воде до конечной концентрации 100 мг / мл (исходный экстракт) и хранили при -18 ° C до использования.

2.4. Общее содержание сахара, фенольных соединений и белка

2.4.1. Всего сахаров

Для проверки количества сахаров в экстрактах использовали метод фенола-H ₂ SO ₄ и D-глюкозу (Sigma-Aldrich) в качестве стандарта. Общее количество сахаров измерялось при 490 нм (Hitachi U-2000 Tokyo, Japan) [16].

2.4.2.Общее количество фенольных соединений

Общее содержание фенольных соединений измеряли с использованием метода Folin Ciocalteu, и галловую кислоту (Sigma-Aldrich) использовали в качестве стандарта. Его измеряли при 765 нм (BioTek Epoch Microplate, Калифорния, Калифорния, США) [17].

2.4.3. Общие растворимые белки

Общее содержание белка измеряли с использованием метода Брэдфорда, и белок бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich) использовали в качестве стандарта. Реакцию измеряли при длине волны 595 нм (BioTek Epoch Microplate, Калифорния, Калифорния, США) [18].

2,5. Антиоксидантная активность in vitro

Каждый анализ антиоксиданта проводили в трех экземплярах и повторяли три раза. Все показания были сделаны с использованием спектрофотометра BioTek Epoch Microplate (Калифорния, Калифорния, США). Использовали экстракты из C. alnifolia в концентрации 250 мк г / мл.

2.5.1. Общая антиоксидантная способность (TAC)

Антиоксидантную активность измеряли с учетом восстановления Mo ⁺⁶ до Mo ⁺⁵ растительными экстрактами и последующего образования комплекса зеленый фосфат / Mo ⁺⁵ при кислом pH.Используемая концентрация экстракта составляла 250 мкМ ( г / мл), который был смешан с 600 мМ серной кислоты молибдата аммония), и его инкубировали при 100 ° C в течение 90 мин [19]. По истечении этого времени смесь выдерживали при комнатной температуре для охлаждения и измеряли оптическую плотность при 695 нм. Результаты сравнивали с отрицательным контролем (дистиллированная вода). Общая антиоксидантная способность выражалась в эквивалентах аскорбиновой кислоты (ЕАА / г).

2.5.2. DPPH

Антиоксидантную активность определяли по способности антиоксидантов, присутствующих в образцах, улавливать радикал DPPH [20].Экстракт добавляли в концентрации 250 мкл г / мл и 100 мкл л DPPH (0,1 мМ). Смесь интенсивно перемешивали и оставляли на 30 мин при комнатной температуре. Затем измеряли оптическую плотность при 517 нм. Бланковый контроль представлял собой 99,5% этанол (Synth, Бразилия), а отрицательный контроль — дистиллированная вода. Активность по поглощению DPPH рассчитывали следующим образом:.

2.5.3. Reducing Power Assay

Восстанавливающую способность образцов оценивали по восстановлению феррицианида калия до ферроцианида калия [21].Растительный экстракт с концентрацией 250 мкМ г / мл добавляли к раствору, содержащему 0,2 М фосфатный буфер (pH 6,6) и феррицианид калия (1%) в конечном объеме 4 мл. Реакцию инкубировали при 50 ° C в течение 20 мин; по истечении этого периода его прекратили добавлением раствора TCA (10%). Затем раствор смешивали с дистиллированной водой и хлоридом железа (0,1%). Поглощение измеряли при 700 нм. Фосфатный буфер использовали в качестве холостого контроля. Результат был выражен в процентах от активности, представленной цифрой 0.1 мг / мл аскорбиновой кислоты (стандарт — Sigma-Aldrich).

2.5.4. Активность по поглощению супероксида

Анализ основан на способности экстрактов ингибировать фотохимическое восстановление нитросинего тетразолия (NBT) в систему рибофлавин-свет-NBT [21, 22]. Для этого экстракт с концентрацией 250 мкМ г / мл был добавлен в 50 мМ фосфатный буфер (pH 7,8), 13 мМ метионин, 100 мМ EDTA, 75 мМ NBT и 2 мМ рибофлавин. После этого раствор подвергали воздействию люминесцентной лампы в течение 10 минут.Изменение цвета на синий связано с образованием формазана, и его отслеживают по поглощению при 560 нм. В спектрофотометре. ЭДТА использовали в качестве контроля, а дистиллированную воду — в качестве холостого опыта. Результаты выражали в процентах поглощения:

