Как выглядит выписка из егрн: Выписка ЕГРН на квартиру. Какие сведения содержит и для чего нужна

Содержание

как выглядит, стоимость, онлайн выписки на ktotam.pro

Покупая дом, нужно помнить, что вместе с ним приобретается и земельный участок, на котором он расположен. Поэтому потенциальному покупателю необходимо провести двойную проверку как самого статуса жилого здания, так и правовой основы земельного надела. Здесь поможет не только выписка из ЕГРП на дом, но и справка из ГКН или кадастровая документация. Все это поможет избежать факт мошенничества с землями и домом, если таковой присутствует со стороны продавца, а также миновать споры с соседями по поводу межевания земли и установления границ.

Однако стоит отметить, что с 2017 года для упрощения процесса получения информации относительно имущества, все сведения касательно ЕГРП и ГКН объединили в один документ - выписку из ЕГРН.

Заказать выписку из ЕГРП на дом

Земельные участки также имеют свою классификацию. Например, на землях сельхозназначения можно строить дачи, но нельзя строить жилые здания для круглогодичного проживания. А вот для того, чтобы построить жилой малоэтажный дом или коттедж, то нужно купить земли под индивидуальную жилищную застройку. Все это можно проверить в кадастровых сведениях.

Обычно покупателю предъявляют кадастровый паспорт с интересующими его сведениями и уникальным номером, присвоенным участку Госкадастром недвижимости. Также любому желающему доступна выписка ЕГРП на жилой дом по запросу физического или юридического лица.

Официальный документ будет содержать следующие сведения на дом и прилегающий к нему земельный участок:

  • наименование документа;
  • назначение земельного участка;
  • адрес объекта недвижимости;
  • адрес и кадастровый квартал земельного участка;
  • категория земель;
  • наименование и площадь объекта недвижимости;
  • информация о собственнике;
  • сведения о наличии обременений, притязаний, установленных судом ограничений по распоряжению землей;
  • ФИО заявителя для физических лиц;
  • наименование организации для юридических лиц.

Где получить выписку из ЕГРП на жилой дом

Любой желающий может заказать выписку ЕГРП на дом, обратившись лично или через своего доверенного представителя в Росреестр, ГКН или МФЦ. Для этого потребуется предъявить паспорт, заполнить письменное заявление и оплатить госпошлину. В течение 5-7 дней вам выдадут документ на руки, заверенный печатью регистратора и подписью выдавшего бумагу сотрудника. Если вы подадите запрос по почте, то выписка придет на ваш адрес проживания или регистрации.

Современные технологии позволяют отправить заявление и получить выписку, не выходя из дома. Электронный вариант выписки вы можете получить, заполнив онлайн-форму заявления на официальном сайте Росреестра либо отправив запрос по электронной почте. Хоть запрос отправляется онлайн, все равно заявитель должен оплатить госпошлину в обычном порядке. Однако и в данном случае выписку вы получите не в день обращения, а в течение 5 рабочих дней.

Если же выписка вам нужна срочно, но вы не хотите платить двойной тариф за ее получение, вы можете обратиться в наш онлайн-сервис и получить документ уже через полчаса. Мы гарантируем подлинность сведений, так как вся информация поступает только из Росреестра, а сама выписка носит статус официального документа.

Автор: проект Кто Там

4.5

6177

0

Оцените статью

Заказать отчет об объекте недвижимости

Выписка из ЕГРН - образец как выглядит выписка из ЕГРН

  1. Главная
  2. Полезные статьи
  3. Как выглядит выписка из ЕГРН

С начала 2017 года, главной бумагой, подтверждающеё ваше право на ту или иную недвижимость стала выписка из Единого государственного реестра недвижимости (ЕГРН), выписка из ЕГРН (образец), это документ, подтверждающий ваши полномочия на владение, продажу и передачу недвижимости.

Информация, расположенная в выписке из ЕГРН, является доступной каждому гражданину, кроме тех данных, которые запрещены к массовому разглашению, в соответствии с законодательством Российской Федерации.

Все сведения, имеющиеся в ЕГРН, различаются по форме и содержательной части, что делает каждую бумагу индивидуальной. Выписки могут быть выданы как в цифровом, так и в бумажном варианте.

Любой гражданин обладает правом на её получение, для этого необходимо самостоятельно обратиться в органы Росреестра и, собрав все необходимые документы, подать заявку на получение выписки. Также, можно обратиться к профессиональным специализированным интернет-сервисам, осуществляющим получение выписки в короткие сроки.

Форма выдачи и образец составления

Бланк отчёта из ЕГРН (ЕГРП) представляет собой акт, содержащий структуру данных из Росреестра недвижимости, включающий в себя сведения обо всей недвижимости на территории Российской Федерации. Внешний вид выписки и её структура напрямую зависит от типа недвижимости, на которую она оформляется, будь это квартира, земельный участок и дом.  

Всё содержание подобной бумаги составлено исключительно на русском языке. В содержание выпиcки входит такая информация из Росреестра как:  

  • Номер вашего кадастрового округа, в котором расположена недвижимость.
  • Номера кадастровых районов, входящих в кадастровый округ.
  • Номера кадастровых кварталов, которые содержаться в кадастровых районах.
  • Наименования кварталов, округов и районов кадастра.
  • Чёткое описание утверждённых границ кадастрового деления.
  • Детальное оформление границ кадастровых кварталов, районов и округов с указанием базисов деления кадастра.
  • Все координаты кадастровых единиц и их разграничений.
  • ФИО конкретного адресата выписки.
  • Основания для возникновений правомочий у владельцев недвижимого имущества.
  • Другая, учётно-техническая информация о собственности.

Образец документа

Для того, чтобы лучше понять, как выглядит бумага, предоставляемая ЕГРН, лучше всего рассмотреть на примере.

Документ указывает на вид недвижимого объекта (участок, дом, квартира), номер по соответствующему кадастру, месторасположение участка, дата регистрации, собственник и их количество, вид права на собственность и доля имущества, дата, когда права были зарегистрированы, регистрационный номер. Кроме того, документ содержит колонку, в которой указаны номер, дата и потенциальные основания для лишения прав на имущество. Все эти сведения заполнены в специальных колонках, для упрощения понимания сведений. Выписка детально посвящает собственника во все необходимое, что он должен знать о своих владениях. Это не исчерпывающее описание акта, он может быть разным, в зависимости от типа владений.

Какие бывают выписки?

Существуют разные формы актов из ЕГРН. Перед подачей документов для получения бумаги, следует определиться для чего она необходимаи какие сведения должна содержать. Существует четыре вида подобных документов:

  • Общая характеристика вашего недвижимого владения, подтверждающие ваши права на владение данной недвижимостью.
  • Передача от одного владельца к другому.
  • Установка прав на владение той или иной собственностью.
  • Даты оформления и регистрации собственности.

В бумаге будет предоставлена вся та информация, которая будет запрошена клиентом, но только та, которой располагает государственный реестр Российской Федерации. В связи с этим, не стоит тратить средства на документ, не обладающий всеми сведениями, что необходимы именно вам в данный момент.

Вне зависимости от бумажной и цифровой формы выдачи, документ будет содержать в себе одинаковые сведения. В случае, если вам необходима выписка о земельном участке, Росреестр предоставит вам план кадастрового распределения, на котором будут указаны все близлежащее, недвижимые объекты.     

Где их получить и в какой форме?

Процесс выдачи выписок осуществляется при подаче всей необходимой информации заказчиком в той форме, которую он потребует. Это может быть электронная форма, без печати Росреестра, такой документ будет отправлен на вашу электронную почту в формате XML, для этого вам будет необходимо предоставить все документы, отправив их на электронную почту или скинув на цифровой носитель. В бумажном варианте, выписка будет предоставляться заверенной круглой синей печатью с гербом, и будет подписано ответственным лицом, управляющим Росреестром.

В целом, на содержание выписки это никак не влияет, и не имеет большого значения.

Значение документа

Бумага помогает подтверждать ваши законные права на владение имуществом, его куплю-продажу или передачу, также указывает все общие характеристики имущества и общую информацию о нём. С его помощью вы можете проверить и подтвердить указанные в других источниках сведения об объекте, так как он является самым достоверным и надёжным документом, содержащим информацию о недвижимости.

Если Вам нужно быстро и без проволочек получить обычную или расширенную выписку из ЕГРН – наш сайт, это то, что Вам нужно!



Интересные статьи по этой теме:

 Как узнать кадастровый номер объекта - расшифровка кадастрового номера недвижимости 

Как узнать кадастровый номер земельного участка - что можно узнать по кадастровому номеру

 Границы участка по кадастровому номеру - проверить межевание участка по кадастровому номеру на егрнсправка.рф

Как выглядит выписка на право собственности квартиры

Последнее обновление: Практически, ни одна сделка купли-продажи квартиры не обходится без заказа выписки из этой базы данных. В ЕГРН содержится как учетно-техническая информация обо всех объектах недвижимости России данные из кадастра , так и данные о правах и переходах прав на эти объекты данные из реестра прав. Выписки из ЕГРН бывают нескольких типов, то есть они могут содержать разные типы сведений в зависимости от запроса , например: об основных характеристиках и зарегистрированных правах на объект недвижимости Выписка из ЕГРН-1 — бывш. Существуют и другие типы выписок из единого реестра, но к сделкам купли-продажи квартир они не имеют отношения. Остальные типы выписок могут интересовать Покупателя только в некоторых случаях.

Дорогие читатели! Наши статьи рассказывают о типовых способах решения юридических вопросов, но каждый случай носит уникальный характер.

Если вы хотите узнать, как решить именно Вашу проблему - обращайтесь в форму онлайн-консультанта справа или звоните по телефонам, представленным на сайте. Это быстро и бесплатно!

Выписка ЕГРН на квартиру. Какие сведения содержит и для чего нужна

Номер кадастрового квартала в котором находится квартира. Дата присвоения кадастрового номера — дата постановки на кадастровый учет. Ранее присвоенный государственный учетный номер. Заполняется, если имелся номер до образования Росреестра или какой-то номер был присвоен в БТИ.

Адрес в выписке заполняется в соответствии с информацией, переданной из органов местной администрации. Указывается полная площадь, без деления на жилую и нежилую. Обычно по данным БТИ или разрешительной документации на дом. Для квартиры всегда указывается: Жилое помещение. Назначение указывается на усмотрение кадастрового инженера.

Номер этажа. Если стоит фраза "данные отсутствуют" и номер этажа, то всё хорошо — это внутренний регламент заполнения выписки. Вид жилого помещения. Обычно указывают: квартира или данные отсутствуют. Кадастровая стоимость заполняется в соответствии с последней кадастровой оценкой. Кадастровые номера иных объектов, в пределах которых расположен объект. Указывается кадастровый номер дома. Виды разрешенного использования. Для квартиры всегда ставится "данные отсутствуют".

Сведения об отнесении жилого помещения к определенному виду жилых помещений. Это графа касается государственного или муниципального жилищного фонда в случае его отнесения к специализированному жилищному фонду.

Статус записи об объекте недвижимости. Особые отметки. Заполняется, если: право собственности в Росреестре не зарегистрировано, не имеется поэтажного плана, разная информация в базах ЕГРП о правах и ГКН кадастровые характеристики , устранена техническая ошибка и прочая информация. Получатель выписки. Поэтому может стоять любая фамилия, даже не собственника.

Графа просто информационная. Фамилия, инициалы, должность сотрудника, подготовившего выписку ЕГРН на квартиру. Лицо, которое владеет квартирой на каком-либо праве. Если собственник Россия или город, то часто данные отсутствуют. Вид, номер и дата государственной регистрации права. Указывается: вид права собственность, долевая собственность или совместная, оперативное или доверительное управление , дата и номер регистрации права в Росреестре.

Документы, на основе которых собственник регистрировал своё право в Росреестре договор купли-продажи, дарения, свидетельство на наследство. Заполняется, если выписку получает собственник квартиры или доверенное лицо.

Ограничение прав и обременение объекта недвижимости. Указывается: вид ограничения: аренда, ипотека, запрещение сделок с недвижимостью, арест, социальный найм и др. Указывается в нескольких форматах. Например, кто выдал ипотеку, кто арендует объект, кто наложил ограничение или арест.

Заполняется в случае подачи в Росреестр судебных документов об оспаривании права. Сведения о возражении в отношении зарегистрированного права.

Заполняется, если в Росреестр от заинтересованного лица подано заявление о возражении в регистрации права. Сведения о наличии решения об изъятии недвижимости для государственных нужд. Если принято решение об изъятии, указывается орган, принявший решение и его дата и номер. Сведения о невозможности регистрации без личного участия правообладателя. Заполняется, если собственник подал в Росреестр соответствующее заявление. Правопритязания и сведения о наличии поступивших, но не рассмотренных заявлений о регистрации права.

Например, поступило заявление о купли продаже или ипотеке, но в Росреестре по каким-либо причинам не было рассмотрено. Сведения об осуществлении регистрации сделки, права, без согласия третьего лица.

Например, если не представлено необходимое согласие государственного органа, третьего лица, юридического лица, органа опеки и т. Поэтажный план квартиры имеется только в расширенной выписке ЕГРН. Данная выписка обычно готовится в течение дней. На усмотрение сотрудника Росреестра может быть отражена только квартира или весь этаж здания.

Если выписка получена в электронном виде, то поэтажный план квартиры может идти отдельным файлом, подписанным ЭЦП. Как выглядит выписка егрн на квартиру Понравилась публикация? Поделитесь с друзьями и коллегами.

Расширенная выписка из ЕГРН — что это и как ее получить Как получить, стоимость. Заказать расширенную выписку из ЕГРН через интернет.

Номер кадастрового квартала в котором находится квартира. Дата присвоения кадастрового номера — дата постановки на кадастровый учет. Ранее присвоенный государственный учетный номер. Заполняется, если имелся номер до образования Росреестра или какой-то номер был присвоен в БТИ. Адрес в выписке заполняется в соответствии с информацией, переданной из органов местной администрации. Указывается полная площадь, без деления на жилую и нежилую.

Право онлайн

Возможность получения выписки о праве собственности на жилье онлайн удешевит процедуру оформления документов, сократит сроки регистрации. Легче будет бороться с коррупционными проявлениями в этой сфере, говорят эксперты. Вместо свидетельств подтверждать право на собственность дома, квартиры или участка будет выписка из Единого государственного реестра прав ЕГРП. Ее к тому же можно получить не только по старинке, на бумаге, но и в электронном виде.

Выписка из ЕГРП (ЕГРН) на квартиру – Что? Где? Чьё?

Если информация из них совпадает с данными из выписки — перед вами владелец земли или квартиры. Если данные различаются — задайте уточняющие вопросы, почему так. Возможно, квартиру продают через представителя. В этом случае стоит проверить документ представителя. Срок документа представителя может истечь и тогда лучше не заключать сделку.

Автор статьиМитрофанова СветланаЮрист.

Сведения из ЕГРН общедоступны и могут быть предоставлены любому заинтересованному лицу, за исключением информации, которая в соответствии с действующим законодательством Российской Федерации, запрещена для массового ознакомления. Данные, содержащиеся в государственном реестре, различны по виду и содержанию, и могут предоставляться в электронном и бумажном виде. Лицо вправе получить необходимые сведения из ЕГРН, обратившись в органы Росреестра или МФЦ, самостоятельно , через посредника, с помощью средств почтовой связи, или используя Интернет-ресурсы. Для направления запроса заявитель должен собрать определенные документы, оплатить государственную пошлину, после чего в установленные законом сроки , заинтересованный гражданин сможет получить выписку по указанному им адресу. Сведения из Единого государственного реестра недвижимости Сведения, которые содержатся в Едином государственном реестре недвижимости ЕГРН , представляют собой достоверную информационную систему, в графической и текстовой формах, об объектах недвижимого имущества. Ведение ЕГРН осуществляется исключительно на русском языке, в электронном формате. Данные, которые содержатся в государственном реестре прав, являются общедоступными и предоставляются на основании запроса заинтересованных лиц в виде выписок. Государственный реестр состоит из: Книг учета документации. Кадастра и реестра прав, включая данные об обременениях и ограничениях объектов недвижимости. Сведений, посвященных границам зон особо охраняемых природных территорий, охотничьих угодий, игорных площадок, лесничеств, лесопарков, территорий объектов культурного наследия и др.

Расширенная выписка из ЕГРН – что это и как ее получить

.

.

.

Образец выписки из ЕГРП на недвижимое имущество. Документ содержит информацию о государственной регистрации права на недвижимое.

Выписка из Единого государственного реестра недвижимости (ЕГРН)

.

Полный разбор выписки из ЕГРН на квартиру

.

Выписка о переходе права ЕГРН на недвижимость

.

.

.

.

Как выглядит выписка из ЕГРН на совместную собственность

Если собственность находится во владении нескольких лиц — это называется общая собственность. В свою очередь общая собственность может быть долевой и совместной. У супругов, если они не заключали между собой соглашений и брачных договоров и приобрели недвижимость, например, квартиру в период брака возникает совместная собственность. При совместной собственности нет долей.

В этой статье разберемся с правовым режимом совместной собственности супругов. А также посмотрим наглядно как выглядит информация Росреестра из реестра недвижимости в выписке из ЕГРН.

Если вам нужно заказать выписку из ЕГРН — пройдите по этой ссылке.

Отличия долевой от совместной собственности

Для удобства восприятия представим различия между совместной собственностью и долевой в таблице:

Долевая собственность Совместная собственность
Может быть у любых граждан, в том числе и у супругов. Например, если супруги заключили брачный договор. Может быть только у 2-х лиц — супругов
Каждый собственник имеет права на свою четко определенную долю в праве собственности. Например, 1/3, 1/16 и т.п. Конкретные доли не выделяются. Каждый имеет равные права.
Расходы по содержанию имущества распределяются пропорционально доли. Расходы распределяются солидарно.
Продать свою долю можно. При этом другие сособственники имеют право преимущественной покупки. Без согласия супруги или супруга продать нельзя.

Выписка из ЕГРН на квартиру (совместная собственность супругов) — пример с фото

Ниже на фото представлена выписка из ЕГРН на квартиру, которая принадлежит мужу и жене на праве совместной собственности.

Из выписки мы видим, что:

  • квартира принадлежит супругам. Об этом можно сделать вывод по записи «совместная собственность», а также по тому, что фамилии одинаковы;
  • квартира находится в ипотеке у «Альфа-Банка».

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:

Росреестр Онлайн – Выписка из ЕГРН (ЕГРП) за 5 минут

Что такое

выписка из ЕГРН?

Выписка из ЕГРН — это официальная справка с информацией о квартире, доме или земельном участке. С помощью этой справки любой желающий может узнать сведения о любой недвижимости, находящейся на территории России, независимо от прав собственности на этот объект.

ЕГРН — Единый Государственный Реестр Недвижимости. В реестре хранятся все данные о квартирах, земельных участках и домах. Как только происходит какая-то операция с недвижимостью, данные в обязательном порядке заносятся в реестр и становятся доступными для всех желающих. Таким образом государство защищает граждан от мошенничества при сделках с недвижимостью.

Для чего нужна

выписка ЕГРН?

Перед покупкой или продажей недвижимости важно убедиться, что площадь не находится в залоге, не арестована и не принадлежит постороннему лицу. Единственный законный способ это проверить — заказать справку из ЕГРН.

Справка из ЕГРН также потребуется для оформления кредита, наследства или налогового вычета на квартиру, во время приватизации или судебного разбирательства, а также для других операций с недвижимостью.

Что я узнаю из 

выписки ЕГРН?

В выписке из ЕГРН вы найдете основные технические данные и сведения о зарегистрированных правах на квартиру, дом или участок: кадастровую стоимость, описание местоположения, план помещения на этаже, действующих и прошлых владельцах, форму права и обременения.

Какие бывают

выписки из ЕГРН?

Для проверки квартиры, земельного участка, дома и другой недвижимости существует две основные справки:

  • Справка из ЕГРН об объекте недвижимости
  • Справка из ЕГРН о переходе прав на недвижимость

Из справки об объекте недвижимости вы узнаете технические сведения, собственников, а также наложены ли на квартиру, дом или участок обременения, аресты и другие ограничения.

Из справки о переходе прав на недвижимость вы узнаете полную историю всех собственников. Эта информация поможет как минимум в двух случаях:

  • Если квартира часто переходила от одного собственника к другому несколько раз — что-то здесь не так. Проверьте собственников.
  • На права на площадь может претендовать другой человек по наследству (о чем вы можете не знать). Если на квартиру, дом или участок претендует наследник, то оспорить свое право на жилье он может только в течение трех лет. Проверьте, сколько времени недвижимость принадлежала каждому собственнику.

Какой срок действия у 

выписки из ЕГРН?

Срок справки из ЕГРН законом не ограничен, но банки, нотариусы и налоговая, обычно, работают с документами не старше одного месяца. Чем справка новее, тем больше к ней доверия, ведь с момента её оформления сведения о недвижимости могли измениться.

Например, 1 сентября вы сделали выписку на квартиру — в ней указан владелец Иванов. 7 сентября вы решаете купить эту квартиру, но за этот момент Иванов уже продал квартиру другому собственнику, сведения в Росреестре обновились. В такой ситуации ваша справка будет иметь устаревшие данные, о которых вы узнаете только когда получите новую выписку.

Можно ли доверять чужим справкам?

Мы не рекомендуем доверять справкам, сделанным действующим собственником недвижимости (или тем, кто теоретически может быть заинтересован в обмане). Всегда заказывайте выписку самостоятельно. Только в этом случае вы можете быть уверены в достоверности информации.

Заменяет ли

выписка из ЕГРН свидетельство права собственности?

Да, заменяет. Свидетельство о регистрации права собственности выдавали только до 2016 года. После этот документ заменили выпиской из ЕГРН. Выписка из ЕГРН — официальный документ Росреестра, подтверждающий права на собственность и заявленные при сделке данные.

Чем электронная

выписка из ЕГРН отличается от бумажной?

Бумажная и электронная версии документа ничем не отличаются юридически. Бумажный документ заверен ручной подписью, электронный — цифровой подписью Росреестра (файл с расширением . sig). Оба метода заверки документа одинаково законны.

Разница только в удобстве. За бумажной выпиской придется ехать в офис Росреестра, стоять в очереди и ждать справку неделю. Электронную же выписку можно заказать на нашем сайте не выходя из дома. При этом выписка будет оформлена за полчаса.

Могу ли я получить

выписку из ЕГРН на квартиру в другом городе?

Да, можете. Ваше местонахождение, прописка и право собственности на интересующий объект недвижимости никак не влияют на возможность заказать выписку. Выписку из ЕГРН может получить любой гражданин на любую недвижимость на территории России.

Отчет из ЕГРН об основных характеристиках и зарегистрированных правах

Выписка из ЕГРН об основных характеристиках и зарегистрированных правах – это документация, которая наполнена конкретной информацией о неком объекте недвижимости. Данные являются доступными для всех, и хранятся в ЕГРН (единый государственный реестр недвижимости). Год введения этой документации – 2017.

Формы

Описываемый документ может быть выдан в разных формах. Каждая из них закреплена законодательством:

  • об основных характеристиках и зарегистрированных правах на имущество;
  • о том, что права перешли к другому владельцу;
  • о существующих законных правах конкретного лица на то или иное имущество;
  • о том, когда (число, месяц, год) было получено заявление о кадастровом учете, а также регистрируемые процедуры по правам на объекты;
  • о территориях, где имеет место быть особое использование;
  • когда правообладатель признается недееспособным или ограниченным в правах;
  • о зарегистрированных детских дошкольных учреждениях.

Кроме вышеперечисленных форм, есть и другие. Выписка может предоставляться как кадастровый план участка, уведомление об отсутствии необходимых данных, справка о конкретном лице, получившем данные из ЕГРН и решения об отказе в выдаче информации.

Какова цена услуги

Вся информация из Государственного реестра предоставляется за деньги. Итоговая стоимость зависит от нескольких критериев:

  • Регион, в котором сформировали запрос на выписку;
  • Тип самой выписки.
В течение скольких дней будет выдан документ

Срок выдачи выписки из ЕГРН регламентируется в законе. При подаче заявления в онлайн форме, документ поступит на почту получателя в электронном варианте в день оформления заявки.

Как выглядит выписка из ЕГРН

Как уже упоминалось ранее, документ может выдаваться в электронном виде. Если сравнивать новую версию документации с устаревшей кадастровой выпиской, можно увидеть отличия.

В обычной выписке имеется три пункта, которые носят конкретную информацию по объектам.

1. Описание объекта (характеристика)

Сверху документ состоит из No документа и даты выдачи. Далее идут данные:

  • вид недвижимости;
  • число, месяц и год, когда был присвоен кадастровый номер;
  • ранее имеющийся кадастровый номер;
  • кадастровый номер строительного объекта (здания, помещения), где находится квартира;

Далее идет указание основной информации о недвижимости. Это название (наименование), адрес, этаж, показатели площади, цель использования (для чего предназначается) и т.д.

Ниже обозначено описание заказчика документа, а именно его ФИО.

2. Зарегистрированные права

Второй раздел включает вот эти детали:

  • дата и номер выписки;
  • фамилию или наименование юр. лица;
  • кадастровый номер;
  • вид, номер и дату, когда была проведена регистрация.

Тут же имеется информация об существующих обременениях, наложенных на имущество.

3. План расположения: этаж, либо земельный участок (для сооружений)

Отображение объекта выполняется в виде графического изображения. Дополнительно указаны условные обозначения к описанию.

Выписка из ЕГРН в зависимости от типа недвижимого объекта имеет свои особенности:

На квартиру – документ содержит информацию о форме права собственности, о том, сколько помещений в квартире, сколько этажей в доме, где расположены квадратные метры, и т.д.

На квартиру в нововозведенном доме (новостройки) – информируют о сведениях кадастрового учета на дом. Оформление прав на собственность доступно только после введения нового дома в эксплуатацию.

На земельный участок – отображается информация о категории земель, виде целевого назначения, а также о разрешенном пользовании землей. Ну и, конечно же, такой документ не может не содержать параметры характерных точек границ.

Сотрудники подмосковных МФЦ заверяют электронные выписки из ЕГРН на бумаге

Сотрудники многофункциональных центров Подмосковья заверяют документы на бумажном носителе, подтверждающие содержание электронных документов, включающих сведения Единого государственного реестра недвижимости (ЕГРН), сообщает пресс-служба управления Росреестра по Московской области.

«Управление Росреестра по Московской области напоминает получателям государственных услуг Росреестра, что многофункциональные центры предоставления государственных и муниципальных услуг (МФЦ), расположенные на территории Московской области и предоставляющие государственные услуги Росреестра, продолжают реализацию полномочий по заверению документов на бумажном носителе, подтверждающих содержание электронных документов, включающих сведения Единого государственного реестра недвижимости», – говорится в сообщении.

В соответствии с положениями постановления Правительства РФ от 18.03.2015 № 250 документы на бумажном носителе, составленные МФЦ и подтверждающие содержание электронных документов, направленных в МФЦ по результатам оказания государственной услуги по предоставлению сведений из ЕГРН, признаются экземпляром такого электронного документа на бумажном носителе, поясняется в материале.

В нем добавляется, что МФЦ осуществляют подготовку выписки на бумажном носителе на основе выписки, полученной в электронном виде из ЕГРН. При подготовке выписки на бумажном носителе МФЦ обеспечивает неизменность информации, полученной из ЕГРН, а также заверение выписки с использованием печати МФЦ.

Как отметили в пресс-службе, что заверенная МФЦ в установленном порядке выписка из ЕГРН, кроме сведений, предоставленных органом регистрации прав, содержит дополнительные реквизиты (наименование и место нахождения МФЦ, выдавшего выписку, ФИО уполномоченного сотрудника, дату и время составления экземпляра электронного документа на бумажном носителе и реквизиты сертификата ключа проверки электронной подписи).

Вместе с экземпляром электронного документа на бумажном носителе по требованию заявителя ему предоставляется экземпляр электронного документа путем его записи на съемный носитель информации или направления экземпляра электронного документа по электронной почте. При этом идентичность такого экземпляра электронного документа экземпляру электронного документа на бумажном носителе заверяется уполномоченным сотрудником МФЦ с использованием усиленной квалифицированной электронной подписи, уточняется в пресс-релизе.

Уполномоченные сотрудники МФЦ несут персональную ответственность за идентичность сведений, содержащихся в экземпляре электронного документа на бумажном носителе, сведениям, содержащимся в электронном документе, на основе которого составлен экземпляр электронного документа на бумажном носителе, подчеркнули в пресс-службе. 

Читайте об МФЦ Подмосковья: виды услуг для граждан и предпринимателей>>

Неочищенный экстракт и фракции листьев Eugenia uniflora Linn показали противовоспалительную, антиоксидантную и антибактериальную активность

BMC Complement Altern Med. 2018; 18: 84.

, 1 , 1 , 2 , 2 , 2 , 2 , 3 , 4 , 5 , 5 , , , 5 и 1

Tamires Rocha Falcão

1 Кафедра биофизики и фармакологии, УФРН, Av.Senador Salgado Filho, S / N, Campus Universitário, Lagoa Nova, Natal, RN 59072-970 Бразилия

Aurigena Antunes de Araújo

1 Департамент биофизики и фармакологии, UFRN, Av. Senador Salgado Filho, S / N, Campus Universitário, Lagoa Nova, Natal, RN 59072-970 Бразилия

Луис Альберто Лира Соарес

2 Департамент фармацевтических наук, UFPE, Ресифи, PE Brazil

Rhayanne Thaís de Moraes

2 Департамент фармацевтических наук, UFPE, Ресифи, PE Бразилия

Isabelle Cristinne Ferraz Bezerra

2 Департамент фармацевтических наук, UFPE, Ресифи, PE Бразилия

Магда Райанни, Ассунсао, Феррейра

3 2 of Pharmaceutical Sciences, UFPE, Ресифи, PE Бразилия

Manoel André de Souza Neto

3 Департамент фармацевтики, UFRN, Natal, RN Brazil

Maria Celeste Nunes Melo

4 UFRN, Natal, RN Brazil

, RN Brazil

, RN Brazil

, RN Brazil

, RN Brazil

, RN Brazil

Raimundo Fernandes de Araújo, Jr

5 Отделение морфологии, UFRN, Natal, RN Brazil

Andreza Conceição Véras de Aguiar Guerra

5 Отдел морфологии, UFRN, Натал, RN Brazil

Juliana Silva de Medeiros

1 Отдел биофизики и фармакологии, UFRN, Av. Senador Salgado Filho, S / N, Campus Universitário, Lagoa Nova, Natal, RN 59072-970 Бразилия

5 Департамент морфологии, UFRN, Natal, RN Brazil

Gerlane Coelho Bernardo Guerra

1 и фармакология, УФРН, Av. Senador Salgado Filho, S / N, Campus Universitário, Lagoa Nova, Natal, RN 59072-970 Бразилия

1 Департамент биофизики и фармакологии, UFRN, Av. Senador Salgado Filho, S / N, Campus Universitário, Lagoa Nova, Natal, RN 59072-970, Бразилия

2 Департамент фармацевтических наук, UFPE, Ресифи, PE Бразилия

3 Департамент фармацевтики, UFRN, Natal, RN Brazil

4 UFRN, Natal, RN Brazil

5 Департамент морфологии, UFRN, Natal, RN Brazil

Автор, ответственный за переписку.

Поступило 24 июля 2017 г .; Принято 23 февраля 2018 г.

Открытый доступ Эта статья распространяется в соответствии с условиями Международной лицензии Creative Commons Attribution 4. 0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что вы должным образом укажете автора (авторов) и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажете, были ли внесены изменения. Отказ от лицензии Creative Commons Public Domain Dedication (http: // creativecommons.org / publicdomain / zero / 1.0 /) применяется к данным, представленным в этой статье, если не указано иное. Эта статья цитировалась в других статьях PMC.

Abstract

Предпосылки

Это исследование показало фитохимический состав и оценило противовоспалительную и обезболивающую активность неочищенного экстракта (CE) и фракций из E. uniflora листьев Linn.

Методы

Полифенолы, присутствующие в неочищенном экстракте (CE), во фракциях, обработанных водным (AqF) и этилацетатом (EAF), из E.uniflora Листья Linn были показаны с помощью хроматографического анализа с целью проведения фитохимической характеристики. Антибактериальную активность оценивали на основании минимальных ингибирующих концентраций (МИК), определенных с использованием метода разведения в агаре. Дозы 50, 100 и 200 мг / кг CE и фракций применялись для проведения моделей in vivo (самцы мышей Swiss, возраст 8–10 недель). Экспериментальную модель перитонита индуцировали каррагенаном после определения активности миелопероксидазы (MPO), общего глутатиона и малонового диальдегида (MDA), IL-1β и TNF-α с помощью спектроскопического анализа U V / VIS.Антиноцицептивную активность оценивали на основе модели абдоминальных корчей и теста с горячей пластиной. Результаты были статистически оценены с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони. Уровень статистической значимости составил p <0,05.

Результаты

Высокоэффективная жидкостная хроматография с детектором на фотодиодной матрице (HPLC-DAD) обнаружила различные концентрации галловой кислоты, эллаговой кислоты и мирицитрина в CE и фракциях, полученных из E. uniflora Linn листья (0,05–0,87% мас., 0,20–0,32% и 1,71–6,56% мас., соответственно). В целом, CE имел более низкие значения MIC, чем фракции, включая самые низкие значения MIC против штамма MRSA. CE и AqF также значительно снижали миграцию лейкоцитов и активность MPO ( p <0,05). Кроме того, AqF значительно снижал уровни IL-1β и TNF-α ( p <0,05). Кроме того, ХЭ и фракции проявляли антиоксидантный эффект ( p <0.05) и периферической анальгетической активности ( p <0,05).

Выводы

CE и фракции из листьев E. uniflora Linn проявляли антибактериальную, противовоспалительную, антиоксидантную и анальгетическую активность в проведенных анализах.

Ключевые слова: Eugenia uniflora Linn, противовоспалительное, антиноцицептивное, окислительный стресс, антибактериальный

Предпосылки

Eugenia uniflora Linn (Myrtaceae) - это вид, который известен как питанга и обычно Суринамская вишня) или питангейра (бразильская вишня). Кустарник встречается на Среднем Западе, Северо-Востоке, Юго-Востоке и Юге Бразилии [1, 2]. В бразильской народной медицине листья E. uniflora Linn используются в настоях, отварах и спиртовых экстрактах для лечения диареи, боли в животе, колик, кишечных инфекций, паразитов, лихорадки, гриппа, кашля, бронхита, беспокойства, высокого кровяного давления. и диабет [3, 4]. В других этноботанических исследованиях, в которых не указывалась используемая растительная часть, сообщалось об использовании этого вида для лечения лихорадки, гриппа, воспаления горла, воспаления зубов, головной боли, высокого артериального давления и высокого холестерина [5].

Согласно проведенным предварительным фитохимическим исследованиям, листьев E. uniflora Linn содержат алкалоиды, тритерпены, дубильные вещества, флавоноиды и антрахиноны [6]. В более подробных исследованиях гидролизуемые танины (эугифлорины D1 и D2, камптотин A, эноотеин B, гемин D, гиппоманин A), флавоноиды (афзелин, десмантин-1, мирицитрин, кверцитрин и гликозиды мирицетина и кверцетина (β) и терпеноиды) -ситостерин, бетулиновая кислота и центеллозид C) были идентифицированы и в некоторых случаях изолированы [7].

Хотя во многих исследованиях изучали E. uniflora , лишь в нескольких исследованиях изучалась возможная корреляция между фитохимическим составом этого двудольного растения и его биологической активностью. Исследование Schumacher et al. (2015) показали, что листьев E. uniflora Linn снижают индекс воспалительного инфильтрата в островках поджелудочной железы, поддерживая уровни инсулина в сыворотке крови и глутатиона в печени и снижая перекисное окисление липидов в сыворотке, а также снижая риск диабета у диабетиков без ожирения (NOD ) мыши [8].Богатая флавоноидами фракция (HE-Bu), полученная из листьев E. uniflora , снижает уровни TNF-α и IL-1β в сыворотке и заметно снижает экспрессию белков iNOS и COX-2 клетками подвздошной кишки в экспериментальной модели сепсиса in vivo [7 ]. Эфирное масло листа и изолированные терпеноиды из Eugenia uniflora Linn продемонстрировали анальгетический эффект in vivo, используя тест на сокращение живота у мышей, индуцированный уксусной кислотой и тестом с горячей пластиной [2].

Целью настоящего исследования было провести фитохимическую характеристику E.uniflora Linn листья, а также оценивают цитотоксичность, антибактериальную, противовоспалительную и обезболивающую активность неочищенного экстракта (CE) и полученных фракций из листьев E. uniflora Linn.

Методы

Травяной материал

Образец листьев E. uniflora Linn был собран в городе Ипожука (штат Пернамбуку, Бразилия). Вид был идентифицирован в гербарии доктором Ритой де Касиа Перейра, а образцы ваучера были депонированы в Агрономическом институте Пернамбуку (IPA) под номером 89989.Названия растений проверены http://www.theplantlist.org/.

Получение КЭ и обогащенных фракций

E. uniflora Листья Linn

E. uniflora Linn-листья ( 50 г) сушили, измельчали ​​и затем экстрагировали (10%, масс. / v ) смесью ацетон: вода (7: 3, v / об) путем турбо-экстракции в течение 20 мин при 5-минутные интервалы, каждый с 30-секундными циклами. Затем раствор концентрировали при пониженном давлении (RV10 Basic, IKA®).Полученный остаток замораживали (-80 ° C, 3 дня), а затем лиофилизировали (модель L101, Liotop®) с получением CE (выход 10 г). Приблизительно 10 г CE восстанавливали в воде (100 мл). Полученную водную фракцию распределяли еще двенадцать раз с помощью 10 мл этилацетата. Эти водные (выход 4 г) и этилацетатные (выход 2 г) фракции (далее называемые AqF и EAF) концентрировали, замораживали и лиофилизировали.

Приготовление растворов для анализа с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

с детектированием на фотодиодной матрице (HPLC-DAD)

50 мг КЭ и фракций взвешивали и переносили в мерные колбы на 25 мл.После добавления 20 мл сверхчистой воды (Elga®) в каждую колбу колбы переносили в ультразвуковую баню (Ultracleaner, Unique®) для достижения полного растворения. Через 15 мин каждую фракцию КЭ и каждую разбавляли до 1 мг / мл сверхчистой водой. Галловая кислота (чистота 96%, Sigma®) [8], эллаговая кислота из коры дерева (чистота 95%, Sigma®) [8] и мирицитрин (чистота 99%, Sigma®) [7] были использованы в качестве эталонов. СЕ, фракции и стандарты фильтровали через поливинилидендифторид (PVDF) 0.Мембрана 45 мкм (Macherey-Nagel®) перед анализом ВЭЖХ. Анализы ВЭЖХ проводили в трех экземплярах.

Хроматографические условия

Система Thermo Scientific (Ultimate 3000 Thermo Fisher Scientific®), оснащенная DAD (Thermo Fisher Scientific®), бинарным насосом (HPG-3x00RS, Thermo Fisher Scientific®), дегазатором и автоматическим пробоотборником, оснащенным 20 Петлю мкл (ACC-3000, Thermo Fisher Scientific®) использовали для проведения анализов ВЭЖХ. Программное обеспечение Chromeleon 6.8 (Dionex®) использовалось для сбора и обработки данных.

Хроматографическое разделение выполняли с помощью колонки C 18 (внутренний диаметр 250 мм × 4,6 мм, 5 мкм; Dionex®), которая была защищена защитной колонкой из того же материала (Phenomenex®). Градиентное элюирование достигалось изменением соотношения растворителя B (метанол с 0,05%, об., / об., Трифторуксусная кислота) к растворителю A (вода с 0,05%, об. / Об., Трифторуксусная кислота) при скорости потока 0,8 мл. / мин, в соответствии со следующей программой градиента: 10–25% B (10 мин), 25–40% B (5 мин), 40–70% B (10 мин), 75% B (5 мин) и 75 –10% B (1 мин).Разделение проводили в термостате колонок при температуре 23 ± 2 ° C. Длины волн 254 нм, 270 нм и 350 нм использовались для обнаружения эллаговой кислоты, галловой кислоты и мирицитрина, соответственно, в соответствии с максимальным поглощением, измеренным DAD.

Исследование in vitro

Антибактериальная активность

Антибактериальная активность CE и фракций была протестирована против важных с медицинской точки зрения грамположительных и грамотрицательных бактерий, имеющихся в Лаборатории медицинской бактериологии, UFRN, Бразилия.Грамположительная группа включала: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis INCQS 00016, Enterococcus faecalis ATCC 29212 и метициллин-резистентный штамм Staphylocuccus aureus, бразильский эпидермальный штамм [Mephelocuccus aureus ] . Грамотрицательная группа включала: Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis INCQS 00258 и Pseudomonas aeruginosa ATCC. Все эти бактерии предварительно поддерживались при -20 ° C и были реактивированы в бульоне для инфузии сердца мозга (BHI, HiMedia®, Индия) при 37 ° C в течение 24 часов.Бактериальные суспензии были стандартизированы до мутности, эквивалентной 0,5 стандартной пробирке МакФарланда, перед проведением антибактериального тестирования.

Минимальные ингибирующие концентрации (МПК) определяли методом разбавления агаром в соответствии с документом M07-A9 Института клинических и лабораторных стандартов [10] с некоторыми изменениями. Сначала готовили исходные водные растворы в ДМСО (50%, v / v) CE и фракций (25 мг / мл), которые затем фильтровали через стерильный раствор 0.Шприцевые фильтры с размером пор 22 мкм (Kasvi®, Бразилия). Затем последовательные объемы этих исходных растворов переносили в стерильные 15 мл пробирки, содержащие агар Мюллера-Хинтона (MHA, HiMedia®, Индия), разжиженный при 50 ° C. Затем растворы гомогенизировали и переносили в стерильные чашки Петри (диаметром 6 мм). Концентрация этих образцов варьировалась от 0,039 мг / мл до 2,5 мг / мл, при этом конечная концентрация ДМСО при наивысшей концентрации образца составляла (5% об. / Об.). Затем стандартизованные бактериальные суспензии разбавляли 1:10, и 2 мкл каждой разбавленной суспензии переносили в среду, содержащую КЭ или фракции, и инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов.Кроме того, контроль роста (MHA + иннокулят), контроль растворителя (MHA, содержащий 5% ДМСО) и контроль стерильности (MHA) инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов. Цефалотин, гентамицин и ванкомицин (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) использовали в качестве контрольных антибиотиков. МИК считалась самой низкой концентрацией экстракта или фракции, которая предотвращала видимый рост бактерий.

Исследования in vivo

Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья. Протокол был одобрен Комитетом по этике экспериментов на животных UFRN ( CEUA , номер разрешения: 001/2015).

Мыши

Самцов мышей Swiss в возрасте 8–10 недель (40 ± 2,0 г), полученных из Центра биологических наук UFRN Vivarium, содержали в стандартных условиях (например, 12-часовой цикл свет / темнота, 22 ± 0,1 ° C и 50 –55% влажности) при условии правильного кормления и воды ad libitum. Животные были акклиматизированы и подвергались 12-часовому голоданию и воде ad libitum перед экспериментами.Эвтаназию проводили подкожным введением тиопентала натрия в дозе 90 мг / кг (0,5%, Тиопентакс, Кристалия, Сан-Паулу, Бразилия).

Модель перитонита, индуцированного каррагинаном.

Мышей случайным образом распределяли на двенадцать групп ( n = 5 / группа). Чтобы оценить влияние CE и фракций на рекрутирование лейкоцитов в брюшную полость, мышей предварительно перорально обрабатывали носителем (0,9% физиологический раствор) / группой каррагинана, CE или фракциями (50, 100 и 200 мг / кг). ) или диклофенак (10 мг / кг).Через 30 мин внутрибрюшинно (внутрибрюшинно) вводили 0,25 мл 1% раствора каррагинана (Sigma-Aldrich, Сан-Паулу, Бразилия). Имитационная группа получала носитель (1 мл воды / 10 г, перорально) и 0,9% стерильный физиологический раствор внутрибрюшинно (0,1 мл / 10 г) [11]. Затем мышей умерщвляли через 4 часа передозировкой тиопентала натрия 90 мг / кг. Затем в каждую брюшную полость вводили по три мл физиологического раствора, собирали перитонеальную жидкость и разбавляли (1:20) раствором Турка. Общий подсчет лейкоцитов проводился для каждого образца с помощью счетной камеры Neubauer.Образцы хранили при -80 ° C для последующего анализа активности миелопероксидазы (MPO), а также уровней малонового диальдегида (MDA) и общего глутатиона.

Определение активности миелопероксидазы

Активность МПО измеряли согласно методике, описанной Krawisz et al. [12]. Аликвоту (100 мкл) каждого образца разбавляли в 2 мл гексадецилтриметиламмонийбромидного буфера (HTAB, Sigma Aldrich, Сан-Паулу, Бразилия) и гомогенизировали. Образцы обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут, затем центрифугировали при 10000 об / мин в течение 15 минут при 4 ° C, а затем подвергали трехкратному замораживанию-оттаиванию.Биохимические измерения проводились в двух экземплярах. Затем к контрольным образцам и образцам супернатанта в 96-луночных планшетах добавляли 7 мкл буфера HTAB. Затем в каждую лунку добавляли 200 мкл окрашивающего реагента (о-дианизидин дигидрохлорид) и регистрировали значения поглощения при 450 нм с помощью анализа Spectrocopical U V / VIS (Biotek, Сан-Паулу, Бразилия). Активность фермента МПО рассчитывалась на основе интерполяции стандартной кривой, построенной для МПО нейтрофилов человека и пероксидазы хрена.Единица MPO (U) была определена для разложения 1 нмоль / мин перекиси водорода при 25 ° C. Следовательно, результаты, полученные в анализах, выражали в единицах / мкл образца.

Определение общего содержания глутатиона

В соответствии с методом, описанным в [13], 100 мкл каждого воспалительного лаважа разбавляли 5% раствором трихлоруксусной кислоты (TCA) / дистиллированной воды, а затем гомогенизировали и центрифугировали при 10000 об / мин в течение 15 мин при 4 ° C. Каждое стандартное разведение (20 мкл), раствор TCA (20 мкл, Vetec, Сан-Паулу, Бразилия) для холостого опыта и супернатант каждого образца (20 мкл) добавляли в 96-луночные планшеты в двух экземплярах.Кроме того, в каждую лунку добавляли 15 мкл PBS-EDTA, 20 мкл раствора дитиобиснитробензойной кислоты (DTNB) и 140 мкл NADPH. После стадии инкубации при 30 ° C в течение 5 минут в каждую лунку добавляли 15 мкл раствора фермента и GSH-редуктазы (Sigma Aldrish, Сан-Паулу, Бразилия). Значения поглощения при 412 нм регистрировали с помощью анализа Spectrocopical U V / VIS (Biotek) в течение 3 минут. Общее содержание глутатиона рассчитывали на основе интерполяции стандартной кривой, которая была построена с очищенным глутатионом (γ-L-глутамил-L-цистеинил-глицин, GSH, Sigma Aldrish, São Paulo Brazil, G4251).Результаты этих анализов выражаются в нмоль / мкл образца.

Определение содержания МДА

Для оценки перекисного окисления липидов продуцирование МДА измеряли согласно [14]. Сначала 50 мкл каждого образца разбавляли 250 мкл 20 мМ буфера Tris HCl (Trizma hydrochloride, Sigma Aldrich, Сан-Паулу, Бразилия) в дистиллированной воде (20 мМ, pH 7,4). Образцы перитонеальной жидкости гомогенизировали и центрифугировали при 10000 об / мин в течение 10 минут при 4 ° C. Затем 750 мкл хромогенного реагента (10.К каждому образцу добавляли 3 мМ 1-метил-2-фенилиндол в ацетонитриле 3: 1) и 225 мкл HCl (37%). После стадии инкубации на водяной бане в течение 40 минут при 45 ° C образцы центрифугировали при 10000 об / мин в течение 5 минут при 4 ° C. Значения поглощения при 586 нм регистрировали с помощью спектроскопического анализа U V / VIS (Biotek, Сан-Паулу, Бразилия), и результаты интерполировали по стандартной кривой, которая была построена с 1,1,3,3-тетраэтоксипропаном (соединение который гидролизуется с образованием MDA при инкубации с HCl при 45 ° C).Результаты этих анализов выражаются в нмоль / мкл образца.

Анализ IL-1β и TNF-α

Перитонеальная жидкость (C-каррагинан, D-диклофенак, неочищенный экстракт CE, водная фракция AqF и фракция, обработанная EAF-этилацетатом) хранили при -70 ° C после экстракция, гомогенизация и обработка, как описано в другом месте [15]. Уровни IL-1β (диапазон обнаружения: 62,5–4000 пг / мл; нижний предел обнаружения: 12,5 нг / мл рекомбинантного мышиного IL-1β) и TNF-α (диапазон обнаружения: 62,5–4000 пг / мл; нижний предел обнаружения: обнаружение: 50 нг / мл рекомбинантного мышиного TNF-α) определяли с использованием коммерческих наборов для ELISA (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, USA ), как описано ранее [16].

Сначала планшеты для микротитрования покрывали в течение ночи при 4 ° C антителами против мышиного TNF-α и IL-1β. После того, как планшеты были заблокированы, образцы и стандарты добавляли в различных разведениях в двух экземплярах и инкубировали при 4 ° C в течение 24 часов. Планшеты промывали 3 раза буфером и затем в лунки добавляли антитела (биотинилированные овечьи поликлональные анти-TNF-α, анти-IL-1β, разведенные 1: 1000 1% буфером для анализа BSA). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, промывали и добавляли 50 мкл авидин-HRP (1: 5000).Цветной реагент о-фенилендиамин (50 мкл) добавляли через 15 мин и планшеты инкубировали в темноте при 37 ° C в течение 15–20 мин. Ферментативную реакцию останавливали с помощью H 2 SO 4 и измеряли оптическую плотность при 490 нм. Значения выражены в пг / мл.