2,6. Жизнеспособность клеток — анализ МТТ

Влияние экстрактов C. alnifolia на жизнеспособность клеток оценивали. Использовали одну неопухолевую клеточную линию: NIH / 3T3 (ATCC CRL-1658 — мышиный фибробласт), а также пять линий опухолевых клеток: HeLa (ATCC CCL-2 — клетка аденокарциномы матки человека), SiHa (ATCC HTB-35— клетка плоскоклеточной карциномы человека), PC-3 (ATCC CRL-1435 — клетка аденокарциномы простаты человека), B16-F10 (ATCC CRL-6475 — клетка меланомы кожи мыши) и PANC-1 (ATCC CRL-1469— клетки аденокарциномы поджелудочной железы).Сначала клеточные линии выращивали в культуральных колбах с использованием среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением FBS (10%) и антибиотиков (100 Ед / мл пенициллина и 100 мкл г / мл стрептомицина). Эти культуральные колбы поддерживали в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ при 37 ° C. Чтобы оценить влияние экстракта на жизнеспособность клеток, клетки переносили в 96-луночные планшеты по количеству клеток на лунку до тех пор, пока они не достигли слияния. Экстракты (HE, CE, EE, ME, WEE и AE) добавляли при 0, 100, 250 или 500 мк г / мл в течение 24 часов при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ .После периода инкубации среду заменяли на 100 мкл л МТТ (1 мг / мл, растворенный в DMEM). Затем клетки инкубировали в течение 4 ч в атмосфере 5% CO ₂ при 37 ° C. Затем лунки отсасывали и кристаллы формазана солюбилизировали добавлением 100 мкл л этанола на лунку [23, 24]. Планшет считывали при поглощении 570 нм с использованием спектрофотометра для микропланшетов Epoch (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA). Жизнеспособность клеток определяли и сравнивали с отрицательным контролем (только DMEM), используя следующую формулу:, в которой соответствовала оптическая плотность экспериментальной группы, а была оптическая плотность отрицательного контроля.

2.7. Антиоксидантная активность in vivo

2.7.1.

C. elegans N2 (линия дикого типа) были получены из Центра генетики Caenorhabditis (Университет Миннесоты, США) и содержались в среде для выращивания нематод (NGM), засеянной Escherichia coli OP50 при 20 ° C по Бреннеру [25]. Черви синхронизировали с помощью отбеливающего раствора в беременных гермафродитах (NaOCl 1%, NaOH 0.25 M), чтобы иметь животных на стадии L1 (Sulston, Hodgkin, 1988). Для лечения экстракты EE и WEE фильтровали с использованием фильтра 0,22 мкм, мкм (Merck) и добавляли к NGM в конечных концентрациях 1 или 10 мг / мл. Синхронизированные L1 культивировали на чашках NGM, содержащих экстракты, и засевали E. coli OP50 в течение 48 часов при 20 ° C, пока они не достигли стадии L4.

2.7.2. Токсичность для

Для этого анализа 30 яиц помещали в три чашки NGM, содержащие EE и WEE в концентрации 0, 1 и 10 мг / мл, и выдерживали при 20 ° C в течение 48 часов.После этого подсчитывали количество L4 и яиц. Этот анализ был проведен в трех независимых анализах с общим количеством 90 яиц на группу.

2.7.3. Анализ окислительного стресса

Анализ окислительного стресса проводили с использованием трет-бутилпероксида водорода (t-BOOH) в качестве продуцента АФК [26, 27]. Сорок червей на стадии L4 обрабатывали EE и WEE в концентрациях 0, 1 и 10 мг / мл в течение 48 часов при 20 ° C. После этого червей переносили в 12-луночный планшет, содержащий буфер M9 с 8 мМ t-BOOH, и оценивали каждые полчаса.Те черви, которые не реагировали на раздражитель, считались мертвыми (без движения). Некоторые черви подвергались цензуре, что означает, что червь не был обнаружен или умер по причинам, не связанным с окислительным стрессом. Эти анализы были выполнены в пяти независимых анализах.

2,8. Тонкослойная хроматография (ТСХ)

Для анализов использовали хроматопланшеты с силикагелем. Используемые подвижные фазы были следующими: (i) этилацетат: муравьиная кислота: вода (8: 0,8: 1,), (ii) этилацетат: муравьиная кислота: метанол: вода (10: 0.5: 0,6: 0,2,) и (iii) толуол: этилацетат: муравьиная кислота (5: 5: 0,5,). Визуализация соединения была достигнута путем распыления растворов серного ванилина, 0,5% натурального реагента А (дифенилборилоксиетиламина), 1% хлорида железа в метаноле и Драгендорфа. Стандарты, используемые при ТСХ, были следующими: кверцетин, урсоловая кислота, галловая кислота, изокверцетин, хлорогеновая кислота, эллаговая кислота, изокверцитрин, лютеонин, канферол, рутин, кофейная кислота, катехин, ориентин, изоориентин, витексин и изовитексин (сигмаитексин (сигмаитексин). ).Затем наблюдали за цветом, измеряли коэффициент удерживания (Rf) пятен и сравнивали его с литературными данными [28]. Для ME и EE была проведена Co-TLC для подтверждения присутствия гликозидных флавоноидов, витексина и изовитексина.