Оценка антиноцицептивной активности

Тест с горячей пластиной

Тест с горячей пластиной использовался для измерения центральной анальгетической активности, и боль вызывалась теплом [17]. Мышей случайным образом распределяли на одиннадцать групп ( n = 5 / группа), и они получали: 10 мл / кг физиологического раствора (нормальная контрольная группа / без лечения), морфин (10 мг / кг, внутрибрюшинно) и CE, AqF. или EAF; с CE и группами фракций, получавших пероральные дозы 50 мг / кг, 100 мг / кг и 200 мг / кг их лечения.Затем каждую мышь помещали на горячую пластину (Insight, Сан-Паулу, Бразилия), поддерживающую температуру 55 ± 0,5 ° C. Регистрировали время, затрачиваемое животными на прыжок или лизание одной из задних лап. Задержки регистрировались с интервалами 30 мин, 60 мин, 90 мин и 120 мин после введения веществ.

Тест на спазмы в животе, вызванный уксусной кислотой

Боль вызывалась уксусной кислотой для измерения периферической анальгетической активности [18]. Мышей случайным образом распределяли на одиннадцать групп ( n = 5 на группу).Две группы получали пероральный физиологический раствор 10 мл / кг (нормальный контроль и контроль уксусной кислоты). Одна группа получала индометацин перорально (10 мг / кг). Остальные девять групп получали пероральные дозы CE (50, 100 или 200 мг / кг), AqF (50, 100 или 200 мг / кг) или EAF (50, 100 или 200 мг / кг). Ноцицепцию стимулировали i.p. инъекция уксусной кислоты (0,6% v / v), разведенной в сверхчистой воде, через 30 мин после обработки животных СЕ и фракциями, индометацином и контролем уксусной кислоты.Нормальный контроль получил i.p. введение физиологического раствора 10 мл / кг. После инъекции уксусной кислоты или физиологического раствора мышей помещали под перевернутые стеклянные воронки и записывали количество корчков, которые наблюдались в течение 20 минут.

Результаты экспериментов

Во время эксперимента регистрировали поведение и гибель животных.

Статистический анализ

Данные из контрольной группы считались исходными значениями. Все экспериментальные данные были записаны как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM).Результаты были статистически оценены с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони. Уровень статистической значимости составил p <0,05. Анализ результатов и построение графиков выполнялись с помощью GraphPadPrism версии 5.04.

Результаты

Хроматографические анализы CE и фракций

E. uniflora

Хроматографические анализы были выполнены с использованием ВЭЖХ. Галловая и эллаговая кислоты (мономеры гидролизуемых танинов) и флавоноид мирицитрин были обнаружены в СЕ и фракциях E.uniflora Льняные листья. Время удерживания (RT) галловой кислоты, мирицитрина и эллаговой кислоты в этих образцах составляло 8,7 мин (рис.), 23,3 мин (рис.) И 25,1 мин (рис.), Соответственно. Идентичность стандартов в образцах подтверждали корреляцией их RT. Таким образом, пики, соответствующие стандартам, были определены в образцах из листьев E. uniflora следующим образом: CE (пики: 1, 2 и 3; рис.), AqF (пик: 1; рис.) И ДСП (пики: 1, 2 и 3; рис.).

Хроматографические профили галловой кислоты (A), мирицитрина (B), эллаговой кислоты (C), CE (D), AqF (E) и EAF (F) E.uniflora Linn листья, как определено с помощью ВЭЖХ. CE: неочищенный экстракт, AqF: водная фракция, EAF: фракция, обработанная этилацетатом. Время удерживания (RT) галловой кислоты, мирицитрина и эллаговой кислоты этих веществ составляло 8,7 мин (пик 1), 23,3 мин (пик 2) и 25,1 мин (пик 3).

Содержание галловой кислоты, мирицитрина и эллаговой кислоты в CE и фракции также определяли в трех повторностях с использованием калибровочных кривых стандартов (y = 1,3038 × + 0,6907; R 2 = 0,9920; y = 1.4816 × - 2.200; 2 = 0,9916; у = 3.0007 × + 3.9969; R 2 = 0,9906 соответственно для галловой кислоты, мирицитрина и эллаговой кислоты). Эти значения приведены в таблице.

Таблица 1

Содержание химических маркеров, проанализированных в CE и фракциях листьев E. uniflora , как определено с помощью HPLC-DAD

Образцы Галловая кислота (%, w / w) Эллаговая кислота (%, мас. / Мас.) Мирицитрин (%, мас. / Мас.)
CE 0.459 (1,99) 0,200 (2,72) 1,713 (0,41)
AqF 0,328 (3,01) 0,035 (3,90) 0,061 (5,15)
EAF 0,323 (4,05) 6,560 (0,22)

Активность in vitro

Антибактериальная активность

В проведенных антибактериальных анализах КЭ и фракции E. uniflora Linn подавляли большинство тестируемых бактерий, за исключением MRSA, который не был восприимчив к CE на 2.5 мкг / мл, или Escherichia coli , который не был чувствителен ни к одному из тестируемых образцов (таблица). В целом, CE имел более низкие значения MIC, чем фракции, включая самые низкие значения MIC против штамма Staphylococcus epidermidis . Нормальный рост бактерий наблюдался во всех контрольных группах роста (MHA + иннокулят) и растворителях (MHA, содержащий 5% ДМСО). В контрольных группах стерильности (MHA) роста не наблюдалось.

Таблица 2

МИК КЭ и фракции E. uniflora Linn против грамположительных и грамотрицательных бактерий

0,6
Бактерии МИК образцов (мкг / мл) a
CE EAF AqF Цефалотин Гентамицин Ванкомицин
грамположительный
.250 ± 0 2.500 ± 0 2.500 ± 0 0,5 ± 0 ND ND
Staphylococcus epidermidis INCQS 00016 0,313 ± 0 0,25 ± 0 ND ND
Enterococcus faecalis ATCC 29212 1.250 ± 0 2.500 ± 0 2.500 ± 0 8.0 ± 0 9039 9039 9039 9039 MRSA NI 2.500 ± 0 2.500 ± 0 ND ND 2.0 ± 0
грамотрицательный Escherichia colherich NI NI NI ND 0,5 ± 0 ND
Salmonella enteretidis INCQS 00258 1,250 ± 0 2 500 ± 0500 ± 0 ND 0,125 ± 0 ND
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 1,250 ± 0 1,875 ± 0,88 2.500 ± 0 90D

Активность in vivo

Все животные имели отличное состояние здоровья, и они были включены в эксперименты. 100% рандомизированных животных экспериментальной модели включали в модель перитонита, индуцированного каррагенаном, тест с горячей пластиной и тест на спазмы брюшной полости, вызванные уксусной кислотой.Ни одно животное не было исключено из исследования. Побочных эффектов не обнаружено.

Миграция лейкоцитов

В анализах миграции лейкоцитов обработка CE, AqF и EAF во всех дозах приводила к значительному ингибированию миграции лейкоцитов по сравнению с группой каррагинана ( p <0,001 или p <0,01, рис.) .

Эффекты CE и фракций E. uniflora Linn в различных дозах на миграцию лейкоцитов в модели перитонита, индуцированного каррагинаном, по сравнению с группой каррагинана.Результаты выражены как среднее значение ± стандартная ошибка ( n = 5). Для расчета статистической значимости использовался тест ANOVA. ** p <0,01, *** p <0,001 по сравнению с группой каррагинана (C). S (имитация), C (каррагинан), D (диклофенак), CE (неочищенный экстракт), AqF (водная фракция), EAF (фракция, обработанная этилацетатом)

Активность MPO

Инфильтрация лейкоцитов оценивалась с обнаружением MPO уровни в перитонеальной жидкости. Как показано на фиг., Уровень МПО в группе положительного контроля был более чем в двенадцать раз выше (65 Ед / мкл), чем в группе отрицательного контроля / физиологический раствор (5 Ед / мл) ( P <0.001). После лечения диклофенаком наблюдалось значительное снижение уровней МПО по сравнению с группой положительного контроля ( P <0,001). Значительное снижение уровней активности МПО во всех дозах наблюдалось после лечения CE, AqF и EAF как следствие количества нейтрофилов.

Влияние CE и фракций (50, 100 или 200 мг / кг) E. uniflora Linn на активность МПО в модели перитонита, индуцированного каррагенаном, по сравнению с группой каррагинана.Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 5). Тест ANOVA был использован для расчета статистической значимости *** p <0,001 по сравнению с группой положительного контроля. S (имитация), C (каррагинан), D (диклофенак), CE (неочищенный экстракт), AqF (водная фракция), EAF (фракция, обработанная этилацетатом)

Общее содержание глутатиона

Общие уровни глутатиона определялись в перитонеальной жидкости образцы, чтобы оценить влияние КЭ и фракций E.uniflora Linn на окислительно-восстановительный гомеостаз. В группе положительного контроля общий уровень глутатиона снизился примерно в 8 раз по сравнению с группой отрицательного контроля. Напротив, введение CE и фракций в дозах 50 мг / кг, 100 мг / кг и 200 мг / кг увеличивало общий уровень глутатиона на 84% по сравнению с группой положительного контроля ( P <0,001) ( Инжир. ). Эти результаты предполагают, что CE и фракции E. uniflora Linn опосредуют антиоксидантную активность.

Эффекты CE и фракций (50, 100 или 200 мг / кг) E. uniflora Linn на уровни общего глутатиона (нмоль / мкл) в модели перитонита, индуцированного каррагинаном, по сравнению с группой каррагинана. Результаты выражены как среднее значение ± стандартная средняя ошибка ( n = 5). Тест ANOVA был использован для расчета статистической значимости *** p <0,001 по сравнению с группой положительного контроля. S (имитация), C (каррагинан), D (диклофенак), CE (неочищенный экстракт), AqF (водная фракция), EAF (фракция, обработанная этилацетатом)

Содержание MDA

MDA является одним из основных вторичных продуктов перекисное окисление липидов и является широко используемым биомаркером для оценки окислительного стресса.MDA - это диальдегид, который является побочным продуктом окисления полиненасыщенных жирных кислот путем бета-расщепления пероксидазы и, в основном, арахидоновой кислоты. Как показано на фиг. 1, уровни MDA были выше в группе положительного контроля по сравнению с обработанной группой и группой отрицательного контроля. Однако CE и фракции во всех дозах были способны значительно снижать уровни MDA ( p <0,001), тем самым указывая на то, что защитный эффект на перекисное окисление липидов опосредуется E. uniflora Linn листьями.

Влияние CE и фракций (50, 100 или 200 мг / кг) E. uniflora Linn на уровни MDA в модели перитонита, индуцированного каррагинаном, по сравнению с группой каррагинана. S (имитация), C (каррагинан), D (диклофенак), CE (неочищенный экстракт), AqF (водная фракция) и EAF (фракция, обработанная этилацетатом). Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего ( n = 5). Для расчета статистической значимости использовался тест ANOVA, * p <0,05), *** p <0.001 по сравнению с группой положительного контроля. # указывает на значительную разницу между группами, получавшими экстракты.

Влияние CE и фракций

E. uniflora Linn на цитоцины IL-1β и TNF-α.

Группы, подвергнутые CE, и фракции E. uniflora. Linn показал снижение уровней провоспалительного цитокина IL-1β (диклофенак, CE и фракции E. uniflora CE для всех доз, p <0,001, за исключением EAF при 200 мг / кг, p <0.01) и TNF-α (диклофенак, p <0,01, и AgF, все дозы, p <0,05) по сравнению с контролем каррагинана (фиг.).

Уровни воспалительных цитокинов IL-1β и TNF-. C (каррагинан), D (диклофенак), CE (неочищенный экстракт, 50, 100 или 200 мг / кг), AqF (водная фракция, 50, 100 или 200 мг / кг), EAF (фракция, обработанная этилацетатом, (50 , 100 или 200 мг / кг). Тест ANOVA был использован для расчета статистической значимости, * p <0,05), ** p <0.01 по сравнению с контрольной группой каррагинана. # указывает на значительную разницу между группами, получавшими экстракты.

Оценка антиноцицептивной активности.

В тесте горячей пластиной группа, получавшая морфин, проявляла центральное обезболивающее действие во всех временных интервалах; однако только доза группы, получавшей 200 мг / кг AqF, проявляла центральное обезболивающее действие с интервалом в 90 минут. Группа, получавшая AqF, не имеет дозозависимого профиля, и поэтому это может не быть связано с фармацевтической активностью AqF.Ни одна из других групп в другие промежутки времени не проявляла значимого центрального анальгетического действия (таблица).

Таблица 3

Оценка анальгетической активности E. uniflora CE и фракций в различных дозах

7,8 + 4,1 200 мг / кг
Назначенное лечение Начальный латентный период боли Латентный период боли в указанные моменты времени после введения
0 с 30 мин 60 мин 90 мин 120 мин
Нормальный контроль / без обработки 13 + 5.0 6,2 + 6,8 4,8 + 3,3 7,8 + 5,1 6,3 + 2,1
Морфин (10 мг / кг) 8 + 2,3 27 + 3,0 * 23 + 7,8 * 25 + 6,4 * 26 + 2,6 *
CE
50 мг / кг 7,6 + 3,2 12 + 9,3 8,6 + 6.2
100 мг / кг 8,4 + 2,3 8,4 + 6,0 18,6 + 7,4 6,2 + 6 8,4 + 4,6
200 мг / кг 10,6 + 3,0 8,4 + 5,0 15,6 + 11,1 10,8 + 10,7 12,6 + 6,3
AqF
9039 9.6 + 8,1 15,4 + 12,1 14,2 + 9,2
100 мг / кг 5,4 + 2,4 16,2 + 5,6 17,2 + 8,5 9,8 + 5,5 18,4 + 8,2
7,6 + 2,7 17,2 + 6,8 12 + 9,7 22,2 + 4,4 * 12,6 + 4,6
EAF 9039 мг / кг 7.6 + 2,1 15,2 + 7,7 8,8 + 5,5 6 + 3 10,2 + 6,5
100 мг / кг 5,4 + 2,1 8 + 1,9 5,8 + 2,9 5 + 2,7 3 + 1,5
200 мг / кг 6,2 + 3,5 15,2 + 2,7 8,8 + 2,8 6,2 + 2,9 8,4 + 2,5

Абдоминальное введение уксусной кислоты анализ корчей, введение физиологического раствора в нормальном контроле, индометацина, CE, AqF и EAF E.uniflora Linn привело к значительному снижению количества спазмов в животе по сравнению с контролем с уксусной кислотой ( p <0,001, рис. 7). Уксусная кислота показала статистически значимые различия, которые также наблюдались для нормального контроля ( p <0,001, рис.).

Антиноцицептивное действие индометацина, СЕ и фракций (50, 100 или 200 мг / кг) E. uniflora Linn в различных дозах на количество абдоминальных искривлений, наблюдаемых после введения уксусной кислоты.Данные выражены как среднее значение ± стандартная средняя ошибка ( n = 5). Для расчета статистической значимости использовался тест *** p <0,001 по сравнению с нормальным контролем; ### p <0,001 по сравнению с уксусной кислотой. NG (нормальная контрольная группа), AA (уксусная кислота), I (индометацин), CE (неочищенный экстракт), AqF (водная фракция), EAF (фракция, обработанная этилацетатом)

Результаты экспериментов

Нет записей об изменении поведения или смерть были обнаружены во время экспериментов на животных моделях.

Обсуждение

Результаты, полученные в настоящем исследовании, создают научную основу для использования E. uniflora в народной / традиционной медицине. Как для тестов in vitro, так и in vivo, CE и фракции из листьев E. uniflora Linn проявляли действие на жизнеспособность клеток, антибактериальную, противовоспалительную и антиноцицептивную активность.

Мирицитрин - это рамнозное гликозидное производное мирицетина, встречающегося в природе флавонола, экстрагированного из плодов, коры или листьев растений.Кроме того, мирицитрин может быть дегликозилирован до агликон мирицетина [19].

Мирицитрин проявил несколько биологических функций, которые представляют потенциальную пользу для здоровья, включая антимутагенную [20], антиоксидантную [21, 22], противовоспалительную [22–24] и антиноцицептивную [25] активность в экспериментальных моделях. Также было обнаружено, что мирицитрин защищает от рака кожи, сильно ингибируя индуцированную опухолью трансформацию неопластических клеток посредством ограничения активности киназ MEK, JAK1, Akt и MKK4 [26].Кроме того, было показано, что мирицитрин ослабляет индуцированную опухолью активацию c-fos и протеина-активатора-1 [27], а также ингибирует пути JAK1 / STAT3 [28].

В исследовании Fiuza et al. (2008), гидроэтанольный экстракт из листьев E. uniflora Linn был подвергнут методу разбавления агаром, и было обнаружено, что он ингибирует рост штаммов Pseudomonas aeruginosa . Однако соответствующие значения МИК 2,18 [29], 4,37 [30], 8,75 [30] и 17,50 мг / мл [29] были примерно в 2–7 раз выше, чем концентрации, указанные в настоящем исследовании [31].В другом исследовании, в котором определялись значения MIC для гидроэтанольного экстракта E. uniflora Linn с использованием метода микроразведения в бульоне, было обнаружено, что экстракт подавляет рост P. aeruginosa , хотя и в более низкой концентрации (10 мкг / мл). Кроме того, последний экстракт не подавлял эталонный штамм S. aureus [32], что противоречит настоящим результатам. В других исследованиях сообщалось об ингибировании штаммов S. aureus , включая эталонный штамм ATCC 25923, с более низкими значениями МИК, чем указанные здесь.Сообщалось также об ингибировании штаммов E. coli , включая E. coli ATCC 25922, однако в настоящем исследовании этого не наблюдалось [33, 34]. Аналогичная МИК против штаммов S. aureus , включая АТСС 25923, была сообщена только в одном другом исследовании, при этом МИК 2,187 мг / мл сообщалось для гидроэтанольного экстракта методом разбавления агаром [35]. Эти расхождения могут быть связаны с химической сложностью исследуемых образцов, особенно с учетом того, что состав вторичных метаболитов у растительных видов является динамичным в зависимости от множества переменных, связанных с периодом до сбора урожая (место сбора урожая, время, высота над уровнем моря, погода) и после сбора урожая. (способ консервирования растительного материала, способ экстракции, вид экстракционной жидкости) условия.

В проведенных анализах ВЭЖХ EAF имеет более высокое содержание эллаговой кислоты, галловой кислоты и мирицитрина. Эти результаты предполагают, что EAF в целом имеет более высокое содержание фенольных соединений, включая гидролизуемые галлотаннины, эллагитанины и флавоноиды. Ранее было продемонстрировано, что полифенолы, включая галловую кислоту, эллаговую кислоту, дубильные вещества и флавоноиды, проявляют антибактериальную активность против многих штаммов бактерий [36, 37]. Поэтому мы предположили, что EAF будет более активным из-за более высокого содержания в нем эллаговой кислоты, галловой кислоты и мирицитрина.Несмотря на предыдущий отчет о том, что EAF, содержащий флавоноиды и дубильные вещества, был более активен, чем экстракт [35], CE, исследованный в настоящем исследовании, имел более низкое значение MIC, чем другие подготовленные фракции. Таким образом, возможно, что антибактериальная активность, наблюдаемая для исследуемого здесь CE, обусловлена ​​синергическим эффектом множества веществ, которые могли отсутствовать после процедуры фракционирования.

Окислительный стресс - это событие, которое характерно для многих заболеваний человека, включая воспаление и рак.Окислительный стресс может быть результатом дисбаланса между уровнями активных форм кислорода (АФК) и антиоксидантов, которые отвечают за клеточную защиту (например, глутатиона, супероксиддисмутазы). В воспалительном процессе окислительный стресс опосредуется фагоцитами, содержащими МПО, и это приводит к избыточной продукции АФК, которая преодолевает окислительную защиту, такую ​​как присутствие GSH, трипептида, обычно участвующего в предотвращении окислительного повреждения тканей. Таким образом, способность GSH поддерживать восстановленную внутриклеточную среду делает его важным маркером антиоксидантной активности.

Благоприятное влияние CE и фракций E. uniflora Linn на воспалительный процесс было подтверждено на основании наблюдаемого снижения миграции лейкоцитов. Как важный маркер миграции нейтрофилов, активность МПО также снижалась после лечения. Защитный эффект CE в отношении окислительного стресса был продемонстрирован его способностью предотвращать снижение уровня общего глутатиона и MDA (маркера перекисного окисления липидов). Противовоспалительная способность флавоноида мирицитрина была ранее продемонстрирована на основании его ингибирования продукции простагландинов, индуцированной липополисахаридом (ЛПС) [28].Также было обнаружено, что мирицитрин ингибирует продукцию LPS-стимулированного оксида азота, провоспалительных цитокинов, продукцию простагландина E2 и уровни белка индуцибельной синтазы оксида азота и циклооксигеназы-2 в макрофагах RAW 264.7 [23].

В модели абдоминальных корчей все экстракты во всех дозах проявляли явную периферическую антиноцицептивную активность, демонстрируя, что уменьшение воспалительного процесса сопровождалось явным уменьшением боли на периферическом уровне.Ноцицептивный механизм, вызываемый уксусной кислотой, включает различные механизмы, такие как высвобождение метаболитов арахидоновой кислоты посредством циклооксигеназы и биосинтез простагландинов и гистаминов, среди прочего [38]. В последнее десятилетие было показано, что воспалительные стимулы не стимулируют напрямую высвобождение первичных гиперноцицептивных медиаторов, но их высвобождению предшествует каскад цитокинов. Существует каскадный выброс цитокинов, который представляет собой связь между повреждениями и высвобождением первичных гиперноцицептивных медиаторов [39].Эта концепция позволяет нам понять, почему ингибирование одного (IL-1β или TNF-α) или нескольких (глюкокортикоиды) цитокинов вызывает обезболивание [39]. Наше исследование смогло показать эту связь между CE и фракцией, снижение уровней IL-1β и TNF-α и снижение периферической антиноцицептивной активности.

С другой стороны, тест с горячей пластиной заключается в оценке реакции лекарственного средства на термогенный стимул [40]. В этом тесте тепловой стимул активирует ноцицепторы (немиелинизированные волокна типа C), которые передают информацию в определенные области центральной нервной системы, вызывая, таким образом, ноцицептивный ответ [41].Этот тест эффективен для определения анальгетической активности опиоидных агонистов [42]. Реакция CE и фракций в тесте с горячей пластиной предполагала, что он не продемонстрировал опиоидного действия.

Полифенольные компоненты, такие как дубильные вещества, обладают антиоксидантными и противовоспалительными свойствами. В предыдущем исследовании водного экстракта E. uniflora Linn были идентифицированы гидролизуемые танины (например, галловая кислота и эллаговая кислота), и экстракт применялся на модели острого диабета [8].У животных, которым вводили экстракт, наблюдался пониженный индекс воспалительного инфильтрата с уменьшением инфильтрации воспалительными клетками с 25% до 80%, наблюдаемых у необработанных животных по сравнению с обработанными, соответственно. Уровни воспалительных цитокинов, особенно TNF-α, были значительно снижены в группе, получавшей AqF, при всех дозах с высоким содержанием эллаговой кислоты и мирицитрина. В макрофагах мирицитрин снижает продукцию провоспалительных медиаторов, таких как NO, iNOS, TNF-α, IL-6 и IL-12, за счет подавления активации NF-κB и STAT1 [43].Предварительная обработка эллаговой кислотой снижала экспрессию провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли α (TNF-α), интерлейкин 6 (IL-6) и интерлейкин 1β (IL-1β). Эти результаты предполагают, что эллаговая кислота защищает от опосредованного Т-клетками гепатита посредством TLR и сигнальных путей митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) / NF-κB [44].

Этот противовоспалительный эффект можно частично объяснить снижением перекисного окисления липидов, что означает, что антиоксидантный эффект опосредуется внутриклеточным снижением потребления глутатиона.Обезболивающие эффекты, связанные с CE и фракциями E. uniflora Linn в настоящем исследовании, согласуются с антиноцицептивной активностью, наблюдаемой в исследовании эфирных масел, которые были выделены из листьев E. uniflora Linn и подавляли сужение животных 48 % при пероральной дозе 200 мг / кг. Было показано, что пентановая фракция листьев E. uniflora Linn опосредует значительный антиноцицептивный эффект, который включал подавление сужений животных на 70% при той же дозе [2].

Ранее сообщалось, что мирицитрин оказывает значительный анальгетический эффект в тесте на реакцию корчей, вызванную уксусной кислотой [45]. В настоящем исследовании CE и фракции вызывали значительно больший обезболивающий эффект. Это наблюдение может быть связано с содержанием мирицитрина, галловой кислоты и эллаговой кислоты, которые были обнаружены в CE и фракции листьев E. uniflora Linn.

Выводы

Относительно антибактериального действия E.uniflora Linn листья, вариабельность результатов, представленных в литературе, в сочетании с неожиданными результатами, полученными в настоящем исследовании, указывает на то, что необходимы дальнейшие исследования для определения активного антибактериального соединения, которое присутствует в листьях E. uniflora Linn. Эти исследования могут включать оценку антибактериальной активности экстрактов листьев, собранных из разных мест, одновременно с подробным фитохимическим анализом. Цель состоит в том, чтобы определить, какие вещества присутствуют или отсутствуют в активных экстрактах, а какие - в менее активных.СЕ и полуочищенные фракции листьев E. uniflora Linn проявляли противовоспалительную и анальгезирующую активность. Лечебные дозы также ингибировали миграцию клеток, как подтверждено в анализах MPO, и проявляли противовоспалительную активность со сниженными уровнями IL-1β (CE и все фракции), но AqF (все дозы) снижали уровни TNF-α. Кроме того, согласно определениям уровней общего глутатиона и МДА, очевидно, что E. uniflora Экстракт листьев Linn может опосредовать антиоксидантную активность.AqF может быть связан с более высоким содержанием мицитрина, галловой кислоты и эллаговой кислоты и вызывать значительно больший обезболивающий эффект по сравнению с CE и фракциями.

Благодарности

Мы благодарим Pro-Reitoria de Pesquisa и программу последипломного образования фармацевтических наук / УФРН / Бразилия.

Финансирование

Эта работа была поддержана Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco / FACEPE (APQ-0493-4.03 / 14; BIC-0200-4.03 / 15; IBPG-0557-4.15 марта) и Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CNPq (308386 / 2015–9).

Наличие данных и материалов

Данные доступны у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Аббревиатуры

910 DTNB 9AD-L-cysteinyl-glycine 9AD-8 Фото 9038 Жидкая хроматография HPLC2 обнаружение
ANOVA Односторонний дисперсионный анализ
AqF Водная фракция
BAPTA AM - 1,2-этанопис (2-N-2-Nо-амино) , N ', N'-тетрауксусная кислота тетракис (ацетоксиметиловый эфир)
BHI Бульон для инфузий сердца мозга
CE Неочищенный экстракт
CEUA Дитиобиснитробензойная кислота
EAF Фракция этилацетата
GSH γ-L-Glutamyl-L-cysteinyl-glycine
HTAB Гексадецилтриметиламмонийбромидный буфер
i.п. Внутрибрюшинная
MDA малонового диальдегида
ГАМ Microbialpolyhydroxyalkanoates
МИК ингибирующие концентрации Минимальные
МРО миелопероксидазы
MRSA устойчивый к метициллину Staphylocuccus стафилококк
NIH Национальный институт здравоохранения
PVDF Поливинилиденфторид
RT Время удерживания
SEM Средняя ошибка TC
SEM Стандартная ошибка
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
UV Ultra violete
VIS Visible

Вклад авторов

TRF, AAA, GCBG, LALS, RTMR, ICFB, MRAF, MASN, MCNM, RFAJ, ACVAG и JSM: внесли существенный вклад в концепцию и дизайн или сбор данных, или анализ и интерпретацию данных; TRF, AAA, GCBG, LALS, MRAF, MASN, MCNM, RFAJ: принимали участие в составлении рукописи или критическом ее пересмотре на предмет важного интеллектуального содержания; TRF, AAA, GCBG, LALS, RTMR, ICFB, MRAF, MASN, MCNM, RFAJ, ACVAG и JSM: окончательно утверждена версия, которая будет опубликована.Каждый автор должен в достаточной степени участвовать в работе, чтобы нести общественную ответственность за соответствующие части содержания; и TRF, AAA, GCBG, LALS, RTMR, ICFB, MRAF, MASN, MCNM, RFAJ, ACVAG и JSM: согласились нести ответственность за все аспекты работы в обеспечении того, чтобы вопросы, связанные с точностью или целостностью любой части работа должным образом исследована и решена.

Примечания

Одобрение этики и согласие на участие

Это исследование было одобрено Комитетом по этике использования животных / CEUA / Федеральным университетом Риу-Гранди-ду-Норти / UFRN, протокол № 01/2015) Федерального университета Рио. Гранд-ду-Норти, Бразилия.Используемые протоколы ухода за животными и исследований были основаны на принципах и рекомендациях, принятых в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных.

Согласие на публикацию

Не применимо.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Примечание издателя

Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий на опубликованных картах и ​​принадлежностей организаций.

Информация для авторов

Тамирес Роша Фалькао, электронная почта: moc.liamtoh @ oaclafrserimat.

Ауригена Антунес де Араужо, электронная почта: [email protected]

Луис Альберто Лира Соарес, электронная почта: [email protected]

Райанн Тас де Мораес Рамос, электронная почта: [email protected]

Изабель Кристин Ферраз Безерра, электронная почта: [email protected]_eelleb.

Магда Райанни Ассунсао Феррейра, электронная почта: [email protected]_adgam.

Маноэль Андре де Соуза Нето, электронная почта: [email protected]

Мария Селеста Нуньес Мело, электронная почта: мос.liamg @ olemlec.

Раймундо Фернандес де Араужо младший, электронная почта: [email protected]

Андреза Консейсао Верас де Агиар Герра, электронная почта: [email protected]

Юлиана Сильва де Медейрос, электронная почта: [email protected]

Герлан Коэльо Бернардо Герра, электронная почта: [email protected]

Ссылки

1. Баптиста М.М., Рамос М.А., де Альбукерке UP, Коэльо-де-Соуза Г., Риттер MR. Традиционные ботанические знания рыбаков-кустарей на юге Бразилии.J Ethnobiol Ethnomed. 2013; 9: 54. DOI: 10.1186 / 1746-4269-9-54. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 2. Аморим А.С., Лима С.К., Ховелл А.М., Миранда А.Л., Резенде С.М. Антиноцицептивная и гипотермическая оценка эфирного масла листьев и изолированных терпеноидов из Eugenia uniflora L. (Brazilian Pitanga) Phytomedicine. 2009. 16 (10): 923–928. DOI: 10.1016 / j.phymed.2009.03.009. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3. Медейруш М.Ф., да Фонсека В.С., Андреата Р.Х. Plantas medicinais e seus usos pelos sitiantes da Reserva Rio das Pedras, Mangaratiba, RJ, Brasil.Бюстгальтеры Acta Bot. 2004. 18: 391–399. DOI: 10.1590 / S0102-33062004000200019. [CrossRef] [Google Scholar] 5. de Santana BF, Voeks RA, Funch LS. Этномедицинское обследование бордового сообщества в тропических лесах Атлантики Бразилии. J Ethnopharmacol. 2016; 181: 37–49. DOI: 10.1016 / j.jep.2016.01.014. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 6. Brasileiro BG, Pizziolo VR, Raslan DS, Jamal CM, Silveira D. Скрининг антимикробной и цитотоксической активности некоторых бразильских лекарственных растений, используемых в районе Говернадор Валадарес.Rev Bras Ciênc Farm. 2006; 42: 195–202. DOI: 10.1590 / S1516-006000200004. [CrossRef] [Google Scholar] 7. Раттманн Ю.Д., де Соуза Л.М., Малькевич-Пайва С.М., Дартора Н., Сассаки Г.Л., Горин П.А., Якомини М. Анализ флавоноидов из листьев Eugenia uniflora и его защитный эффект против сепсиса мышей. Evid Based Complement Alternat Med. 2012; 2012: 623940. DOI: 10.1155 / 2012/623940. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 8. Schumacher NS, Colomeu TC, de Figueiredo D, Carvalho Vde C, Cazarin CB, Prado MA, Meletti LM, Zollner Rde L.Идентификация и антиоксидантная активность экстрактов листьев Eugenia uniflora. Характеристика противовоспалительных свойств водного экстракта на проявление диабета в экспериментальной модели антиоксидантов спонтанного диабета 1 типа (мыши NOD) (Базель) 2015; 4 (4): 662–680. DOI: 10.3390 / antiox4040662. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 9. Тейшейра Л.А., Ресенде Калифорния, Ормонд Л.Р., Розенбаум Р., Фигейредо А.М., де Ленкаср Х., Томаш А. Географическое распространение эпидемического клона мультирезистентного Staphylococcus aureus в Бразилии.J Clin Microbiol. 1995. 33 (9): 2400–2404. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 10. CLSI CaLSI. Методы испытаний на чувствительность к противомикробным препаратам при разведении бактерий, которые растут в аэробных условиях; Утвержденный стандарт - девятое издание. M07A9. 2012. с. 32. [Google Scholar] 11. Рибейро РА, Флорес Калифорния, Кунья ФК, Феррейра Ш. IL-8 вызывает миграцию нейтрофилов in vivo по клеточно-зависимому механизму. Иммунология. 1991. 73 (4): 472–477. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 12. Krawisz JE, Sharon P, Stenson WF.Количественный анализ острого воспаления кишечника на основе активности миелопероксидазы - оценка воспаления на моделях крыс и хомяков. Гастроэнтерология. 1984. 87 (6): 1344–1350. [PubMed] [Google Scholar] 13. Андерсон ME. Определение глутатиона и дисульфида глутатиона в биологических образцах. Методы Энзимол. 1985. 113: 548–555. DOI: 10.1016 / S0076-6879 (85) 13073-9. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Esterbauer H, Cheeseman KH. Определение продуктов перекисного окисления альдегидных липидов: малонового альдегида и 4-гидроксиноненаля.Методы Энзимол. 1990; 186: 407–421. DOI: 10.1016 / 0076-6879 (90) 86134-H. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Сафие-Гарабедян Б., Пул С., Олчорн А., Винтер Дж., Вульф С.Дж. Вклад интерлейкина-1 бета в вызванное воспалением повышение уровней фактора роста нервов и воспалительную гипералгезию. Br J Pharmacol. 1995. 115 (7): 1265–1275. DOI: 10.1111 / j.1476-5381.1995.tb15035.x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Кендалл С., Ионеску-Матиу И., Дресман Г.Р. Использование системы биотин / авидин для увеличения чувствительности твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) J Immunol Methods.1983; 56 (3): 329–339. DOI: 10.1016 / S0022-1759 (83) 80022-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Кураиши Й., Харада Й., Аратани С., Сато М., Такаги Х. Раздельное участие спинномозговой норадренергической и серотонинергической систем в морфиновом обезболивании: различия в механических и термических болеутоляющих тестах. Brain Res. 1983. 273 (2): 245–252. DOI: 10.1016 / 0006-8993 (83) -1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Костер Р., Андерсон М., Дебир Э. Дж. Уксусная кислота для скрининга анальгетиков. Fed Proc. 1959; 18 (1): 412.[Google Scholar] 19. Du LY, Zhao M, Xu J, Qian DW, Jiang S, Shang EX, Guo JM, Liu P, Su SL, Duan JA и др. Идентификация метаболитов мирицитрина, продуцируемых кишечными бактериями человека in vitro, с использованием ультраэффективной жидкостной хроматографии / квадрупольной времяпролетной масс-спектрометрии. Мнение эксперта Drug Metab Toxicol. 2014; 10 (7): 921–931. DOI: 10.1517 / 17425255.2014.4. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Эденхардер Р., Грюнхаге Д. Способность флавоноидов поглощать свободные радикалы как механизм защиты от мутагенности, вызванной трет-бутилгидропероксидом или гидропероксидом кумола в Salmonella typhimurium TA102.Mutat Res. 2003. 540 (1): 1–18. DOI: 10.1016 / S1383-5718 (03) 00114-1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Chen W, Feng L, Shen Y, Su H, Li Y, Zhuang J, Zhang L, Zheng X. Мирицитрин подавляет опосредованную акриламидом цитотоксичность в клетках Caco-2 человека, предотвращая окислительный стресс. Biomed Res Int. 2013; 2013: 724183. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 22. Domitrovic R, Rashed K, Cvijanovic O, Vladimir-Knezevic S, Skoda M, Visnic A. Мирицитрин проявляет антиоксидантную, противовоспалительную и антифибротическую активность у мышей, отравленных четыреххлористым углеродом.Chem Biol Interact. 2015; 230: 21–29. DOI: 10.1016 / j.cbi.2015.01.030. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Kim HH, Kim DH, Kim MH, Oh MH, Kim SR, Park KJ, Lee MW. Компоненты флавоноидов в листьях Myrica rubra sieb. et zucc. с противовоспалительным действием. Arch Pharm Res. 2013. 36 (12): 1533–1540. DOI: 10.1007 / s12272-013-0147-х. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Shimosaki S, Tsurunaga Y, Itamura H, Nakamura M. Противоаллергический эффект флавоноида мирицитрина из экстрактов листьев Myrica rubra in vitro и in vivo.Nat Prod Res. 2011. 25 (4): 374–380. DOI: 10.1080 / 14786411003774320. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Meotti FC, Luiz AP, Pizzolatti MG, Kassuya CA, Calixto JB, Santos AR. Анализ антиноцицептивного действия флавоноида мирицитрина: доказательства роли путей L-аргинин-оксида азота и протеинкиназы C. J Pharmacol Exp Ther. 2006. 316 (2): 789–796. DOI: 10.1124 / jpet.105.0. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26. Семвал Д.К., Семвал Р.Б., Комбринк С., Вилджоен А. Мирицетин: диетическая молекула с разнообразной биологической активностью.Питательные вещества. 2016; 8 (2): 90. DOI: 10.3390 / nu8020090. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27. Lee KW, Kang NJ, Rogozin EA, Kim HG, Cho YY, Bode AM, Lee HJ, Surh YJ, Bowden GT, Dong Z. Мирицетин - новый природный ингибитор трансформации опухолевых клеток и MEK1. Канцерогенез. 2007. 28 (9): 1918–1927. DOI: 10,1093 / carcin / bgm110. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 28. Ичимацу Д., Номура М., Накамура С., Моритани С., Йокогава К., Кобаяши С., Нисиока Т., Миямото К. Взаимосвязь между структурой и активностью флавоноидов для ингибирования индуцированной эпидермальным фактором роста трансформации клеток JB6 Cl 41.Mol Carcinog. 2007. 46 (6): 436–445. DOI: 10.1002 / mc.20292. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Хефти А. Относительный гнотобиоз: возможность изучения заболеваний пародонта у крыс. SSO Schweiz Monatsschr Zahnheilkd. 1979. 89 (7): 689–698. [PubMed] [Google Scholar] 30. Мори М., Ито Н. Животные, используемые в качестве моделей в стоматологии: крысы ODU в качестве модели для изучения заболеваний пародонта. Джиккен Добуцу. 1978. 27 (2): 200–202. [PubMed] [Google Scholar] 31. S-MS FTS, Паула-младший, КармоФильо-младший, ФК Пимента. Антимикробная активность неочищенного этанольного экстракта и фракций из листьев Eugenia uniflora против Pseudomonas aeruginosa.Lat Am J Pharm. 2009; 28 (6): 8. [Google Scholar] 32. Bouzada MLM, Fabri RL, Nogueira M, Konno TUP, Duarte GG, Scio E. Антибактериальный, цитотоксический и фитохимический скрининг некоторых традиционных лекарственных растений в Бразилии. Pharm Biol. 2009. 47 (1): 44–52. DOI: 10.1080 / 13880200802411771. [CrossRef] [Google Scholar] 33. Фадейит М.О., Акпан Ю.Е. Антибактериальная активность экстрактов листьев Eugenia uniflora Linn. (Синоним Stenocalyx michelli Linn.) Myrtaceae. Phytother Res. 1989. 3 (4): 154–155. DOI: 10.1002 / ptr.2650030409. [CrossRef] [Google Scholar] 34. Холец Ф. Б., Пессини Г. Л., Санчес Н. Р., Кортез Д. А., Накамура К. В., Филхо Б. П.. Скрининг некоторых растений, используемых в бразильской народной медицине для лечения инфекционных заболеваний. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2002. 97 (7): 1027–1031. DOI: 10.1590 / S0074-02762002000700017. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 35. Fiúza TS, Sabóia-Morais SM, Paula JR, Tresvenzol LMF, Pimenta FC. Оценка антимикробной активности неочищенного этанольного экстракта листьев Eugenia uniflora L. Rev Ciênc Farm Básica Apl.2008; 29 (3): 6. [Google Scholar] 36. Borges A, Ferreira C, Saavedra MJ, Simoes M. Антибактериальная активность и механизм действия феруловой и галловой кислот против патогенных бактерий. Microb Drug Resist. 2013. 19 (4): 256–265. DOI: 10.1089 / mdr.2012.0244. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 37. Энгельс С, Шибер А, Ганцле МГ. Спектры ингибирования и режимы антимикробного действия галлотанинов из ядер манго (Mangifera indica L.) Appl Environ Microbiol. 2011. 77 (7): 2215–2223. DOI: 10.1128 / AEM.02521-10.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 39. Cunha TM, Verri WA, Jr, Силва JS, Poole S, Cunha FQ, Ferreira SH. Каскад цитокинов опосредует механическую воспалительную гиперноцицепцию у мышей. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2005; 102 (5): 1755–1760. DOI: 10.1073 / pnas.04002. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 40. Лангерман Л., Заковски М.И., Пискун Б., Грант Г.Дж. Горячая пластина по сравнению с движением хвостом: оценка острой толерантности к непрерывной инфузии морфина на модели крыс.J Pharmacol Toxicol Methods. 1995. 34 (1): 23–27. DOI: 10.1016 / 1056-8719 (94) 00077-H. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 42. Яницки П., Либич Дж. Обнаружение антагонистической активности наркотических анальгетиков в тесте на горячей пластине мышей. Pharmacol Biochem Behav. 1979. 10 (4): 623–626. DOI: 10.1016 / 0091-3057 (79)

-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 43. Чо БО, Инь ХХ, Пак Ш, Бьюн Э.Б., Ха ХЙ, Чан Си. Противовоспалительная активность мирицетина из Diospyros lotus посредством подавления активации NF-kappaB и STAT1 и индукции Nrf2-опосредованного HO-1 в стимулированном липополисахаридом RAW264.7 макрофагов. Biosci Biotechnol Biochem. 2016; 80 (8): 1520–1530. DOI: 10.1080 / 051.2016.1171697. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 44. Ли Дж. Х., Вон Дж. Х., Чхве Дж. М., Ча ХХ, Чан Й-Джей, Пак С., Ким Х. Г., Ким Х. К., Ким Д. К.. Защитный эффект эллаговой кислоты на конканавалин A-индуцированный гепатит через toll-подобный рецептор и сигнальные пути митоген-активируемой протеинкиназы / ядерного фактора kappaB. J. Agric Food Chem. 2014. 62 (41): 10110–10117. DOI: 10.1021 / jf503188c. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 45. Тонг Y, Чжоу XM, Ван SJ, Ян Y, Цао YL.Обезболивающая активность мирицетина, выделенного из Myrica rubra Sieb. et Zucc. листья. Arch Pharm Res. 2009. 32 (4): 527–533. DOI: 10.1007 / s12272-009-1408-6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Экстракт листьев Coccoloba alnifolia как потенциальная антиоксидантная молекула с использованием анализов in vitro и in vivo

Род Coccoloba широко используется в традиционной народной медицине, но по этому роду существует мало научных данных . Целью данного исследования было охарактеризовать химический состав и антиоксидантную активность C.экстракты листьев alnifolia с использованием анализов in vitro и in vivo . Было получено шесть экстрактов: гексан (HE), хлороформ (CE), этанол (EE), метанол (ME), водный экстракт (WEE) и водный экстракт (WE). Анализ с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) показал присутствие фенолов, сапонинов, терпенов и флавоноидов. Анализы in vitro продемонстрировали значительный антиоксидантный потенциал, особенно для полярных экстрактов (EE, ME, WEE и WE). Более того, не наблюдали токсических эффектов на клеточных линиях млекопитающих для большинства экстрактов в оцененных концентрациях.Нематода Caenorhabditis elegans также использовалась в качестве модели in vivo для тестирования антиоксидантного потенциала. EE и WE были выбраны на основе ранее полученных результатов. Было замечено, что ни EE, ни WE не оказывали токсического действия на развитие C. elegans . Кроме того, антиоксидантный потенциал оценивали с использованием трет--бутилгидропероксида в качестве стрессорного агента. EE увеличил продолжительность жизни C. elegans на 28% по сравнению с контролем, а WE увеличил диапазон до 39.2-41,3%. Высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC-DAD) показала присутствие галловой кислоты, p -кумаровой кислоты и витексина в WE. Таким образом, данные in vitro, и in vivo, продемонстрировали антиоксидантный потенциал экстрактов C. alnifolia и их возможное биотехнологическое применение.

1. Введение

Свободные радикалы вырабатываются как нормальная часть метаболизма митохондриями, пероксисомами, фагоцитозом, воспалительными процессами, ишемией и физическими упражнениями [1].Баланс между производством и нейтрализацией активных форм кислорода (АФК) антиоксидантными системами очень важен, а дисбаланс имеет тенденцию к перепроизводству АФК, что приводит к так называемому окислительному стрессу [2, 3].

Кроме того, клетки обычно являются мишенями для активных форм, таких как активные формы кислорода (ROS), активные формы азота (RNS) и активные формы серы (RSS). Этот дисбаланс может повредить молекулы, такие как белки, липиды, ДНК и РНК, и привести к метаболическим нарушениям и заболеваниям, таким как рак, сердечно-сосудистые заболевания, диабет, атеросклероз, инсульт, неврологические расстройства, почечные расстройства, заболевания печени, гипертония и ревматоидный артрит. среди других, связанных с окислительным стрессом [2–5].

Растения производят смесь соединений, известных как вторичные метаболиты, которые обладают различными биологическими и фармакологическими свойствами. Известно, что эти вторичные метаболиты обладают антиоксидантным потенциалом, который важен для поддержания этого окислительного баланса. Эти молекулы могут быть получены из различных тканей растений, таких как листья, кора, корни и плоды [6]. Таким образом, идентификация и выделение соединений являются важными темами исследований в этой области [7].

Polygonaceae (Caryophyllales) насчитывает приблизительно 51 род и 1100 видов, распространенных в различных биомах по всему миру.Некоторые виды используются в качестве декоративных растений, некоторые культивируются в лечебных целях, а некоторые имеют экономическое значение для поставки древесины для производства предметов домашнего обихода [8]. Род Coccoloba состоит примерно из 46 видов. Из них 21 являются эндемиками Бразилии и распространены в нескольких биомах: лес Амазонки, Атлантический лес, Каатинга, Бразильская саванна (Серрадо) и Пантанал. У растений Coccoloba сочлененные стебли, чередующиеся и цельные простые листья с суженными прилистниками и артериями.Это травянистые, кустарниковые, древесные или лианы [9].

Был описан химический состав Coccoloba ; он содержит тритерпены, дитерпены, антрахиноны, фитостероиды, алкалоиды, бензоиды, сапонины, флавоноиды, дубильные вещества, галловую кислоту, эпигаллокатехин, галлат, миристин-3-O-8-рамнозид, β -ситостерол, -ситостерол бетулиновые кислоты, карбоновые кислоты, сложные эфиры, альдегиды, эллаговая кислота, бензойная кислота, или -кумаровая кислота, рутин, мирицетин и кверцетин [10–12].Виды C. uvifera , C. cereifera и C. mollis были оценены как ларвицидные агенты против комаров Aedes aegypti [13], а также противогрибковые [14], цитотоксические [15], противомикробные препараты. [10], древесные биофунгицидные и фитопатогенные бактериальные [12].

Coccoloba alnifolia , широко известная как «pau-de estalo» или «cabuçu», является одним из эндемичных бразильских видов этого рода. Несмотря на все эти способы использования в традиционной народной медицине, нет никакой научной информации о составе вторичных метаболитов C.alnifolia , ни об их возможной биологической активности. Целью этого исследования было охарактеризовать химический состав и антиоксидантную активность экстрактов C. alnifolia с использованием моделей in vitro и in vivo . Пять экстрактов листьев были получены путем последовательной экстракции (с использованием аполярных растворителей в полярные растворители), а шестой экстракт был приготовлен только с водой (исходя из народного использования). В целом эти экстракты не влияли на жизнеспособность шести различных клеточных линий млекопитающих.Кроме того, анализы in vitro, и in vivo, показали четыре полярных экстракта, EE, ME, WEE и WE, которые были источниками молекул антиоксидантов. Более того, экстракты EE и WE не влияли на плодовитость нематод Caenorhabditis elegans , использованных в качестве тестовой модели. Таким образом, листья Coccoloba alnifolia имеют отличный потенциал для разработки лекарственных средств на травах и в качестве антиоксидантных продуктов.

2. Материалы и методы
2.1. Реагенты

Феррицианид калия, сульфат железа II, трихлоруксусная кислота и серная кислота были приобретены в компании Merck (Дармштадт, Германия).Нитро-синий тетразолий (NBT), моносахариды, диаминоэтантетрауксусная кислота (EDTA), D-глюкоза, галловая кислота, аскорбиновая кислота, белок бычьего сывороточного альбумина, аскорбиновая кислота, метионин, 3- (4,5-диметилтиазолил-2) -2,5 - дифенилтетразолийбромид (МТТ), пирокатехиновый фиолетовый, рибофлавин, молибдат аммония и трет-бутилпероксид водорода (t-BOOH) были приобретены у Sigma-Aldrich Co. (Сент-Луис, Миссури, США). Бикарбонат натрия, заменимые аминокислоты и фосфатно-солевой буфер (PBS) были приобретены у Invitrogen Corporation (Burlington, ON, Canada).Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), и фетальная бычья сыворотка (FBS) были получены от CULTILAB (Campinas, SP, Brazil). Пенициллин и стрептомицин были получены от Gibco (Форт-Уэрт, Техас, США). Все остальные растворители и химические вещества были аналитической чистоты от Synth (Diadema, SP, Бразилия).

2.2. Растительный материал

Coccoloba alnifolia зрелых листа были собраны в мае 2015 года с образца, расположенного в Парке дас Дунас, Натал, RN, Бразилия (зона UTM 250257315 м E 08 м N — GPS Garmin Etrex).Этот регион соответствует биому Атлантического леса. После идентификации в Гербарий УФРН был депонирован чек за номером: УФРН 17133. Исследование было зарегистрировано в Гербарии УФРН. 54064-1, SISGEN нет. A39FD4C.