2.9. Высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC-DAD)

WE анализировали с помощью HPLC-DAD (Agilent 1260), снабженного колонкой C18 (Zorbax-). Элюирование проводили градиентом 0,1% уксусной кислоты (A) и ацетонитрила (B) следующим образом: 10% B (0-6 мин), 10-15% B (6-7 мин), 15% B (7 мин.). -22 мин), от 15 до 50% B (22-32 мин), от 50 до 100% B (32-42 мин) и 100% B (42-50 мин) при постоянной скорости потока 1 мл / мин .Образец был приготовлен из расчета 1 мг / мл с использованием метанола (степень чистоты для ВЭЖХ), и объем впрыска составлял 3 мк л. Температура колонки составляла 45 ° C, и детектирование проводили при 228, 254, 280, 290, 320. , 340 и 352 нм. Идентификация фенольных соединений была получена путем сравнения времени удерживания и спектров поглощения в УФ-видимой области со стандартными соединениями.

Стандарты, используемые в HPLC-DAD, были следующими: 3-гидроксикоричная кислота (501-52-0), бензойная кислота (65-85-0), кофейная кислота (331-39-5), коричная кислота 92 ( 621-82-9), хлорогеновая кислота (327-97-9), эллаговая кислота (476-66-4), феруловая кислота (1135-93 24-6), галловая кислота (149-91-7), гентизиновая кислота (490-79-9), о-кумаровая кислота (583-17-5), п-кумаровая кислота (501-98-4), розмариновая кислота (20283-92-5), синаповая кислота (530-59-6 ), апигенин (520-36-5), апиин-апигенин-7- (2-O-апиозилглюкозид) (26544-34-3), кемпферол (520-18-3), кемпферол 3-OD-галактозид (23627- 87-4), 3-O-метилкаемпферол (1592-70-7), биоробин-кемпферол 3-O- β -робинобиозид (17297-56-2), никотифлорин-кемпферол 3-O- β рутинозид ( 17650-84-9), катехин (154-23-4), хризин-5,7-дигидроксифлавон (480-40-0), хризоэриол-3-O-метиллутеолин (491-71-4), даидзеин-4, 7-дигидроксиизофлавон (486-66-8), эпикатехин (490-46-0), генистеин-4,5,7-тригидроксиизофлавон (446-72-0), госсипетин-8-гидроксикверцетин (489-35-0), час эсперидин (520-26-3), гесперитин (520-33-2), гистидулин-6-метоксиапигенин (1447-88-7), гомоориентин-лютеолин 6-C- β -D глюкозид (4261-42-1 ), изорамнетин 3-O- β -галактозид (6743-92-6), изорамнетин 3-O- β -D-глюкозид (5041-82-7), кейозид — изорамнетин 3-O-робинобиозид (107740 -46-5), нарциссин-изорамнетин 3-O- β рутинозид (604-80-8), лютеолин (491-70-3), мирицетин (529-44-2), нарингенин (480-41-1 ), неогесперидин (13241-33-3), ориентин-лютеолин-8-C-глюкозид (28608-75-5), кверцетагетин-7-O-глюкозид (548-75-4), кверцетин (117-39-5) , гиперин-кверцетин 3-O- β -галактозид (482-36-0), изокверцетрин-кверцетин 3-O- β -глюкозид (482-35-9), кверцетин 3-O- β — гентиобиозид (7431-83-6), кверцетин-3-O-робинобиозид (52525-35-6), кверцитрин-кверцетин-3-O-рамнозид (522-12-3), рамнетин (90-19-7), рутин- кверцетин 3-O- β -рутинозид (153-18-4), таксифолин-дигидрокверцетин (480-18-2), тилирозид-ка эмпферол 3-O- (6-O-п-кумароил) глюкозид (20316-62-5) и витексин-апигенин 8-C114 глюкозид (3861-93-4).Другие стандарты соответствуют библиотеке, созданной в лаборатории фитохимии факультета ботаники Университета Сан-Паулу.