2.3. Приготовление экстрактов

После сбора урожая свежие листья были разделены на мелкие кусочки и перенесены в колбу в соотношении 1:10 () (100 г свежих листьев на 1000 мл растворителя) для мацерации в течение 24 часов для каждого использованного растворителя. . Метод последовательной экстракции был осуществлен с использованием различных растворителей в следующем порядке от аполярных до полярных растворителей, таких как гексан (HE), хлороформ (CE), этанол (EE), метанол (ME) и водный экстракт (WEE).Подход, использованный для приготовления экстрактов, заключался в последовательной экстракции с использованием различных растворителей, при которой листья мацерировали, и добавляли каждый растворитель (аполярный к полярным растворителям) в течение 24 часов. Затем листья фильтровали и возвращали в колбу, и добавляли следующий растворитель. Таким образом, водный экстракт (WEE) соответствует последнему растворителю, используемому для этой последовательной экстракции. Идея последовательной экстракции отделила соединение на основе растворителя. Кроме того, экстракт, приготовленный с использованием только воды - WE - был основан на народном использовании.

Для предотвращения легкого разложения колбу покрывали алюминиевой фольгой. Затем его помещали на встряхивающий стол при 150 об / мин на 24 ч при 24 ° C (Tecnal Shacker). Экстракт фильтровали через ватман № 1. Листья переносили обратно в колбу со следующим растворителем после серийной экстракции в тех же условиях. Экстракты сушили в ротационном испарителе (Tecnal – TE 210) при 40 ° C. Экстракты восстанавливали в 1% ДМСО (Merck), затем лиофилизировали (Labconco FreeZone 4.5). Все экстракты ресуспендировали в воде до конечной концентрации 100 мг / мл (исходный экстракт) и хранили при -18 ° C до использования.

2.4. Общее содержание сахара, фенольных соединений и белка
2.4.1. Всего сахаров

Для проверки количества сахаров в экстрактах использовали метод фенола-H 2 SO 4 и D-глюкозу (Sigma-Aldrich) в качестве стандарта. Общее количество сахаров измерялось при 490 нм (Hitachi U-2000 Tokyo, Japan) [16].

2.4.2.Общее количество фенольных соединений

Общее содержание фенольных соединений измеряли с использованием метода Folin Ciocalteu, и галловую кислоту (Sigma-Aldrich) использовали в качестве стандарта. Его измеряли при 765 нм (BioTek Epoch Microplate, Калифорния, Калифорния, США) [17].

2.4.3. Общие растворимые белки

Общее содержание белка измеряли с использованием метода Брэдфорда, и белок бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich) использовали в качестве стандарта. Реакцию измеряли при длине волны 595 нм (BioTek Epoch Microplate, Калифорния, Калифорния, США) [18].

2,5. Антиоксидантная активность in vitro

Каждый анализ антиоксиданта проводили в трех экземплярах и повторяли три раза. Все показания были сделаны с использованием спектрофотометра BioTek Epoch Microplate (Калифорния, Калифорния, США). Использовали экстракты из C. alnifolia в концентрации 250 мк г / мл.

2.5.1. Общая антиоксидантная способность (TAC)

Антиоксидантную активность измеряли с учетом восстановления Mo +6 до Mo +5 растительными экстрактами и последующего образования комплекса зеленый фосфат / Mo +5 при кислом pH.Используемая концентрация экстракта составляла 250 мкМ ( г / мл), который был смешан с 600 мМ серной кислоты молибдата аммония), и его инкубировали при 100 ° C в течение 90 мин [19]. По истечении этого времени смесь выдерживали при комнатной температуре для охлаждения и измеряли оптическую плотность при 695 нм. Результаты сравнивали с отрицательным контролем (дистиллированная вода). Общая антиоксидантная способность выражалась в эквивалентах аскорбиновой кислоты (ЕАА / г).

2.5.2. DPPH

Антиоксидантную активность определяли по способности антиоксидантов, присутствующих в образцах, улавливать радикал DPPH [20].Экстракт добавляли в концентрации 250 мкл г / мл и 100 мкл л DPPH (0,1 мМ). Смесь интенсивно перемешивали и оставляли на 30 мин при комнатной температуре. Затем измеряли оптическую плотность при 517 нм. Бланковый контроль представлял собой 99,5% этанол (Synth, Бразилия), а отрицательный контроль - дистиллированная вода. Активность по поглощению DPPH рассчитывали следующим образом:.

2.5.3. Reducing Power Assay

Восстанавливающую способность образцов оценивали по восстановлению феррицианида калия до ферроцианида калия [21].Растительный экстракт с концентрацией 250 мкМ г / мл добавляли к раствору, содержащему 0,2 М фосфатный буфер (pH 6,6) и феррицианид калия (1%) в конечном объеме 4 мл. Реакцию инкубировали при 50 ° C в течение 20 мин; по истечении этого периода его прекратили добавлением раствора TCA (10%). Затем раствор смешивали с дистиллированной водой и хлоридом железа (0,1%). Поглощение измеряли при 700 нм. Фосфатный буфер использовали в качестве холостого контроля. Результат был выражен в процентах от активности, представленной цифрой 0.1 мг / мл аскорбиновой кислоты (стандарт - Sigma-Aldrich).

2.5.4. Активность по поглощению супероксида

Анализ основан на способности экстрактов ингибировать фотохимическое восстановление нитросинего тетразолия (NBT) в систему рибофлавин-свет-NBT [21, 22]. Для этого экстракт с концентрацией 250 мкМ г / мл был добавлен в 50 мМ фосфатный буфер (pH 7,8), 13 мМ метионин, 100 мМ EDTA, 75 мМ NBT и 2 мМ рибофлавин. После этого раствор подвергали воздействию люминесцентной лампы в течение 10 минут.Изменение цвета на синий связано с образованием формазана, и его отслеживают по поглощению при 560 нм. В спектрофотометре. ЭДТА использовали в качестве контроля, а дистиллированную воду - в качестве холостого опыта. Результаты выражали в процентах поглощения:

2,6. Жизнеспособность клеток - анализ МТТ

Влияние экстрактов C. alnifolia на жизнеспособность клеток оценивали. Использовали одну неопухолевую клеточную линию: NIH / 3T3 (ATCC CRL-1658 - мышиный фибробласт), а также пять линий опухолевых клеток: HeLa (ATCC CCL-2 - клетка аденокарциномы матки человека), SiHa (ATCC HTB-35— клетка плоскоклеточной карциномы человека), PC-3 (ATCC CRL-1435 - клетка аденокарциномы простаты человека), B16-F10 (ATCC CRL-6475 - клетка меланомы кожи мыши) и PANC-1 (ATCC CRL-1469— клетки аденокарциномы поджелудочной железы).Сначала клеточные линии выращивали в культуральных колбах с использованием среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением FBS (10%) и антибиотиков (100 Ед / мл пенициллина и 100 мкл г / мл стрептомицина). Эти культуральные колбы поддерживали в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 при 37 ° C. Чтобы оценить влияние экстракта на жизнеспособность клеток, клетки переносили в 96-луночные планшеты по количеству клеток на лунку до тех пор, пока они не достигли слияния. Экстракты (HE, CE, EE, ME, WEE и AE) добавляли при 0, 100, 250 или 500 мк г / мл в течение 24 часов при 37 ° C в атмосфере 5% CO 2 .После периода инкубации среду заменяли на 100 мкл л МТТ (1 мг / мл, растворенный в DMEM). Затем клетки инкубировали в течение 4 ч в атмосфере 5% CO 2 при 37 ° C. Затем лунки отсасывали и кристаллы формазана солюбилизировали добавлением 100 мкл л этанола на лунку [23, 24]. Планшет считывали при поглощении 570 нм с использованием спектрофотометра для микропланшетов Epoch (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA). Жизнеспособность клеток определяли и сравнивали с отрицательным контролем (только DMEM), используя следующую формулу:, в которой соответствовала оптическая плотность экспериментальной группы, а была оптическая плотность отрицательного контроля.

2.7. Антиоксидантная активность in vivo
2.7.1.
Caenorhabditis elegans - Поддержание и лечение

C. elegans N2 (линия дикого типа) были получены из Центра генетики Caenorhabditis (Университет Миннесоты, США) и содержались в среде для выращивания нематод (NGM), засеянной Escherichia coli OP50 при 20 ° C по Бреннеру [25]. Черви синхронизировали с помощью отбеливающего раствора в беременных гермафродитах (NaOCl 1%, NaOH 0.25 M), чтобы иметь животных на стадии L1 (Sulston, Hodgkin, 1988). Для лечения экстракты EE и WEE фильтровали с использованием фильтра 0,22 мкм, мкм (Merck) и добавляли к NGM в конечных концентрациях 1 или 10 мг / мл. Синхронизированные L1 культивировали на чашках NGM, содержащих экстракты, и засевали E. coli OP50 в течение 48 часов при 20 ° C, пока они не достигли стадии L4.

2.7.2. Токсичность для
Caenorhabditis elegans Яйца

Для этого анализа 30 яиц помещали в три чашки NGM, содержащие EE и WEE в концентрации 0, 1 и 10 мг / мл, и выдерживали при 20 ° C в течение 48 часов.После этого подсчитывали количество L4 и яиц. Этот анализ был проведен в трех независимых анализах с общим количеством 90 яиц на группу.

2.7.3. Анализ окислительного стресса

Анализ окислительного стресса проводили с использованием трет-бутилпероксида водорода (t-BOOH) в качестве продуцента АФК [26, 27]. Сорок червей на стадии L4 обрабатывали EE и WEE в концентрациях 0, 1 и 10 мг / мл в течение 48 часов при 20 ° C. После этого червей переносили в 12-луночный планшет, содержащий буфер M9 с 8 мМ t-BOOH, и оценивали каждые полчаса.Те черви, которые не реагировали на раздражитель, считались мертвыми (без движения). Некоторые черви подвергались цензуре, что означает, что червь не был обнаружен или умер по причинам, не связанным с окислительным стрессом. Эти анализы были выполнены в пяти независимых анализах.

2,8. Тонкослойная хроматография (ТСХ)

Для анализов использовали хроматопланшеты с силикагелем. Используемые подвижные фазы были следующими: (i) этилацетат: муравьиная кислота: вода (8: 0,8: 1,), (ii) этилацетат: муравьиная кислота: метанол: вода (10: 0.5: 0,6: 0,2,) и (iii) толуол: этилацетат: муравьиная кислота (5: 5: 0,5,). Визуализация соединения была достигнута путем распыления растворов серного ванилина, 0,5% натурального реагента А (дифенилборилоксиетиламина), 1% хлорида железа в метаноле и Драгендорфа. Стандарты, используемые при ТСХ, были следующими: кверцетин, урсоловая кислота, галловая кислота, изокверцетин, хлорогеновая кислота, эллаговая кислота, изокверцитрин, лютеонин, канферол, рутин, кофейная кислота, катехин, ориентин, изоориентин, витексин и изовитексин (сигмаитексин (сигмаитексин). ).Затем наблюдали за цветом, измеряли коэффициент удерживания (Rf) пятен и сравнивали его с литературными данными [28]. Для ME и EE была проведена Co-TLC для подтверждения присутствия гликозидных флавоноидов, витексина и изовитексина.

2.9. Высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC-DAD)

WE анализировали с помощью HPLC-DAD (Agilent 1260), снабженного колонкой C18 (Zorbax-). Элюирование проводили градиентом 0,1% уксусной кислоты (A) и ацетонитрила (B) следующим образом: 10% B (0-6 мин), 10-15% B (6-7 мин), 15% B (7 мин.). -22 мин), от 15 до 50% B (22-32 мин), от 50 до 100% B (32-42 мин) и 100% B (42-50 мин) при постоянной скорости потока 1 мл / мин .Образец был приготовлен из расчета 1 мг / мл с использованием метанола (степень чистоты для ВЭЖХ), и объем впрыска составлял 3 мк л. Температура колонки составляла 45 ° C, и детектирование проводили при 228, 254, 280, 290, 320. , 340 и 352 нм. Идентификация фенольных соединений была получена путем сравнения времени удерживания и спектров поглощения в УФ-видимой области со стандартными соединениями.

Стандарты, используемые в HPLC-DAD, были следующими: 3-гидроксикоричная кислота (501-52-0), бензойная кислота (65-85-0), кофейная кислота (331-39-5), коричная кислота 92 ( 621-82-9), хлорогеновая кислота (327-97-9), эллаговая кислота (476-66-4), феруловая кислота (1135-93 24-6), галловая кислота (149-91-7), гентизиновая кислота (490-79-9), о-кумаровая кислота (583-17-5), п-кумаровая кислота (501-98-4), розмариновая кислота (20283-92-5), синаповая кислота (530-59-6 ), апигенин (520-36-5), апиин-апигенин-7- (2-O-апиозилглюкозид) (26544-34-3), кемпферол (520-18-3), кемпферол 3-OD-галактозид (23627- 87-4), 3-O-метилкаемпферол (1592-70-7), биоробин-кемпферол 3-O- β -робинобиозид (17297-56-2), никотифлорин-кемпферол 3-O- β рутинозид ( 17650-84-9), катехин (154-23-4), хризин-5,7-дигидроксифлавон (480-40-0), хризоэриол-3-O-метиллутеолин (491-71-4), даидзеин-4, 7-дигидроксиизофлавон (486-66-8), эпикатехин (490-46-0), генистеин-4,5,7-тригидроксиизофлавон (446-72-0), госсипетин-8-гидроксикверцетин (489-35-0), час эсперидин (520-26-3), гесперитин (520-33-2), гистидулин-6-метоксиапигенин (1447-88-7), гомоориентин-лютеолин 6-C- β -D глюкозид (4261-42-1 ), изорамнетин 3-O- β -галактозид (6743-92-6), изорамнетин 3-O- β -D-глюкозид (5041-82-7), кейозид - изорамнетин 3-O-робинобиозид (107740 -46-5), нарциссин-изорамнетин 3-O- β рутинозид (604-80-8), лютеолин (491-70-3), мирицетин (529-44-2), нарингенин (480-41-1 ), неогесперидин (13241-33-3), ориентин-лютеолин-8-C-глюкозид (28608-75-5), кверцетагетин-7-O-глюкозид (548-75-4), кверцетин (117-39-5) , гиперин-кверцетин 3-O- β -галактозид (482-36-0), изокверцетрин-кверцетин 3-O- β -глюкозид (482-35-9), кверцетин 3-O- β - гентиобиозид (7431-83-6), кверцетин-3-O-робинобиозид (52525-35-6), кверцитрин-кверцетин-3-O-рамнозид (522-12-3), рамнетин (90-19-7), рутин- кверцетин 3-O- β -рутинозид (153-18-4), таксифолин-дигидрокверцетин (480-18-2), тилирозид-ка эмпферол 3-O- (6-O-п-кумароил) глюкозид (20316-62-5) и витексин-апигенин 8-C114 глюкозид (3861-93-4).Другие стандарты соответствуют библиотеке, созданной в лаборатории фитохимии факультета ботаники Университета Сан-Паулу.

2.10. Биоинформатический анализ

С помощью анализов ТСХ было обнаружено присутствие двух гликозидных флавоноидов - витексина и изовитексина в экстрактах листьев C. alnifolia . Эти соединения были использованы для поиска в базе данных системной фармакологии традиционной китайской медицины (TCMSP) для генов-мишеней [29]. Данные, полученные в TCMSP, были использованы в базе данных Kyoto Encyclopedia Genes and Gnome (KEGG) [30].Пути, идентифицированные в KEGG, были перечислены в порядке убывания их стоимости. Эти данные использовались для построения сети с использованием String 10 версии 11 (https://string-db.org/).

2.11. Статистический анализ

Все результаты были выражены как. Каждый анализ проводили в трех или пяти экземплярах, и каждый повторяли не менее 3 раз. Статистический анализ выполняли с использованием GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) с использованием вариационного анализа (односторонний дисперсионный анализ) и пост-теста Тьюки для сравнения различных групп.Различия со значениями ≤ 0,05 считались достоверными.

3. Результаты
3.1. Общее содержание сахара, фенольных соединений и белка

Пять экстрактов были получены в последовательности от неполярного до полярного: гексан (HE), хлороформ (CE), этанол (EE), метанол (ME) и водный экстракт (WEE). ), а шестой - только с водно-водной вытяжкой (WE). Таблица 1 показывает, что общее количество фенольных соединений варьировалось от 2,3 μ г / г до 61,26 μ г / г, в порядке HE μ г / г до 225,00 μ г / г, порядок был CE мк г / г.

9039

Экстракты Сахар ( μ г / г) Фенольные соединения ( μ г / г) Белки ( г) 92 92
Гексан (HE) 34.35 2,30 1,4
Хлороформ (CE) 33,45 10,54 1,1
Этанол (EE) 183,81 2 183,81
2 9 ME 225,00 61,26 4,5
Вытяжка на стороне воды (WEE) 128,60 33,63 2,8
Водная вытяжка (WE) 198,56 17.67 2,0

3.2.
In vitro Антиоксидантная активность

Учитывая присутствие фенольных соединений и понимание того, что эти фитохимические вещества могут быть связаны с антиоксидантной активностью, антиоксидантный потенциал каждого из шести экстрактов C. alnifolia был проанализирован с использованием четырех анализов: общая антиоксидантная способность ( TAC), метод свободных радикалов DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразилгидрат), тест на снижение мощности и активность по улавливанию супероксида.

Анализ TAC оценивал способность образца отдавать электроны и, таким образом, нейтрализовать реактивные частицы. Самые высокие значения TAC были обнаружены для ME (111,38 EEAq мг) и EE (96 EEAq мг). WEE (58,25 EEAq мг) и WE (59,89 EEAq мг) представили эквивалентные результаты (рисунок 1 (a)). Для анализа DPPH антиоксидантная активность варьировала от 49% до 114% (рис. 1 (b)). Более того, полярные экстракты показали самую высокую активность для анализа восстанавливающей силы, для которого значения варьировались от 83,9% до 105.4% (рисунок 1 (в)). Аналогичный результат также наблюдался для анализа улавливания супероксидных радикалов, где самые высокие значения наблюдались для полярных экстрактов, и эти значения варьировались от 76,4% до 91% (рис. 1 (d)).

Анализ коэффициента Пирсона

показал положительную корреляцию между содержанием фенольных соединений в экстрактах C. alnifolia и антиоксидантными анализами. Наблюдалась сильная корреляция между TAC и анализом восстановительной мощности (см. Табл. 1) и умеренная корреляция с улавливанием супероксидных радикалов.Кроме того, содержание сахара показало очень сильную корреляцию для анализа снижения мощности и TAC и умеренную корреляцию с улавливанием супероксидных радикалов (см. Таблицу 1).

3.3.
In vivo Analysis

Данные описанных выше антиоксидантных анализов побудили нас провести антиоксидантные анализы in vivo . Однако перед проведением этих анализов необходимо было оценить токсический потенциал этих экстрактов, чтобы исключить возможное вредное воздействие на животных, использованных в экспериментах in vivo .Затем были проанализированы их эффекты на неопухолевые клетки 3T3 и пять линий опухолевых клеток, HeLa, SiHa, PC-3, B16-F10 и PANC-1. После этого Caenorhabditis elegans использовали в качестве модели in vivo .

3.3.1. Жизнеспособность клеток

Для клеточных линий было оценено влияние шести экстрактов на три концентрации (100 μ г / мл, 250 μ г / мл и 500 μ г / мл) (Рисунок 1) . Эти экстракты не влияли на жизнеспособность клеток ни при одной из трех проанализированных концентраций.Однако для ME и WEE наблюдалось снижение жизнеспособности неопухолевых клеток примерно на 25-35% (ME при 250 или 500 μ г / мл и для WEE при 500 μ г / мл) ( Таблица 2). Кроме того, для линий опухолевых клеток в целом не было значительного изменения жизнеспособности клеток. Снижение жизнеспособности клеток на 10-25% для HE, CE и WE наблюдалось для клеточных линий HeLa и SiHa (таблица 2). Таким образом, в целом для неопухолевых и опухолевых клеточных линий экстракты C. alnifolia не были цитотоксичными по отношению к модели in vivo клеточной линии .

10017839 9162 9162
9 HELLO

7

7


500 WEE

Экстракты Конц. Клеточные линии #
NIH / 3T3 HeLa SiHa PC-3 B16-F-10 PANC-1
250
CE 100
250

903 98
EE 100
250

7

ME 100
25039 2 2

100 9 9 9 25039
500

9039 9039 250
500 9038 CE: хлороформный экстракт; EE: этанольный экстракт; ME: метанольный экстракт; WEE: вытяжка из воды; МЫ: водный экстракт. # NIH / 3T3: ATCC CRL-1658 - мышиный фибробласт; HeLa: ATCC CCL-2 - клетка аденокарциномы матки человека; SiHa: ATCC HTB-35 - клетка плоскоклеточной карциномы человека; PC-3: ATCC CRL-1435 - клетка аденокарциномы простаты человека; B16-F10: ATCC CRL-6475 - клетка меланомы кожи мыши; PANC-1: ATCC CRL-1469 - клетки аденокарциномы поджелудочной железы.

3.3.2. Токсичность
C. elegans Яйца

Caenorhabditis elegans имеет непроницаемую кутикулу, которая представляет собой внеклеточный матрикс коллагена, образующий многофункциональный экзоскелет, затрудняющий прохождение веществ [31].Из-за этого использовались более высокие концентрации экстракта по сравнению с анализами клеточных линий. Принимая во внимание результаты, полученные с антиоксидантами и с клеточными линиями, для оценки были выбраны экстракты EE и WE. Для этой модели концентрации экстракта 1 и 10 мг / мл использовались для оценки возможного токсического воздействия на вылупление яиц (рис. 2). По сравнению с контролем, у которого вылупление яиц составляло 70%, оба экстракта, WE и EE, имели аналогичный эффект при дозах 1 мг / мл и 10 мг / мл в диапазоне от 70% до 91% (рис. 2).Следовательно, EE и WE не оказали токсического действия на вылупление яиц в модели C. elegans .


3.3.3.
In vivo Антиоксидантная активность с использованием C . elegans Модель

Поскольку экстракты EE и WE не оказывали токсического действия на вылупление яиц и развитие эмбрионов, эти экстракты были исследованы на предмет их антиоксидантных эффектов in vivo в C. elegans . Для этих анализов использовали диких животных (N2), которым вводили EE и WE в концентрации 1 и 10 мг / мл.Впоследствии эти черви были проанализированы на выживаемость в условиях окислительного стресса (обработка трет-бутилгидропероксидом (t-BOOH)). Повышенная толерантность к условиям окислительного стресса, которым способствовала обработка t-BOOH, наблюдалась при обработках EE и WE (Фигуры 3 (a) и 3 (b)). Для контрольных животных, получавших EE, среднее время выживания составляло 7,5 ч по сравнению со средним временем выживания 10,5 ч для EE (1 мг / мл и 10 мг / мл), что указывает на увеличение на 28,6% (таблица 3). .

74/1077 9038 9038

Условия выживания Среднее время выживания (часы) Вариация среднего значения выживаемости (%) Значение-лог-ранговые тесты (Mantel-Cox) Число погибших животные / цензура

Контроль 7,5 80/0
EE 1 мг / мл 10,5 28,6 EE 10 мг / мл 10.5 28,6 <0,0001 80/0

Для контрольных животных, получавших лечение WE, среднее время выживания составляло 4,8 ч по сравнению с 7,9 ч и 8,2 ч для 1 мг / мл и 10 мг / мл WE, соответственно (рис. 3 (б)). Эта разница представляет собой увеличение на 39,2% (1 мг / мл) и 41,3% (10 мг / мл) при обработке t-BOOH (таблица 4).


Условия выживания Среднее время выживания (часы) Вариация среднего значения выживаемости (%) Значение-лог-ранговые тесты (Mantel-Cox) Число погибших животные / цензура

Контроль 4.8 80/0
WE 1 мг / мл 7,9 39,2 <0,0001 80/0
WE 10 мг / мл 10 41 8,2 0,0001 80/0

3.4. Фитохимические соединения, идентифицированные с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ)

Анализ ТСХ показал, что присутствие фенольных соединений, таких как флавоноиды и их соединения, может быть связано с антиоксидантной активностью, наблюдаемой в анализах in vitro и in vivo .Когда хроматопластинки были обнаружены с использованием серного ванилина, наблюдались красочные пятна сапонинов (CE, EE, ME и WE) и терпенов (CE, EE и ME). Кроме того, на хроматопланшетах, контактирующих с раствором хлорида железа, появлялись пятна, свидетельствующие о наличии фенольных соединений в полярных экстрактах (EE, ME, WEE и EE), а с помощью Natural A Reagent присутствие флавоноидов в полярных экстрактах было наблюдается (EE, ME, WEE и WE). Чтобы идентифицировать некоторые соединения, присутствующие в полярных активных экстрактах, стандарты были использованы в анализе ко-ТСХ, а витексин (зеленый флуоресцентный) и изовитексин (зеленый флуоресцентный) были обнаружены в EE и ME.Наблюдалось присутствие фенольных и флавоноидов во всех полярных экстрактах, особенно EE и ME.

3.5. WE Chemical Profile by HPLC-DAD

Основываясь на результатах, полученных с помощью тестов in vitro, и in vivo для EE и WE и традиционного народного способа получения экстрактов путем мацерации в воде, мы выбрали WE для дальнейшей характеристики с помощью высокой - высокопроизводительная жидкостная хроматография (HPLC-DAD), поскольку ТСХ показала присутствие витексина и изовитексина.

HPLC-DAD показал несколько пиков (рис. 4), которые оценивали при различных УФ-спектрах (228–352 нм).При сравнении со стандартами пик №2 соответствовал галловой кислоте (-280 нм), пик №16 соответствовал р, -кумаровая кислота (-280 нм), а пик №19 - витексину (-280-352 нм). Присутствие витексина согласуется с данными ТСХ.


3.6. Биоинформатический анализ

Биоинформатика - отличный инструмент для сбора данных о потенциальных целях с учетом двух биоактивных молекул, которые были идентифицированы в экстрактах C. alnifolia : витексин и изовитексин.База данных Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) использовалась для определения возможных мишеней для этих биоактивных молекул. Эти молекулы могут быть связаны с путями, связанными с иммунной системой, сердечно-сосудистыми заболеваниями, сигнальными путями, раком, нервной системой и другими. Было выполнено более 32 целей (таблица 5). Когда было проанализировано совпадение между мишенями, наблюдались несколько генных мишеней, таких как IKBKB, PTGS2, RELA, TNF, MAPK7, AR и NF-B (таблица 5 и рисунок 5). Кроме того, биоинформатический подход предполагает, что биоактивные молекулы, идентифицированные в C.alnifolia может обладать как антиоксидантной, так и противовоспалительной активностью.


KEGG Brite ( Homo sapiens ) Скорректированное значение Скорректированное значение Родственные гены (цели)
9 Система иммунной системы 12 2.36-10 IKBKB; PTGS2; RELA; TNF; MAPK7
Передача сигнала 1.37-09 6.97-08 ИКБКБ; ПТГС2; РЕЛА; TNF; MAPK7
Сердечно-сосудистые заболевания 4.96-09 1.30-07 IKBKB; RELA; TNF; MAPK7
Лекарственная устойчивость: противоопухолевый 1.68-08 967-07 KB; TNF
Инфекционная болезнь вирусная 3.30-08 6.17-07 IKBKB; PTGS2; RELA; TNF
Инфекционная болезнь: бактериальная 8.65-07 5.67-06 IKBKB; RELA; TNF
Инфекционное заболевание паразитарное 2.05-07 2.24-06 PTGS2; RELA; TNF; IKBKB
Эндокринная система 1.67-07 2.08-06 IKBKB; RELA; TNF
Сигнальный путь 1.74-07 2.08 IELB39; Разработка и восстановление 1.02-06 6.37-06 IKBKB; RELA; TNF
Болезнь человека: рак 4.00-07 4.03-06 IKBKB; PTGS2; RELA; MAPK7
Эндокринные заболевания и нарушения обмена веществ 6.20-07 4.77-06 IKBKB; RELA; TNF
Нервная система 8.24-07 5.6107 I 90K398
Рост и гибель клеток 1.22-06 7.27-06 IKBKB; RELA; TNF


4.Обсуждение

Coccoloba alnifolia использовалась в народной медицине на северо-востоке Бразилии, но нет никакой научной информации о ее химическом составе или антиоксидантной активности. В этом исследовании химический состав и биологическая активность экстрактов шести листьев были охарактеризованы с использованием ряда растворителей (от аполярного до полярного серийного подхода) [32]. Химический анализ показал наличие сахаров, белков и фенольных соединений. Доля этих компонентов варьировалась в экстрактах; Экстракты EE, ME, WEE и WE содержали большое количество сахара и умеренное присутствие фенольных соединений, тогда как протеин был очень низким во всех экстрактах.

Alam et al. [5] показали, что полярные растворители хороши для извлечения фенольных соединений, а представленные здесь данные показали более высокие концентрации фенольных соединений и флавоноидов в этих экстрактах (EE, WE, ME, WEE и WE). ТСХ также показала присутствие терпенов (CE, EE, ME и WE) и сапонинов (CE, EE, ME и WEE). При совместной ТСХ наблюдали присутствие витексина и изовитексина, тогда как ВЭЖХ-ДАД показала присутствие галловой кислоты, p -кумаровой кислоты и витексина для WE.Хотя эти соединения были ранее идентифицированы у других видов Coccoloba [10, 33, 34], наши результаты являются первыми, чтобы сообщить об их присутствии у C. alnifolia . Исходя из этого, важно оценить антиоксидантную активность и другие биологические активности экстрактов C. alnifolia , которые содержат смесь биоактивных молекул, помимо витексина и изовитексина, которые были идентифицированы с помощью ко-ТСХ [35] и ВЭЖХ-ДАД для МЫ.

Полученные здесь результаты показали превосходный антиоксидантный потенциал для EE, ME, WEE и WE, особенно в отношении снижения мощности и улавливания свободных радикалов DPPH.TAC показал более высокую антиоксидантную активность в отношении EE и ME. DPPH оценивал способность образца улавливать свободные радикалы DPHH, и как анализ снижения мощности, так и анализ TAC анализировали способность образца отдавать электроны. Gusman et al. [34] наблюдали антиоксидантную активность с помощью анализа DPPH для C. cereifera, , а антиоксидантная активность с использованием DPPH также наблюдалась для других видов из Polygonaceae, таких как Rumex japonicus [36] и Polygonum maritimum [37].Эти виды использовались в традиционной медицине в Азии, Европе и Африке, подтверждая данные, полученные здесь для C. alnifolia . Антиоксидантный потенциал может быть связан с фенольными соединениями, а также с сахарами, присутствующими в экстракте, как показано корреляциями Пирсона. Выявленные сахара могут быть связаны с фенольными соединениями, которые связаны с молекулами сахара, такими как флавоноидные гликозиды, конденсированные танины и гликозидные тритерпены, что может объяснить присутствие сахаров в C.alnifolia [38, 39]. Антиоксидантный потенциал, наблюдаемый для этих экстрактов, может быть связан с различными биоактивными молекулами, которые могут действовать, улавливая свободные радикалы и уменьшая действие АФК на клетки, следовательно, поддерживая баланс между производством и деградацией [35, 40, 41].

Анализы in vitro показали, что C. alnifolia обладают интересным антиоксидантным потенциалом, а анализов in vivo с использованием клеточных линий показали, что в целом шесть экстрактов не были цитотоксичными ни для линий неопухолевых клеток 3T3, ни для Hela, SiHa. , Линии опухолевых клеток PC-3, B16-F10 и PANC.С другой стороны, Tsuboy et al. [15] наблюдали, что экстракты корней C. mollis были более цитотоксичными, чем экстракты листьев, в отношении линий опухолевых клеток HTC. He et al. [42] показали, что витексин и изовитексин являются прекрасными антиоксидантными молекулами и обладают широким спектром антиоксидантных, антипролиферативных, противовоспалительных и других свойств. Более того, было подтверждено, что экстракты из C. uvifera и C. cereifera обладают провоспалительной активностью и могут действовать на фактор некроза опухоли α (TNF- α ) [33, 34].Используемый здесь биоинформатический подход с учетом присутствия витексина и изовитексина предполагает, что экстракт C. alnifolia может действовать на TNF- α и простагландин-эндопероксидсинтазу (PTGS или COX). Хабтемариам [35] упомянул, что экстракты представляют собой смесь биоактивных молекул, которые могут действовать синергетически или по отдельности. Более того, было обнаружено, что природные продукты могут действовать на сигнальные пути, например, на сигнальный путь NF- κ B [4, 35, 43–45].Данные биоинформатики с использованием витексина и изовитексина показали, что некоторые гены-мишени были противовоспалительными генами, такими как NF- κ B и COX-2.

Кроме того, было показано, что Caenorhabditis elegans является отличной моделью для определения токсичности химических соединений. Есть некоторые анализы, которые могут показать токсичность, например, вылупление яиц и развитие нематод [46, 47]. Полученные результаты показали, что EE и WE не были токсичными, потому что они не влияли на вылупление яиц, и эти экстракты обладали защитным эффектом от окислительного стресса, когда t-BOOH использовался в качестве стрессорного агента.Эти экстракты увеличивали выживаемость на 28% для EE 1 мг / мл, на 31% для WE 1 мг / мл и на 42% для WE 10 мг / мл по сравнению с контрольными животными. Юэ и др. [48] ​​наблюдали, что p -куаровая кислота способна снижать окислительный стресс у C. elegans , а также увеличивать продолжительность их жизни в условиях окислительного стресса, аналогично тому, что наблюдалось в EE и WE. Choubey et al. [49] показали отличную от галловой кислоты активность из-за ее антиоксидантного потенциала. Таким образом, p -кумаровая кислота, галловая кислота и витексин могут быть некоторыми из биоактивных молекул, присутствующих в нашем экстракте, которые обладают антиоксидантным потенциалом и не токсичны, как показано в данных, представленных здесь для экстрактов Coccoloba alnifolia .

Другие исследования показывают, что фенольные соединения принадлежат к роду Coccoloba . Cota [10], работавший с C. acrostichoides , идентифицировал бетулин и β -ситостерин с помощью ТСХ. Ashmawy et al. [12] при работе с листьями C. uvifera обнаружили эллаговую кислоту, бензойную кислоту, o -кумаровую кислоту, рутин, мирицетин и кверцетин в экстрактах воды, ацетона и этанола. Кроме того, для C. mollis в листьях и побегах идентифицировано тритерпенов, дитерпенов, антрахинонов, фитостероидов и бензолов [11].

Для C. alnifolia в настоящем исследовании наблюдались фенольные соединения, такие как галловая кислота, p -куаровая кислота, витексин и изовитексин, а ВЭЖХ-DAD показала, что существует множество других соединений, которые необходимо идентифицировать. Эти экстракты могут содержать другие биоактивные молекулы, которые могут действовать синергетически с фенольными соединениями, что приводит к окислительной защите, которая снижает эффекты ROS и помогает поддерживать окислительно-восстановительный баланс (производство ROS по сравнению с деградацией ROS) в клетках и тканях [35, 40].Представленные здесь данные показывают, что EE и WE обладают большим потенциалом в качестве природных антиоксидантных продуктов.

5. Выводы

Пять экстрактов листьев Coccoloba alnifolia были получены последовательной экстракцией (с использованием полярных растворителей в полярные растворители), а шестой экстракт был приготовлен только с водой (на основе традиционного народного использования). Полученные здесь данные показывают, что эти экстракты содержат фенольные соединения, терпены, сапонины и флавоноиды (витексин и изовитексин). В анализах in vitro и in vivo было показано, что четыре полярных экстракта, EE, ME, WEE и WE, являются источниками молекул антиоксидантов.В целом эти экстракты не влияли на жизнеспособность шести различных клеточных линий млекопитающих. Более того, EE и WE не влияли на плодовитость нематод Caenorhabditis elegans , использованных в качестве тестовой модели, и защищали их от стрессора t-BOOH, увеличивая продолжительность их жизни. Таким образом, листья Coccoloba alnifolia имеют отличный потенциал для разработки лекарственных средств на травах и в качестве антиоксидантных продуктов. Другие виды биологической активности также могут быть исследованы, чтобы определить, как потенциальные антиоксиданты действуют в клетках.

Доступность данных

Данные, полученные в этом исследовании, можно получить у соответствующего автора по запросу.

Конфликт интересов

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Вклад авторов

S.M.Z.L., R.P.O., H.A.O.R. и K.C.S. задумал и спланировал эксперименты. L.F.M.M., D.L.G., L.F.S., L.M.P.S., M.L.M., C.O.M.C, S.M.Z.L., R.P.O., H.A.O.R. и K.C.S. провел эксперименты, проанализировал данные и написал статью.Все авторы прочитали и одобрили рукопись.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) и Ministãnologia. Авторы выражают благодарность Алин Бертинатто Крус из Лаборатории фитокимики, Департамента ботаники, Университета Сан-Паулу (USP) за помощь в анализе HPLC-DAD.H.A.O. R. и R.P.O. являются заслуженным исследователем стипендии CNPq. L.F.M.M., L.M.P.S. и C.O.M.C. получил стипендию от CAPES.

Дополнительные материалы

Дополнительная таблица 1 показывает анализ коэффициента Пирсона для сахара, белка и фенольных соединений, представленных в каждом из экстрактов Coccoloba alnifolia . Полученные значения были показаны красным цветом, и считалось, что очень сильная корреляция - значения выше 0,9, сильная корреляция - от 0,7 до 0.9. Анализ коэффициента Пирсона показал положительную корреляцию между содержанием фенольных соединений в экстракте Coccoloba alnifolia и антиоксидантным анализом. Была сильная корреляция между TAC и анализом снижающей мощности и умеренная корреляция с улавливанием супероксидных радикалов. Кроме того, содержание сахара показало очень сильную корреляцию для анализа снижения мощности и TAC и умеренную корреляцию с улавливанием супероксидных радикалов. (Дополнительные материалы)

Неочищенный экстракт и фракции плодов Libidibia ferrea демонстрируют противовоспалительное, антиоксидантное и антиноцицептивное действие in vivo и повышают жизнеспособность клеток in vitro

Предпосылки . Libidibia ferrea ( L. ferrea) встречается во всем северо-восточном регионе Бразилии, где он используется в народной медицине с благотворным действием при многих воспалительных заболеваниях. Цель . В этом исследовании изучали фитохимический состав сырого экстракта и фракций плодов L. ferrea и оценивали его противовоспалительную и антиноцицептивную активность in vivo и влияние на жизнеспособность клеток in vitro . Методы .Характеристика полифенолов, присутствующих в неочищенном экстракте (CE), водно-спиртовых фракциях 20-80% этанола (CE20, CE40, CE60 и CE80), водной фракции (AqF) и этилацетатной (EAF) фракции плодов L. ferrea был выполнен хроматографическим анализом . Противовоспалительную активность оценивали с использованием модели перитонита, индуцированного каррагенаном, подвергнутой анализу миграции лейкоцитов и анализу активности миелопероксидазы (MPO). Уровни общего глутатиона и малонового диальдегида (МДА) оценивались для оценки уровня окислительного стресса.Антиноцицептивную активность оценивали с помощью индуцированных уксусной кислотой абдоминальных корчей и теста горячей пластинки. In vitro Жизнеспособность клеток определяли с использованием МТТ-анализа на линии эмбриональных клеток фибробластов мыши (клетки 3T3). Результаты . Хроматография выявила наличие содержания эллаговой кислоты в EAF (3,06), CE (2,96) и CE40 (2,89). Галловая кислота была обнаружена в EAF (12,03), CE 20 (4,43) и CE (3,99). Неочищенный экстракт L. ferrea и все фракции значительно снижали миграцию лейкоцитов и активность МПО (p <0.001). L. ferrea антиоксидантный эффект наблюдался через высокие уровни общего глутатиона и снижение уровней MDA (p <0,001). Ноцицепция, индуцированная уксусной кислотой, значительно подавлялась после введения сырого экстракта L. ferrea и всех фракций (p <0,001). Неочищенный экстракт и все фракции значительно увеличили жизнеспособность линии клеток 3T3 (p <0,05). Выводы . Соответствующая процедура экстракции сохраняет химические компоненты л.ferrea фрукты, такие как галловая кислота и элларгиновая кислота. Неочищенный экстракт и фракции плодов L. ferrea проявляли противовоспалительную, антиоксидантную, антиноцицептивную активность in vivo и повышали жизнеспособность клеток in vitro .

1. Введение

Fabaceae ( Leguminosae ) - одно из наиболее экономически важных ботанических семейств. Есть много полезных видов, и многие из них культивировались с древних времен, в основном из-за их пищевого и лечебного потенциала, хотя есть несколько других полезных свойств. Libidibia ferrea (L. ferrea) , широко известная как jucá или pau-ferro, представляет собой вид семейства Leguminosae , имеющий множество медицинских применений [1]. Исследования, проведенные с видами семейства Leguminosae , продемонстрировали антигельминтную, противомалярийную, противовоспалительную и анальгезирующую активность [2–5].

L. ferrea встречается по всему северо-востоку Бразилии [6]. L. ferrea широко используется для лечения диабета и ревматизма и обладает гепатопротекторным, противозачаточным, обезболивающим, противовоспалительным и сердечно-сосудистым действием [7].В народной медицине описаны несколько лечебных свойств плода L. ferrea [8]. Bacchi et al. [9, 10] описали действие неочищенного водного экстракта против язвы желудка в дополнение к его противовоспалительной и анальгетической активности [11, 12]. Кроме того, анализ МТТ, проведенный с частично очищенными фракциями L. ferrea , показал ингибирующий эффект на нормальный рост клеток [8].

На восстановление тканей и фиброз можно влиять путем непосредственной модуляции воспалительной реакции и манипулирования эндогенными профибротическими медиаторами, которые активируют важные клетки в месте раны, такие как фибробласты и макрофаги [13].Баланс между провоспалительными и противовоспалительными медиаторами и секвестром активных форм кислорода (АФК) необходим для восстановления нормальной архитектуры тканей. Следовательно, терапевтические стратегии должны быть разработаны таким образом, чтобы они не влияли отрицательно на прорегенеративные пути [14].

Известно, что некоторые соединения L. ferrea ответственны за биологическую активность, например фенольные соединения и сапонины [15] . Учитывая популярное использование L.ferrea и принимая во внимание необходимость дальнейших исследований для изучения его фармакологических свойств, в этом исследовании была проведена фитохимическая характеристика неочищенного экстракта и фракций его плодов, а также оценены его противовоспалительная и антиноцицептивная активность на экспериментальной модели in vivo и его влияние на жизнеспособность клеток in vitro .

2. Материал и методы
2.1. Травяной материал

Травяной материал состоял из плодов Libidibia ferrea (Mart.ex Tul.) L.P.Queiroz. var. ferrea собрано в Лимуэйро (PE), Бразилия. Ваучерный образец был депонирован в Агрономическом институте Пернамбуку (IPA) под номером 88145. Материал был стабилизирован сушкой в ​​сушильном шкафу с циркулирующим воздухом (40 ° C) в течение 7 дней перед измельчением и экстракцией.

2.2. Получение КЭ и обогащенных фракций
Libidibia ferrea Фрукты

Экстракты были получены путем помутнения в пропорции 10% (м / об.) С использованием следующего в качестве растворителя: воды (СЕ) или водно-спиртового 20-80% этанола (СЕ20, CE40, CE60 и CE80, об / об).Затем экстракты концентрировали в роторном испарителе для удаления этанола и замораживали при -80 ° C в течение трех дней. Экстракты лиофилизировали для получения неочищенного водного экстракта (СЕ) и водно-спиртовых экстрактов (СЕ20, СЕ40, СЕ60 и СЕ80%, об. / Об.).

Приблизительно 10,0 г каждого CE восстанавливали в воде в соотношении 1:10 (мас. / Об.), А затем распределяли с помощью 100 мл этилацетата (12 раз). Наконец, фракции объединяли и концентрировали для удаления органического растворителя, замораживали и затем лиофилизировали.В результате были получены следующие фракции: этилацетатная (EAF) и водная (AqF).

2.3. Хроматографический анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с обнаружением диодной матрицы (HPLC-DAD)
2.3.1. Образцы Растворы для жидкостной хроматографии-анализа

Около 50,0 мг каждого предварительно взвешенного образца (СЕ или фракции) переносили в мерные колбы на 25,0 мл. После добавления 20,0 мл сверхчистой воды (Elga®) колбы переносили в ультразвуковую баню (Ultracleaner, Unique®) до полного растворения.Объем доводили до 25,0 мл, и каждый образец (СЕ; водно-спиртовые экстракты 20-80% EtOH; или фракции) разбавляли до 1 мг / мл сверхчистой водой. Галловую кислоту (чистота 96%, Sigma®) [16] и эллаговую кислоту из коры дерева (чистота 95%, Sigma®) [16, 17] использовали в качестве эталонов. CE, водно-спиртовую смесь 20-80% этанола (CE20, CE40, CE60 и CE80, об. / Об.), Фракции, EAF, AqF и стандарты фильтровали через поливинилидендифторид (PVDF) 0,45 мкм мкм мембрану ( Macherey-Nagel®) перед анализом методом жидкостной хроматографии.Анализы HPLC-DAD проводили в трех повторностях.

2.3.2. Хроматографические условия

Хроматографический анализ проводился по ранее описанной методике [18]. Это было выполнено с помощью LC-прибора Thermo Scientific (Mod. Ultimate 3000), оснащенного DAD, бинарным насосом (Mod. HPG-3x00RS), дегазатором и автосэмплером, снабженным петлей 20 μ L (Mod. ACC). -3000). Программное обеспечение Chromeleon 6.8 (Dionex®) использовалось для сбора и обработки данных.

A C 18 -колонна (250 мм x 4.Внутренний диаметр 6 мм, 5 мкм м; Dionex®), защищенную защитной колонкой C 18 , использовали для хроматографического разделения. Градиентное элюирование достигалось изменением соотношения растворителя B (метанол с 0,05% об. / Об., Трифторуксусная кислота) к растворителю A (вода с 0,05% об. / Об., Трифторуксусная кислота) при скорости потока 0,8 мл / мин. в соответствии со следующей программой градиента: 10–25% B (10 мин), 25–40% B (5 мин), 40–70% B (10 мин), 75% B (5 мин) и 75–10 % B (1 мин). Анализ проводился при температуре 23 ± 2 ° C при длинах волн 254 нм и 270 нм для обнаружения эллаговой кислоты и галловой кислоты соответственно.

2.4. Исследования in vivo

Все тесты in vivo были одобрены Комитетом по этике использования животных / CEUA / Федеральным университетом Риу-Гранди-ду-Норти / UFRN, номер протокола: 001/2015 Федерального университета Риу-Гранди-ду-Норти, Бразилия. Протоколы исследований и ухода за животными следовали рекомендациям Руководства по уходу и использованию лабораторных животных (Публикация NIH № 85-23, пересмотренная в 1985 г.).

2.4.1. Мыши

Эксперименты выполнены на самцах мышей Swiss в возрасте 60 дней (40 ± 2.0 г), полученный из Центра биологических наук вивария УФРН и поддерживаемый в стандартных условиях (например, 12-часовой цикл свет / темнота, 22 ± 0,1 ° C и влажность 50–55%) с кормом и водой, подходящими для предоставленных видов ad libitum . После акклиматизации животные голодали в течение 12 часов с водой ad libitum перед экспериментами. В конце эксперимента животных умерщвляли передозировкой тиопентала, вводимого внутрибрюшинно (100 мг / кг, 0,5%, тиопентакс, Кристалия, Сан-Паулу, Бразилия).

2.4.2. Каррагинан-индуцированный перитонит Модель

Каррагинан-индуцированное перитониальное воспаление выполняли, как описано ранее [19]. Мыши были рандомизированы в девять групп (n = 5 / группа): группа, предварительно перорально обработанная носителем (0,9% физиологический раствор) / каррагинан (C), диклофенак в дозе 10 мг / кг (D), CE, CE20, CE40. , CE60, CE80, EAF и AqF в дозах 50 мг / кг, 100 мг / кг или 200 мг / кг. Через 30 минут мышам внутрибрюшинно (т.е.п.) инъекция. В группе физиологического раствора (S) (0,1 мл / 10 г) внутрибрюшинно вводили носитель (1 мл воды / 10 г, перорально) и 0,9% стерильный физиологический раствор [19]. Через четыре часа мышей вводили внутрибрюшинную анестезию тиопенталом. Перитонеальный экссудат собирали промыванием брюшины 3 мл физиологического раствора и использовали для подсчета клеток в камере Нойбауэра. Затем образцы центрифугировали при 10000 в течение 10 минут при 4 ° C и супернатант хранили при -80 ° C для анализа активности миелопероксидазы (MPO) и для оценки уровней малонового диальдегида (MDA) и общего глутатиона.

2.4.3. Определение активности миелопероксидазы

Активность МПО измеряли согласно Krawisz et al. [20]. Аликвоту (100 мкл, л) каждого образца разбавляли в буфере бромида гексадецилтриметиламмония (HTAB, Sigma Aldrich, Сан-Паулу, Бразилия) и гомогенизировали. Дублированные образцы обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут, а затем центрифугировали при 10000 об / мин в течение 15 минут при 4 ° C и трижды замораживали-оттаивать. К образцам добавляли 200 мкл мкл окрашивающего реагента (о-дианизидин дигидрохлорид), и значения оптической плотности при 450 нм регистрировали с помощью спектроскопического УФ / видимого анализа (Biotek, Сан-Паулу, Бразилия).Данные по абсорбции были интерполированы из стандартной кривой миелопероксидазы нейтрофилов человека и пероксидазы хрена. Одна единица MPO (U) была определена как активность, которая разлагает 1 нмоль / мин перекиси водорода при 25 ° C. Результаты были выражены как U / μ L.

2.4.4. Определение общего содержания глутатиона

Общее содержание глутатиона определяли количественно с использованием метода, описанного Андерсоном [21], в котором воспалительный лаваж разбавляли 5% раствором трихлоруксусной кислоты в дистиллированной воде после гомогенизации и центрифугирования при 10000 об / мин в течение 15 минут. при 4 ° C.Дополнительно добавляли 20 мкл мкл / лунку раствора дитиобиснитробензойной кислоты (DTNB) и 140 мкл мкл / лунку НАДФН. Образцы инкубировали при 30 ° C в течение 5 минут и добавляли ферментативный раствор GSHred (Sigma Aldrish, Сан-Паулу, Бразилия). Оптическую плотность оценивали при длине волны 412 нм с помощью спектроскопа UV / VIS (Biotek, Сан-Паулу, Бразилия), и общее содержание глутатиона в каждом образце определяли путем интерполяции их поглощения на стандартной кривой очищенного глутатиона ( γ - L-глутамил-L-цистеинил-глицин, Sigma Aldrish, Сан-Паулу, Бразилия, G4251).Результаты представлены в нмоль / мк л.