2.10. Биоинформатический анализ

С помощью анализов ТСХ было обнаружено присутствие двух гликозидных флавоноидов — витексина и изовитексина в экстрактах листьев C. alnifolia . Эти соединения были использованы для поиска в базе данных системной фармакологии традиционной китайской медицины (TCMSP) для генов-мишеней [29]. Данные, полученные в TCMSP, были использованы в базе данных Kyoto Encyclopedia Genes and Gnome (KEGG) [30].Пути, идентифицированные в KEGG, были перечислены в порядке убывания их стоимости. Эти данные использовались для построения сети с использованием String 10 версии 11 (https://string-db.org/).

2.11. Статистический анализ

Все результаты были выражены как. Каждый анализ проводили в трех или пяти экземплярах, и каждый повторяли не менее 3 раз. Статистический анализ выполняли с использованием GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) с использованием вариационного анализа (односторонний дисперсионный анализ) и пост-теста Тьюки для сравнения различных групп.Различия со значениями ≤ 0,05 считались достоверными.

3. Результаты

3.1. Общее содержание сахара, фенольных соединений и белка

Пять экстрактов были получены в последовательности от неполярного до полярного: гексан (HE), хлороформ (CE), этанол (EE), метанол (ME) и водный экстракт (WEE). ), а шестой — только с водно-водной вытяжкой (WE). Таблица 1 показывает, что общее количество фенольных соединений варьировалось от 2,3 μ г / г до 61,26 μ г / г, в порядке HE μ г / г до 225,00 μ г / г, порядок был CE мк г / г.

3.2.

Учитывая присутствие фенольных соединений и понимание того, что эти фитохимические вещества могут быть связаны с антиоксидантной активностью, антиоксидантный потенциал каждого из шести экстрактов C. alnifolia был проанализирован с использованием четырех анализов: общая антиоксидантная способность ( TAC), метод свободных радикалов DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразилгидрат), тест на снижение мощности и активность по улавливанию супероксида.

Анализ TAC оценивал способность образца отдавать электроны и, таким образом, нейтрализовать реактивные частицы. Самые высокие значения TAC были обнаружены для ME (111,38 EEAq мг) и EE (96 EEAq мг). WEE (58,25 EEAq мг) и WE (59,89 EEAq мг) представили эквивалентные результаты (рисунок 1 (a)). Для анализа DPPH антиоксидантная активность варьировала от 49% до 114% (рис. 1 (b)). Более того, полярные экстракты показали самую высокую активность для анализа восстанавливающей силы, для которого значения варьировались от 83,9% до 105.4% (рисунок 1 (в)). Аналогичный результат также наблюдался для анализа улавливания супероксидных радикалов, где самые высокие значения наблюдались для полярных экстрактов, и эти значения варьировались от 76,4% до 91% (рис. 1 (d)).

показал положительную корреляцию между содержанием фенольных соединений в экстрактах C. alnifolia и антиоксидантными анализами. Наблюдалась сильная корреляция между TAC и анализом восстановительной мощности (см. Табл. 1) и умеренная корреляция с улавливанием супероксидных радикалов.Кроме того, содержание сахара показало очень сильную корреляцию для анализа снижения мощности и TAC и умеренную корреляцию с улавливанием супероксидных радикалов (см. Таблицу 1).

3.3.

Данные описанных выше антиоксидантных анализов побудили нас провести антиоксидантные анализы in vivo . Однако перед проведением этих анализов необходимо было оценить токсический потенциал этих экстрактов, чтобы исключить возможное вредное воздействие на животных, использованных в экспериментах in vivo .Затем были проанализированы их эффекты на неопухолевые клетки 3T3 и пять линий опухолевых клеток, HeLa, SiHa, PC-3, B16-F10 и PANC-1. После этого Caenorhabditis elegans использовали в качестве модели in vivo .

3.3.1. Жизнеспособность клеток

Для клеточных линий было оценено влияние шести экстрактов на три концентрации (100 μ г / мл, 250 μ г / мл и 500 μ г / мл) (Рисунок 1) . Эти экстракты не влияли на жизнеспособность клеток ни при одной из трех проанализированных концентраций.Однако для ME и WEE наблюдалось снижение жизнеспособности неопухолевых клеток примерно на 25-35% (ME при 250 или 500 μ г / мл и для WEE при 500 μ г / мл) ( Таблица 2). Кроме того, для линий опухолевых клеток в целом не было значительного изменения жизнеспособности клеток. Снижение жизнеспособности клеток на 10-25% для HE, CE и WE наблюдалось для клеточных линий HeLa и SiHa (таблица 2). Таким образом, в целом для неопухолевых и опухолевых клеточных линий экстракты C. alnifolia не были цитотоксичными по отношению к модели in vivo клеточной линии .