2.4.5. Определение содержания малонового диальдегида

Производство MDA измеряли в соответствии с методом, ранее описанным Esterbauer и Cheeseman [22] для оценки перекисного окисления липидов. Образцы перитонеальной жидкости разбавляли в буфере Tris HCl (TRIZMA HCl, Sigma Aldrich, Сан-Паулу, Бразилия) в дистиллированной воде (20 мМ, pH 7,4) после гомогенизации и центрифугирования при 10000 об / мин в течение 10 минут при 4 ° C. К каждому образцу хромогенный реагент (10.Добавляли 3 мМ 1-метил-2-фенилиндол в ацетонитриле 3: 1) и HCl (37%). Затем их инкубировали в течение 40 минут при 45 ° C и центрифугировали при 10000 об / мин в течение 5 минут при 4 ° C. Поглощение регистрировали при 586 нм с использованием спектроскопического УФ / видимого анализа (Biotek, Сан-Паулу, Бразилия) и интерполировали на стандартную кривую с 1,1,3,3-тетраэтоксипропаном. Результаты представлены в нмоль / мкл л.

2.4.6. Оценка антиноцицептивной активности

Тестирование горячей пластиной (центральная анальгетическая активность). Тест на тепловую чувствительность проводили на мышах с использованием оборудования горячей плиты Insight (Сан-Паулу, Бразилия) при температуре 55 ± 0,5 ° C (Kuraishi et al., 1983) и на мышах, у которых наблюдался ноцицептивный период ответа от 5 до 30 с. Время ожидания для облизывания задней лапы или прыжка считалось показателем ноцицептивного порога, и время отсечки составляло 60 с. Предварительно выбранных мышей случайным образом разделили на группы (n = 5 / группу): 0,9% физиологический раствор (10 мл / кг) (группа отрицательного контроля), морфин (10 мг / кг, т.p.), а также CE, CE20, CE40, CE60 и CE80 AqF и EAF, группы экстракта и неочищенной фракции получали пероральные дозы 50 мг / кг, 100 мг / кг и 200 мг / кг. Затем каждую мышь помещали на горячую пластину и регистрировали время, необходимое животным, чтобы прыгнуть или лизнуть одну из задних лап. Латентный период ответа регистрировали с интервалами 30 мин, 60 мин, 90 мин и 120 мин после введения соответствующего лечения.

Тест на абдоминальные спазмы, вызванные уксусной кислотой (периферическая анальгетическая активность). Периферическую антиноцицептивную активность оценивали с использованием метода искривления, вызванного уксусной кислотой [23]. После 12-часового голодания самцов мышей случайным образом делили на группы (n = 5 / группу): группу, получавшую физиологический раствор (10 мл / кг перорального физиологического раствора), группу, обработанную пероральным индометацином (10 мг / кг), и контрольную группу AA. Другие группы получали пероральные дозы CE, CE20, CE40, CE60, CE80, AqF и EAF (50 мг / кг, 100 мг / кг и 200 мг / кг). Через 30 минут после введения препарата каждую группу подвергали ноцицептивной стимуляции 0.6% уксусная кислота (об. / Об., Внутрибрюшинно), чтобы вызвать искривления. После 3 мин введения уксусной кислоты ноцицептивные ответы проверяли путем подсчета количества корчков, наблюдаемых у каждой мыши в течение 20 минут.

2.4.7. Результаты экспериментов

Во время экспериментов регистрировали поведение и гибель животных.

2,5. Исследование in vitro
2.5.1. Анализ жизнеспособности клеток

Клеточная линия 3T3 эмбриональных фибробластов мыши была получена из Коллекции культур Федерального университета Рио-де-Жанейро и культивирована в модифицированной культуральной среде Дульбекко (DMEM), снабженной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% антибиотиками ( пенициллин / стрептомицин) при 37 ° C в атмосфере 5% CO 2 .Инвертированный световой микроскоп (NIKON CFI60-Spectrum Bioengineering Medical Hospital LTDA, BR) использовали для мониторинга роста клеток, и поддержание клеток выполняли каждые 3 дня. Пролиферацию клеточной линии определяли с помощью колориметрического анализа на основе тетразолиевой соли МТТ (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид), который оценивает жизнеспособность клеток по ферментативной активности митохондрий. дегидрогеназы. Клетки 3T3 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 5.000 клеток / см 2 с последующей инкубацией в течение 24 часов. Затем применяли неочищенных экстрактов и фракций L. ferrea (AAq, FAq, 80T, 60T, 40T и 20T) в концентрациях 0 мкг, мкг / мл, 10 мкг, мкг / мл, 15 мкл. г / мл, 20 μ г / мл, 25 μ г / мл и 30 μ г / мл. Цисплатин (50 мкМ М / мл) использовали в качестве контроля гибели клеток, а витамин С в качестве антиоксидантного контроля клеток (50 мкМ М / мл). После периода обработки (24 часа, 48 часов и 72 часа) в каждую лунку добавляли 100 мкл мкл раствора МТТ (5 мг / мл).После инкубации клеток в течение 4 ч среду удаляли и добавляли 100 мкл мкл этанола на лунку. Планшеты встряхивали в течение 15 мин и оптическую плотность измеряли на считывающем устройстве для микропланшетов (Epoch-BioTek Instruments Inc., США) при длине волны 570 нм с использованием программного обеспечения Gen5 Data Analysis версии 2.0 (BioTek Instruments Inc., США).

2.6. Статистический анализ

Нормальность данных была проверена с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. После подтверждения нормальности данных мы применили параметрические тесты.Для сравнения средних значений был проведен односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони. Уровень статистической значимости был установлен на уровне p <0,05. Статистический анализ и построение графиков выполнялись с помощью Graphpad Prism версии 5.04.

3. Результаты
3.1. Хроматографические анализы с помощью HPLC-DAD

Хроматографический анализ показал пики, относящиеся к галловой и эллаговой кислотам, со временем удерживания 8,2 и 24,8 мин, соответственно.Хроматографические профили для CE, CE20, CE40, CE60 и CE80 L. ferrea показаны на рисунке 1. Учитывая разделение CE с помощью этилацетата, полученные хроматограммы для анализа EAF и AqF представлены на рисунке 2. Рассчитанные значения для каждого из маркеров в сырых экстрактах, EAF и AqF, суммированы в таблице 1. Более высокое содержание эллаговой кислоты наблюдалось для EAF (3,06), за которым следуют CE (2,96) и CE40 (2,89). Наибольшее содержание галловой кислоты обнаружено в ЭДП (12.03), за которым следуют CE20 (4,43) и CE (3,99) (таблица 1).

2,977 9103

Образцы Галловая кислота Эллаговая кислота

CE 20% (CE20) 2,78 (0,94) 4,43 (0,24)
CE 40% (CE40) 2,89 (0,42) 3.39 (0,65)
CE 60% (CE60) 2,73 (1,76) 1,61 (0,64)
CE 80% (CE80) 2,61 (0,31) 1,84 (0,32)
AqF 1,22 (0,23) 1,98 (0,28)
EAF 3,06 (1,08) 12,03 (0,25)


9 среднее (относительное стандартное отклонение) трех независимых измерений.CE: неочищенный водный экстракт; AqF: водная фракция неочищенного водного экстракта; EAF: этилацетатная фракция.



3.2. Активность in vivo

Все мыши находились в здоровом состоянии и были включены в эксперименты. В общей сложности 100% рандомизированных животных экспериментальной модели были включены в модель перитонита, индуцированного каррагинаном, тестом на горячей пластине и тестом на корчи, вызванные уксусной кислотой. Ни одно животное не было исключено из исследования.Побочных эффектов не наблюдалось.

3.2.1. Анализ миграции лейкоцитов

Предварительная обработка CE, CE20, CE40, CE60, CE80, EAF и AqF во всех дозах значительно снизила количество клеток, мигрирующих к месту воспаления, по сравнению с группой положительного контроля (p <0,001). Группы, получавшие экстракты, и группа, получавшая диклофенак, не показали значительных различий по сравнению с группой отрицательного контроля (Фигуры 3 (a), 3 (b) и 3 (c)).

3.2.2. MPO Activity

The i.п. инъекция каррагинана привела к увеличению активности МПО, наблюдаемой в группе положительного контроля. Обработка СЕ и всеми фракциями во всех дозах способна вызвать снижение активности МПО по сравнению с положительным контролем (p <0,001; Фигуры 4 (a), 4 (b) и 4 (c)), подтверждая лейкоциты. данные миграции.

3.2.3. Общее содержание глутатиона

Острый воспалительный процесс привел к значительному снижению уровня общего глутатиона в группе положительного контроля по сравнению с группой отрицательного контроля.В испытанных дозах CE и фракции плодов L. ferrea оказали положительный эффект, наблюдаемый по увеличению общих уровней глутатиона . Как и ожидалось, повышение уровня глутатиона также наблюдалось в группе, получавшей диклофенак (p <0,001). Такие результаты указывают на важную антиоксидантную активность, проявляемую L. ferrea (Рисунки 5 (a), 5 (b) и 5 ​​(c)).

3.2.4. Содержание MDA

Данные показали, что CE и фракции L.Плоды ferrea смогли значительно снизить уровни МДА при всех испытанных дозах (Рисунки 6 (а), 6 (b) и 6 (c)). Группа положительного контроля показала значительно более высокий уровень МДА по сравнению с группами, получавшими лечение (диклофенак, CE и фракции) и группой отрицательного контроля (p <0,001), что подтверждает пониженное перекисное окисление липидов.

3.2.5. Оценка антиноцицептивной активности

Тестирование горячей пластиной. Данные нулевого времени показали, что в начале эксперимента не было значительной разницы между группами.Доказательства центральной анальгетической активности наблюдались в группе, получавшей морфин, во все время оценки (p <0,05). Группа, получавшая CE, продемонстрировала анальгетическую активность в дозе 100 мг / кг в течение 90 минут (p <0,05) и в дозе 200 мг / кг в течение 60 и 90 минут (p <0,05). Группа, получавшая AqF в дозе 200 мг / кг, проявляла центральное обезболивающее действие с 90-минутным интервалом (p <0,05). Не наблюдалось преемственности между дозами и поддержанием центральной анальгетической активности.Не было значимости центральной антиноцицептивной активности, оцениваемой в тесте с горячей пластиной в другие интервалы времени (p> 0,05). Другие группы не показали соответствующей центральной анальгетической активности (таблица 2).

+ 7,8 9 3,3 7 8,0 9108 16,8 + 3,3 121077 8,677 9,677 9,677 + 3,2 9 + 2,9

Назначенное лечение Начальная латентность боли Латентность боли в указанные моменты времени 9038 мин. 60 мин 90 мин 120 мин

Контроль (физиологический раствор) 13 + 5.0 6,2 + 6,8 4,8 + 3,3 7,8 + 5,1 6,3 + 2,1

Морфин (10 мг / кг) 8 + 2,3 910 + 3,0 23 25 + 6,4 26 + 2,6

CE 50 мг / кг 7,6 + 2,3 13,2 + 3,4 3,6 + 2,7 810 + 2,2

CE 100 мг / кг 6.6 + 2,1 8,8 + 2,2 8,0 + 2,0 22. 7 + 2,7 10, 4 + 2,9

CE 200 мг / кг 5,3 + 3,2 10,6 + 2,2 22. 0+ 3,2 23,1+ 2,7 6,6 + 4,1

CE20- 50 мг / кг 5,8 + 3,1 13,6 + 4,0 7,6 + 2,55 8,4 + 2,8 12,2 + 3,2

CE20-100 мг / кг 7.0 + 2,0 7,6 + 2,9 8,0 + 2,6 9,0 + 3,0 10 + 2,2

CE20-200 мг / кг 8,0 + 3,2 8 10,8 + 2,8 + 2,8 8,2 + 3,4 10,4 + 2,7 7,4 + 4,1

CE40-50 мг / кг 5,9 + 2,0 8,4 + 3,2 7,6 + 2,9 9,2 11,8 + 3,5

CE40-100 мг / кг 6.0 + 3,2 13,2 + 2,6 7,2 + 2,5 3,6 + 3,1 9,6 + 3,0

CE40-200 мг / кг 7,6 + 1,9 8 17,4 + 2,9 17 + 2,8 12,8 + 2,1 16,8 + 2,8

CE60-50 мг / кг 5,9 + 2,3 5,6 +2,8 9,0 + 3,4
8,2 + 2,3

CE60-100 мг / кг 6.2 + 2,2 8,8 + 4,0 9,0 + 3,4 7,2 + 2,4 9,4 + 2,6

CE60-200 мг / кг 6,0 + 2,0 910 + 2,2 910 + 2,2 9039 + 11,8 12,6 + 2,4 17,2 + 2,9

CE80-50 мг / кг 6,5 + 3,2 8,8 + 3,7 7,6 + 2,9 9,410 + 2,9 9,4 4 + 2,8

CE80-100мг / кг 7.0 + 3,2 12,6 + 2,8 8,6 + 2,8 13,4 + 3,3 10,2 + 3,2

CE80-200 мг / кг 6,0 + 3,2 7,2 + 2,4 16,2 + 3,0 14,8 + 3,2

EAF50 мг / кг 4,5 + 2,0 7,25 + 2,3 13,4 + 3,0

EAF100 мг / кг 4.5 + 2,0 9,0 + 4,0 8,4 + 3,2 9,8 + 2,7 10 + 2,2

EAF200 мг / кг 5,0 + 2,2. 6,0 + 2,7 4,8 + 3,7 10,4 + 2,7 6,2 + 3,9

AqF50 мг / кг 4,8 + 1,9 6,0 + 2,7 11 8,8 + 3,1 12,2 + 3,2

AqF100 мг / кг 5.0 + 2,0 8,8 + 3,6 9,0 + 3,4 9,8 + 2,7 10 + 2,2

AqF200 мг / кг 5,4 + 2,2 8 6,610 + 3,3 1,8 22,4 + 2,6 7,4 + 4,1

Сокращения живота, вызванные уксусной кислотой. i.p. Введение уксусной кислоты вызывало значительно большее количество спазмов в животе в группе положительного контроля по сравнению с группой, получавшей экстракты в различных дозах (p <0.001) (Рисунки 7 (a), 7 (b) и 7 (c)). Количество сокращений в животе - широко используемый параметр для оценки периферической анальгетической активности соединения. Следовательно, эти результаты показывают, что CE и фракции L. ferrea обладают периферической анальгетической активностью.

3.2.6. Результаты экспериментов

Записи не показали изменений в поведении или гибели животных во время экспериментов с моделями.

3.3. Активность in vitro
3.3.1. Анализ жизнеспособности клеток

Анализ in vitro был выполнен с помощью колориметрического анализа МТТ в 24 часа, 48 часов и 72 часа для линии 3T3, чтобы оценить эффект CE и фракции L.ferrea по жизнеспособности клеток (рис. 8). CE и все фракции были способны вызывать значительное увеличение жизнеспособности клеток в периоды 24, 48 и 72 часа по сравнению с контрольными группами, получавшими цисплатин и витамин C (p <0,05).

4. Обсуждение

Это исследование было направлено на установление научной основы для популярного использования различных препаратов L. ferrea Linn fruit. В народной медицине он используется для лечения бронхолегочных заболеваний, желудочно-кишечных заболеваний, диабета, ревматизма, воспалений и ран в целом [7].Результаты настоящего исследования показывают, что неочищенные и водно-спиртовые экстракты плодов L. ferrea Linn обладают антиоксидантным, противовоспалительным и периферическим антиноцицептивным действием на экспериментальной модели на животных. Кроме того, они не проявляли цитотоксической активности in vitro , что подтверждается анализом МТТ на жизнеспособность фибробластов 3T3.

В литературе показано, что после 72 часов лечения различными дозами галловой кислоты в клетках 3T3 не наблюдалось цитотоксичности [24].Анализ МТТ, проведенный на эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC), показал, что более высокая концентрация эллаговой кислоты может вызывать уменьшение числа клеток из-за ингибирования пролиферации клеток, но не гибели клеток [25]. CE и все фракции были способны вызывать значительное увеличение жизнеспособности линии клеток 3T3 в трех оцененных периодах по сравнению с контролем. Guerra et al. [26] получили аналогичные результаты, в которых неочищенные экстракты плодов L. ferrea были способны оказывать защитное действие на неопухолевую клеточную линию HEK-293, которая демонстрирует высокие скорости клеточной пролиферации и жизнеспособные клетки.

Противовоспалительные и обезболивающие свойства некоторых членов семейства Fabaceae описаны в литературе [8, 11, 12, 27, 28]. Растущее число исследований показало, что дубильные вещества, основные составляющие L. ferrea , обладают защитной активностью в нормальных клетках [29–35]. Среди них галловая и эллаговая кислоты сильно присутствуют в L. ferrea. Фитохимический анализ выявил присутствие галловой кислоты и эллаговой кислоты в СЕ и фракциях L.ferrea , которые считаются основными компонентами, ответственными за эти эффекты.

Эти соединения могут действовать на сигнальные пути, которые не регулируются во время боли, воспаления и окислительного стресса. В модели перитонита, индуцированного каррагинаном, острое воспаление регулируется медиаторами воспаления, высвобождаемыми нейтрофилами и макрофагами, особенно серотонином, брадикинином и гистамином в первые часы и простагландинами позже. Медиаторы, высвобождаемые в результате усиленной миграции клеток в очаг воспаления, вызывают расширение сосудов и гипералгезию, индукцию образования эритемы, отека и повышенной проницаемости [36].

Рекрутинг лейкоцитов в очаг воспаления является ключевым фактором развития воспалительного процесса. Поэтому мы исследовали противовоспалительный потенциал CE и фракций плодов L. ferrea на модели перитонита, индуцированного каррагинаном. В этой модели каррагинан, мощный флогистический агент, вызывает миграцию лейкоцитов в брюшную полость. Это исследование показало, что CE, CE20, CE40, CE60 и CE80, а также фракции AqF и EAF из л.ferrea , снижает количество воспалительных клеток в очаге воспаления. Переход лейкоцитов к очагам воспаления - это строго регулируемый процесс, который представляет собой потенциальную терапевтическую мишень. Результаты, полученные с различными дозами CE и фракциями плодов L. ferrea , показали результаты, аналогичные тем, которые наблюдались в группе, получавшей диклофенак (10 мг / кг), мощное противовоспалительное средство, обычно используемое в текущих терапевтических выборах.

Фермент МПО, присутствующий в азурофильных гранулах нейтрофилов, действует на эндотелий, способствуя высвобождению провоспалительных медиаторов и стимулируя экспрессию молекул адгезии, которые вызывают увеличение проницаемости сосудов и адгезию нейтрофилов [37].КЭ и фракции плодов L. ferrea в исследованных дозах приводили к снижению активности МПО. Таким образом, результаты показывают, что снижение клеточного притока после обработки ХЭ и фракциями сопровождается заметным снижением активности МПО.

Выраженное рекрутирование клеток вызывает окислительный стресс, который можно проанализировать, определив общий уровень глутатиона, критически важную антиоксидантную защиту. Эллаговая кислота может способствовать антиоксидантному потенциалу лекарственных растений.Благоприятный эффект СЕ и фракций плодов L. ferrea во всех дозах снижал окислительный стресс за счет ингибирования снижения уровня общего глутатиона. В группе положительного контроля был выявлен низкий уровень общего глутатиона, что указывает на повышенную уязвимость к окислительному стрессу. EAF и AqF продемонстрировали увеличение уровня общего глутатиона. Эти результаты подтверждают результаты, обнаруженные Karakurt et al. [38], которые исследовали возможную роль эллаговой кислоты в антиоксидантном потенциале лекарственного растения Epilobium hirsutum в печени крыс.

Другой биомаркер, используемый для оценки окислительного стресса, - это MDA, основной вторичный продукт перекисного окисления липидов, который указывает на окислительное повреждение клеток и тканей. Важная антиоксидантная активность экстрактов и фракций подтверждается значительным снижением уровня МДА. На основании проанализированных параметров результаты позволяют предположить, что CE и фракции обладают предполагаемой противовоспалительной и антиоксидантной активностью. EAF и AqF демонстрируют линейность, проявляя аналогичную активность в трех испытанных дозах.Водно-спиртовые фракции показали большее снижение уровней МДА при дозах 50 и 200 мг / кг, тогда как CE представил аналогичные результаты при дозах 50 и 100 мг / кг и более низкую активность при дозе 200 мг / кг.

Воспалительные процессы обычно связаны с болью в результате высвобождения медиаторов, которые стимулируют периферические и центральные ноцицептивные пути. Медиаторы воспаления могут стимулировать местные сенсорные нейроны, способствуя возникновению ноцицепции. Простаноиды, а также цитотоксины, которые высвобождаются при повреждении тканей, будут влиять как на развитие воспалительного процесса, так и на гиперноцицептивный сигнал [39].

В этом смысле мы оценили антиноцицептивную активность CE и фракций плодов L. ferrea с помощью модели абдоминальных корчей, индуцированных уксусной кислотой (периферическая) и теста горячей пластинки (центральная). В модели абдоминальных корчей CE и все фракции во всех дозах проявляли антиноцицептивную активность. Периферическая антиноцицептивная активность экстрактов может быть связана с их подавляющим действием на провоспалительные медиаторы, такие как простагландины и лейкотриены, из-за ингибирования ферментов, участвующих в воспалительном каскаде, а именно циклооксигеназы, липоксигеназы и фосфолипазы А2.Группы, получавшие лечение, продемонстрировали очевидную анальгетическую активность в модели абдоминальных корчей, демонстрируя, что уменьшение воспалительного процесса сопровождается явным уменьшением боли на периферическом уровне. Обезболивающий механизм спазмов в животе включает различные ноцицептивные механизмы, такие как процесс или высвобождение метаболитов арахидоновой кислоты посредством биосинтеза циклооксигеназы и простагландина, опиоидные механизмы, местные перитонеальные рецепторы и медиаторы, связанные с ацетилхолином и гистамином, а также медиаторы симпатической системы [40].

В исследовании Sawada et al. [11], водный экстракт семян L. ferrea ингибировал первую и вторую фазы теста с формалином (10 мг / кг) и теста горячей пластиной (10 мг / кг), что указывает на то, что L. ferrea также действует на центральные ноцицепция. В настоящем исследовании с моделью горячей пластины значительная центральная антиноцицептивная активность была обнаружена только при лечении CE в дозе 100 мг / кг в течение 90 минут с латентным периодом 22,7 ± 2,7 с и при 200 мг / кг в 60 и 60 минут. Время 90 минут с задержкой 22 ± 3.2 и 23 ± 2,7 соответственно и с AqF (22,4 ± 2,6) в дозе 200 мг / кг за время 90 мин. Ни одна из других групп, обработанных видами L. ferrea , не показала релевантной анальгетической активности в тесте на горячей пластине. Карвалью и др. [27] продемонстрировали небольшое увеличение латентного времени (11,7 ± 0,8 с) при использовании дозы 100 мг / кг водного экстракта плодов L. ferrea в тесте на горячей пластине. Первая фаза формалинового теста оценивает активность в A-дельта-волокнах с участием брадикинина и вещества P [11, 41].Взятые вместе, эти результаты предполагают, что активные компоненты L. ferrea могут способствовать антиноцицептивному эффекту в A-дельта-волокнах.

5. Заключение

Это исследование доказало, что CE и фракции плодов L. ferrea показали важные противовоспалительные, антиоксидантные и периферические антиноцицептивные эффекты in vivo и повышенную жизнеспособность клеток in vitro . Биологическая активность анализируемых видов, вероятно, связана с присутствием биоактивных соединений, таких как галловая и эллаговая кислоты, выявленных при фитохимическом исследовании.Результаты настоящего исследования способствуют этнофармакологическому использованию L. ferrea .

Аббревиатуры
7 9107 Экстракт неочищенный 9108 9107 9108 неочищенный 903 93 3 UVamilium 8398 3 UVamilium 8398 9038 дисперсионный анализ
CE: Неочищенный экстракт
AqF: Водная фракция
C: Каррагинан
Каррагинан
CE40: Неочищенный водно-спиртовой экстракт 40% этанол
CE60: Неочищенный водно-спиртовой экстракт 60% этанол
CE80: 3 D: Диклофенак
EAF: Этилацетатная фракция
HPLC-DAD: Высокоэффективная жидкостная хроматография с детектированием на фотодиодной матрице
I8 93 I8 Модифицированная питательная среда Дульбекко
FBS: Фетальная бычья сыворотка
MTT: 3- (4,5-Диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид тетразолий
Комитет по этике по CEUA Использование животных
UFRN: Федеральный университет Риу-Гранди-ду-Норти
NIH: Национальный институт здравоохранения
i.р .: Внутрибрюшинно
MPO: Миелопероксидаза
MDA: Малоновый диальдегид
HTAB: Гексадецилтид HTAB: Видимый
GSH: -L-глутамил-L-цистеинил-глицин
SEM: Стандартная ошибка среднего
ANOVA: BAPTA-AM: 1,2-Бис (2-аминофенокси) этан-N, N, N ', N'-тетрауксусная кислота тетракис (ацетоксиметиловый эфир).
Доступность данных

Данные доступны у соответствующего автора по разумному запросу.

Этическое одобрение

Это исследование было одобрено Комитетом по этике использования животных / CEUA / Universidade Federal do Rio Grande do Norte / UFRN, протокол № 01/2015 Федерального университета Риу-Гранди-ду-Норти, Бразилия. Используемые протоколы ухода за животными и исследований были основаны на принципах и рекомендациях, принятых в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных.

Конфликты интересов

Мы хотим подтвердить, что нет известных конфликтов интересов, связанных с этой публикацией, и не было значительной финансовой поддержки этой работы, которая могла бы повлиять на ее результат.

Вклад авторов

Тамирес Роша Фалькао, Ауригена Антунес де Араужу, Луис Альберто Лира Соареш, Юри Брильханте де Фариас, Влиана Алвес Витурино да Силва, Магда Райанни Ассунсао Феррейра, Раймунду Арауньо де Жуладес и Медиана Араушандеш де, Раймунду Араужуандеш Коэльо Бернардо Герра внес существенный вклад в концепцию и дизайн исследования, а также в сбор, анализ и интерпретацию данных; Тамирес Роша Фалькао, Ауригена Антунес де Араужу, Луис Альберто Лира Соарес, Юри Брильханте де Фариас, Влиана Алвес Витурино да Силва, Магда Райанни Ассунсао Феррейра, Раймундо Фернандес де Араужу-младший, Джулиана Сильва де Медейруш и Луис Сильва де Медейруш, Мария Сильва де Медейруш Коэльо Бернардо Герра принимал участие в составлении рукописи и критическом пересмотре ее на предмет важного интеллектуального содержания; Тамирес Роша Фалькао, Ауригена Антунес де Араужу, Луис Альберто Лира Соарес, Юри Брильханте де Фариас, Влиана Алвес Витурино да Силва, Магда Райанни Ассунсао Феррейра, Раймундо Фернандес де Араужу-младший, Джулиана Сильва де Медейруш и Луис Сильва де Медейруш, Мария Сильва де Медейруш Коэльо Бернардо Герра окончательно утвердил версию, которая будет опубликована.Каждый автор принимал достаточное участие в работе, чтобы нести общественную ответственность за соответствующие части содержания; Тамирес Роша Фалькао, Ауригена Антунес де Араужу, Луис Альберто Лира Соарес, Юри Брильханте де Фариас, Влиана Алвес Витурино да Силва, Магда Райанни Ассунсао Феррейра, Раймундо Фернандес де Араужу-младший, Джулиана Сильва де Медейруш и Луис Сильва де Медейруш, Мария Сильва де Медейруш Коэльо Бернардо Герра согласился нести ответственность за все аспекты работы, обеспечивая надлежащее расследование и решение вопросов, связанных с точностью или целостностью любой части работы.

Благодарности

Мы благодарим проректора по исследованиям и аспирантуру фармацевтических наук / УФРН / Бразилия за их поддержку этого исследования. Эта работа была поддержана Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco / FACEPE (APQ-0493-4.03 / 14; BIC-0200-4.03 / 15; IBPG-0557-4.03 / 15) и Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CNPq (308386 / 2015-9).

Водный экстракт листьев Jatropha gossypiifolia L.(Euphorbiaceae) Ингибирует ферментативные и биологические действия змеиного яда Bothrops jararaca

Фитохимический анализ

водного экстракта листьев J. gossypiifolia

Фитохимический анализ водного экстракта листьев J. gossypiifolia проводили с помощью ТСХ. Но сначала неочищенный экстракт фракционировали путем разделения жидкость-жидкость для получения фракций с разной полярностью, что облегчило хроматографический анализ соединений.

Насколько нам известно, нет никаких фитохимических исследований, касающихся использования воды в качестве растворителя для экстракции J.gossypiifolia компонентов. Это важно отметить, так как широко используются настои или отвары, и поэтому мало что известно о составе этого вида экстракта. Кроме того, чаще всего в исследованиях, содержащихся в литературе, используются растворители или смеси растворителей с неполярными характеристиками, которые могут способствовать дальнейшей характеристике неполярных соединений, таких как терпеноиды и лигноиды. Выделение полярных соединений, таких как флавоноиды, дубильные вещества и сахара, пока плохо описано в отношении видов [14], [36].

Путем анализа методом ТСХ со специальными реагентами для спрея были обнаружены пятна, указывающие на присутствие алкалоидов, терпенов и / или стероидов, фенольных соединений, флавоноидов, дубильных веществ и аминов. Путем ко-ТСХ анализа, учитывая цвет, развиваемый природным реагентом А (реагент, специфичный для флавоноидов), Rf и точечное перекрытие со стандартом, можно было предположить присутствие флавоноидов ориентина, изоориентина, лютеолина, витексина и изовитексина в экстракт. За исключением лютеолина, другие флавоноиды уже были идентифицированы в листьях J.gossypiifolia [37], [38]. Для рода Jatropha лютеолин был описан ранее только для вида Jatropha unicostata [39].

Кроме того, количественно определенное содержание сахара, фенольных соединений и белков составило 20,0 ± 0,3, 18,7 ± 1,5 и 2,4 ± 0,4% соответственно. Таким образом, присутствие фенольных соединений и сахаров можно было подтвердить, и можно было визуализировать, что белки составляют лишь небольшой процент от состава неочищенного экстракта.

Присутствие флавоноидов и дубильных веществ может быть особенно интересным для антиофидных растений, поскольку флавоноиды способны стимулировать прочные водородные связи с амидами белковых цепей и проявлять хелатирующую активность с металлами, а дубильные вещества обладают способностью осаждать белки [8].Флавоноид лютеолин, например, как ранее описано в литературе, проявляет ингибирующее действие против гиалуронидаз из змеиного яда Crotalus adamenteus [40].

Анализ цитотоксичности

водного экстракта листьев J. gossypiifolia

Принимая во внимание, что видов Jatropha известны как токсичные [41], и принимая во внимание предыдущие исследования, которые показали, что этанольные экстракты из надземных частей J. gossypiifolia проявляют заметную токсичность, исследования цитотоксичности in vitro были проведены в качестве предварительного метода. для оценки потенциальной токсичности водного экстракта листьев J.gossypiifolia , использованные в данной работе.

В обеих использованных моделях цитотоксичности (гемолитическая активность и цитотоксичность в отношении клеток HEK-293) экстракт не проявлял цитотоксичности (результаты не показаны) ни в одной тестируемой концентрации (концентрации до 2 мкг / мкл). Важно отметить, что и эритроциты, и HEK-293 являются клетками человека, что может подтвердить настоящее наблюдение. Эти результаты могут свидетельствовать о том, что водный экстракт листьев по сравнению с этанольным экстрактом надземных частей, испытанным Mariz et al.[42], может быть менее токсичным, возможно, из-за возможной разницы в химическом составе, которая могла иметь место, принимая во внимание как различные части растения, так и растворитель экстрактора, использованный для различных приготовлений экстрактов. Фактически, исследование острой пероральной токсичности водного экстракта листьев J. gossypiifolia не показало никаких признаков токсичности у крыс в дозах до 2000 мг / кг [43]. Однако важно отметить, что токсичность водного экстракта листьев J.gossypiifolia не следует полностью выбрасывать, и необходимы дальнейшие исследования для обеспечения его безопасности.

Оценка антиофидной активности

водного экстракта листьев J. gossypiifolia

Растения из рода Jatropha часто обладают антиофидными свойствами [44]. Однако исследований, оценивающих антиофидную активность видов Jatropha , в литературе очень мало. Лишь некоторые исследования показали антиофидные свойства Jatropha elliptica и Jatropha mollissima, с интересными результатами, согласно испытанному яду [45], [46].Однако исследований, показывающих антиофидную активность J. gossypiifolia , не обнаружено. Ввиду этого и популярного использования растения этот вид был выбран в качестве объекта исследования.

SVSP и SVMP являются ключевыми элементами при отравлении Bothrops , особенно в отношении гемостатических эффектов [5], [47]. Таким образом, подавление протеолитических ферментов важно, когда речь идет о молекулах с антиофидной активностью. Змеиный яд богат несколькими протеолитическими ферментами, которые разрушают широкий спектр природных субстратов, таких как казеин, фибриноген и коллаген, среди прочих.Известно, что некоторые геморрагические и дефибриногенизирующие токсины в змеином яде проявляют значительную активность в отношении этих субстратов [48].

Следовательно, одним из первых тестов, проведенных в этом исследовании, было ингибирование протеолитической активности яда B. jararaca . Результаты, полученные в этом исследовании, показали, что экстракт эффективно ингибировал протеолитическую активность яда в отношении азоказеина, полностью подавляя активность при более высоких концентрациях (, рисунок 1, ).Этот результат указывает на значительное ингибирующее действие на SVSP и / или SVMP.

Фигура 1. Ингибирование азоказеинолитической активности B. jararaca водным экстрактом листьев J. gossypiifolia .

Яд B. jararaca (Bja), предварительно инкубированный в течение 60 мин при 37 ° C отдельно (контроль) или с различными соотношениями водного экстракта листьев J. gossypiifolia (Jg) (мас. / Мас.) (Тест ), инкубировали с азоказеином в течение 2 ч при 37 ° C. Реакцию останавливали трихлоруксусной кислотой и полученный супернатант (продукт реакции), смешанный с равным объемом NaOH, считывали при 440 нм.Заготовки для каждой концентрации готовили таким же образом, за исключением добавления азоказеина только после добавления трихлоруксусной кислоты. Процент активности рассчитывался как: [(ABStest - ABSblank) ÷ ABScontrol] × 100. Значения выражены как среднее ± SEM с n = 3. ** p <0,01 и *** p <0,001 по сравнению с контролем (1 ± 0 вес / вес, Bja: Jg) с помощью теста Тьюки (ANOVA).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0104952.g001

Несвертываемость крови, вызванная отравлением Bothrops , связана с комбинированным действием различных токсинов, таких как фибриногенолитические ферменты, тромбиноподобные ферменты змеиного яда (SVTLEs ) и активаторами факторов свертывания крови, которые являются протеазами [47], [49].Ингибирование этих токсинов может способствовать подавлению сценария несвертываемости крови. Таким образом, с учетом антипротеолитической активности экстракта была исследована возможная ингибирующая роль в несвертываемости крови.

Фибриногенолитические ферменты - это токсины, которые непосредственно отщепляют фрагменты, главным образом, от С-концевых областей Aα, Bβ и γ цепей молекулы фибриногена, что делает его неуклонным для тромбина. Эти ферменты не превращают фибриноген в фибрин, и продуцируемые продукты распада фибриногена обычно отличаются от продуктов, продуцируемых плазмином.Фибриногенолитические ферменты проявляют дефибриногенетическое действие in vivo , потребляя циркулирующий фибриноген, способствуя коагулопатии потребления. Поскольку уровень фибриногена быстро снижается, у пациента наблюдается тенденция к несвертыванию крови и увеличению времени свертывания [49], [50]. Как можно видеть на фиг. 2 , водный экстракт листьев J. gossypiifolia был способен ингибировать фибриногенолитические ферменты из B. jararaca . Экстракт в более высоких концентрациях защищал фибриноген от протеолитического действия яда, защищая его цепи Aα и Bβ.В присутствии серповидного количества экстракта можно наблюдать постепенное повторное появление цепей фибриногена (особенно цепи Bβ), а также постепенное исчезновение продуктов распада фибриногена, продуцируемых протеолитическим действием яда. С помощью зимографических экспериментов с использованием фибриногена в качестве субстрата было подтверждено ингибирование фибриногенолитической активности, и можно было наблюдать, что экстракт ингибирует предпочтительно различные фибриногенолитические ферменты B. jararaca примерно 26 и 28 кДа (результаты не показаны).

Фигура 2. Ингибирование фибриногенолитической активности B. jararaca водным экстрактом листьев J. gossypiifolia .

Яд B. jararaca (Bja), предварительно инкубированный в течение 60 мин при 37 ° C отдельно (контроль) или с различными соотношениями водного экстракта листьев J. gossypiifolia (Jg) (мас. / Мас.) инкубируют с фибриногеном 3 ч при 37 ° C. Реакцию останавливали подходящим буфером с последующим кипячением в течение 5 минут. Затем образцы анализировали с помощью SDS-PAGE 12% и окрашивали кумасси бриллиантовым синим G-250.A: SDS-PAGE гель. FIB: только фибриноген (контроль). B: денситографический анализ соответствующих линий геля SDS-PAGE, представленных в A.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0104952.g002

SVTLE - это SVSP, которые свертывают фибриноген in vitro , превращая фибриноген в фибрин. Однако, in vivo , эти токсины вызывают коагулопатию потребления, аналогичную диссеминированному внутрисосудистому свертыванию, что приводит к несвертыванию крови. Эти токсины, в отличие от тромбина, не активировали FXIII (стабилизатор фибрина фактора свертывания крови), что приводит к образованию аномальных фибриновых сгустков, состоящих из коротких полимеров, не стабилизированных сшивкой, катализируемой трансглутаминазой.Таким образом, фибринолитическая система быстро разрушает такие сгустки, способствуя наблюдаемому дефибриногенизирующему действию [49] - [51]. Согласно нашим результатам, основанным на ингибировании прокоагулянтной активности яда B. jararaca на фибриноген водным экстрактом листьев J. gossypiifolia (, таблица 1, ), можно предположить ингибирование SVTLE.

Также оценивали ингибирование прокоагулянтной активности яда B. jararaca в плазме, поскольку этот тест, наряду с SVTLE, также оценивает действие токсинов активаторов фактора свертывания крови.Эти токсины также обладают прокоагулянтной активностью in vitro , но действуют на активацию некоторых факторов свертывания крови, таких как FX и протромбин [47]. Как видно из , таблица 1 , экстракт также эффективно ингибировал прокоагулянтное действие яда на плазму. Хотя подавление свертывающей активности фибриногена не было полным, было замечено, что антикоагулянтная активность плазмы сохранялась до 10 мин после добавления яда. Это может означать, что экстракт может также подавлять действие других прокоагулянтных токсинов, а не только SVTLE.

Чтобы проанализировать, была ли антикоагулянтная активность, наблюдаемая в экстракте, связана с ингибированием токсинов, или было также антикоагулянтное действие на эндогенные факторы, были проведены тесты aPTT и PT с экстрактом в отсутствие яда. Как можно видеть на фиг. 3 , экстракт проявлял значительную антикоагулянтную активность, увеличивая время свертывания в тесте АЧТВ почти в 3 раза, показывая, что экстракт может действовать как на офидный, так и на эндогенный тромбин. Продление аЧТВ указывает на ингибирование внутреннего и / или общего пути [27].В PT не наблюдалось никакого эффекта, как показано на Рисунок 3 . Принимая во внимание, что активаторы факторов свертывания крови индуцируют выработку эндогенного тромбина, а также тот факт, что гепарин (антикоагулянтный препарат) способен ингибировать несвертываемость крови, продуцируемую токсинами активаторов FX из B. jararaca , можно выдвинуть гипотезу, что экстракт косвенно также подавляет прокоагулянтные эффекты, вызываемые активаторами факторов свертывания, уменьшая выработку эндогенного тромбина и, таким образом, ослабляя коагулопатию потребления.

Рисунок 3. Антикоагулянтная активность водного экстракта листьев J. gossypiifolia .

Различные концентрации водного экстракта листьев J. gossypiifolia (Jg) инкубировали с цитратной плазмой человека в течение 5 мин. После этого были проведены тесты активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) и протромбинового времени (ПВ) с использованием коммерческих наборов в соответствии с протоколом производителя. Значения выражены как среднее ± SEM с n = 3. * p <0,05 и *** p <0,001 по сравнению с контролем (отсутствие Jg) по критерию Тьюки (ANOVA).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0104952.g003

Фактически, водный экстракт листьев J. gossypiifolia в обеих испытанных дозах (50, 100 и 200 мг / кг) был пригоден для для ингибирования дефибриногенизирующего действия яда B. jararaca in vivo ( Таблица 2 ), что подтверждается результатами, полученными in vitro . Было замечено, что животные, которые получали только яд, имели несвертывающуюся кровь даже через 60 минут после сбора крови.С другой стороны, животные, которые получали яд, но получали экстракт перорально, восстанавливали способность к сгустку, показывая результаты, аналогичные контрольным животным (которые получали только PBS), показывая таким образом ингибирующий эффект экстракта.

В дополнение к изучению подавления системных эффектов после отравления также изучались местные эффекты. Ингибирование местного геморрагического действия яда B. jararaca водным экстрактом листьев J. gossypiifolia оценивали путем количественной оценки содержания гемоглобина в коже, в которую вводили яд.Как показано на фиг. 4 , пероральный прием экстракта явно уменьшал уровень кровотечения, вызванного ядом. Фактически, содержание гемоглобина было значительно снижено в группах лечения. Локальное кровоизлияние связано с действием геморрагических SVMP (геморрагинов), которые вызывают протеолиз компонентов базальной пластинки микрососудов с потерей целостности сосудистой стенки, что приводит к экстравазации крови на кожу [5], [52]. Таким образом, настоящий результат может указывать на ингибирующее действие на действие SVMP.

Фигура 4. Ингибирование геморрагической активности B. jararaca водным экстрактом листьев J. gossypiifolia .

Яд B. jararaca (Bja) вводили подкожно. в спинной области животных, получавших разные п.о. дозы водного экстракта листьев J. gossypiifolia (Jg). Через 3 часа внутреннюю поверхность кожи обнажили, сфотографировали и обработали для экстракции гемоглобина. Группа, получившая Bja s.c. и PBS p.o. использовался в качестве контроля яда (Bja).Другая группа, получившая PBS s.c. и перорально использовали в качестве отрицательного контроля (PBS). На верхней панели процент представленной активности рассчитывали как: [(содержание гемоглобина от обработанных животных ÷ содержание гемоглобина от контрольных животных Bja) × 100]. Значения выражены как среднее ± SEM с n = 5. *** p <0,001 по сравнению с контролем Bja (100% активности) с помощью теста Тьюки (ANOVA). На нижней панели представлен соответствующий аспект кожи из групп.

https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0104952.g004

PLA 2 s представляют собой суперсемейство липолитических ферментов, которые специфически катализируют гидролиз сложноэфирной связи в положении sn-2 глицерофосфолипидов, что приводит к образованию жирных кислот (арахидонат) и лизофосфолипиды [53], [54]. Помимо своей основной каталитической функции, змеиный яд PLA 2 s часто проявляет дополнительную фармакологическую активность, которая может быть независимой от каталитической активности. Геморрагическая, миотоксическая, гемолитическая, отечная и нейротоксическая активность, среди прочего, описана для PLA 2 , что указывает на действие PLA 2 s во многих фармакологических эффектах, наблюдаемых при отравлении змеями [53].Несколько исследований показали, что яды PLA 2 из Bothrops участвуют в воспалительных реакциях, таких как отек, боль, миграция лейкоцитов, некроз и миотоксичность [5], [55]. PLA 2 может быть классифицирован как Asp49 или Lys49 PLA 2 , в зависимости от остатка в положении 49 в аминокислотной последовательности. Asp49 PLA 2 s являются ферментативно активными, тогда как Lys49 PLA 2 s проявляют небольшую ферментативную активность или не проявляют никакой активности, хотя оба типа являются биологически активными [54], [55].

В активности фосфолипазы, протестированной в настоящем исследовании, очевидно, оценивалась только функция Asp49 PLA 2 s. В эксперименте водный экстракт листьев J. gossypiifolia был неактивным (результаты не показаны). В более высокой тестируемой концентрации (1-200 мас. / Мас., Яд: экстракт) экстракт ингибировал активность фосфолипазы примерно на 15%, однако это ингибирование не было статистически значимым (p> 0,05). Одна из возможных гипотез состоит в том, что экстракт может иметь большее сродство к ферментативно неактивным фосфолипазам, т.е.е., Lys49 PLA 2 . Так, in vivo, отечная и миотоксическая активность также были исследованы.

Ботропное отравление характеризуется быстрым развитием отека и воспаления в месте инокуляции ядом [5]. Внутриплантарная инъекция яда B. jararaca вызывает отечную реакцию, которая, по-видимому, опосредована в первую очередь эйкозаноидными продуктами циклооксигеназы и липоксигеназы и, в меньшей степени, увеличивает участие гистамина, серотонина и фактора активации тромбоцитов (PAF) [56] .Лейкоциты играют важную роль в воспалительной реакции, возникающей при отеке лапы, поскольку они способны секретировать эндогенные провоспалительные медиаторы, имеющие отношение к развитию острого воспаления [57]. Однако, в отличие от других местных эффектов, вызываемых прямым действием определенных токсинов, отечная активность, по-видимому, является результатом комбинированного действия различных токсинов (Asp49 или Lys49 PLA 2 и геморрагических или негеморрагических SVMP). , быстро вызывая высвобождение эндогенных медиаторов воспаления [58], [59].Фактически, их модуляция эндогенными медиаторами часто снижает эффективность противоядия, поскольку оно способно нейтрализовать токсины, но не может уменьшить воспаление, вызванное химическими медиаторами, выделяемыми этими токсинами [5].

Что касается наших результатов с экстрактом J. gossypiifolia , было замечено, что экстракт п.о. путь, ингибировал отечную реакцию примерно на 40% после 120 мин инъекции яда ( Рисунок 5A ). Как можно видеть на фиг. 5A , экстракт был активен при 100 и 200 мг / кг, с ингибирующим действием, начинающимся через 90 минут после инъекции яда.Что касается активности МПО, то точно так же экстракт был активен при 100 и 200 мг / кг, показывая примерно 20% ингибирование активности МПО ( фиг. 5В, ). С i.p. При лечении экстрактом были получены даже лучшие результаты, что можно было наблюдать по полному подавлению отечной активности после 120 мин инъекции яда (, фиг. 5C, ). Автор: i.p. Таким образом, экстракт смог снизить активность MPO примерно на 50% (, фиг. 5D, ). Ожидается различная активность экстракта в обоих используемых маршрутах, поскольку они имеют разные профили биодоступности.Это значительное ингибирование активности MPO может указывать на то, что противоотечный эффект, проявляемый экстрактом, может быть связан с ингибированием миграции клеток, поскольку этот фермент является количественным маркером притока воспалительных клеток в ткань лапы, инъецированной ядом [32]. Что касается возможного механизма, посредством которого экстракт может действовать в этой модели, некоторые гипотезы могут быть приняты во внимание на основе полученных экспериментальных результатов. Как только экстракт стал неактивным в отношении Asp49 PLA 2 , можно было указать на возможное ингибирование Lys49 PLA 2 .Другой возможностью может быть ингибирующее действие на SVMP, поскольку экстракт также проявлял антигеморрагический эффект, как обсуждалось ранее. Кроме того, другая правдоподобная гипотеза заключается в том, что экстракт может обладать сильной противовоспалительной активностью и, таким образом, может уменьшать воспаление, вызываемое эндогенными химическими медиаторами, выделяемыми токсинами. Фактически, некоторые исследования показали, что противовоспалительные препараты могут подавлять отечную реакцию, вызванную ядом B. jararaca [60].Кроме того, некоторые исследования показали противовоспалительную активность экстрактов листьев и надземных частей J. gossypiifolia на различных моделях воспаления [61] - [63].

Фигура 5. Ингибирование отечной активности B. jararaca водным экстрактом листьев J. gossypiifolia .

Яд B. jararaca (Bja) вводили i.pl. в правой задней лапе животных, получавших разные п.о. или i.p. дозы водного экстракта листьев Дж.gossypiifolia (Jg). Толщину правой задней лапы дополнительно измеряли через 0, 30, 60, 90 и 120 мин после инъекции. Группа, получившая Bja i.pl. и PBS p.o. или i.p. использовался в качестве контроля яда (Bja). Другая группа, получившая PBS i.pl. и п.о. или i.p. использовали в качестве отрицательного контроля (PBS). Отек выражался как разница между толщиной лапы после (в соответствующее время) и до (базовые значения) инъекции яда, рассчитывалась следующим образом: [(время толщины «t» - толщина до инъекции) ÷ толщина до инъекции] × 100 и представлен в А (с.о.) и C (i.p.). В конце эксперимента лапы обрабатывали для экстракции фермента миелопроксидазы (МПО). Активность МПО рассчитывалась как [(МПО от обработанных животных ÷ МПО от контрольных животных Bja) × 100] и представлена ​​в B (p.o.) и D (i.p.). Значения выражены как среднее ± SEM с n = 5. * p <0,05 и *** p <0,001 по сравнению с контролем Bja (100% активности) с помощью теста Тьюки (ANOVA).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0104952.g005

Некроз мышц - это релевантный местный эффект, вызванный ботропным ядом, поскольку он может привести к необратимой потере тканей, инвалидности и ампутации [55]. Миотоксичность может возникать из-за прямого разрыва мышечных клеток (токсины PLA 2 ) или непрямого действия, которое связано с развитием ишемии в результате резкого изменения, вызванного геморрагическими токсинами SVMP как в микрососуде, так и в внутримышечных артериях [5] . Повреждение мышц приводит к разрыву клеточной мембраны, что приводит к быстрому высвобождению цитозольных маркеров, таких как креатинкиназа (CK) [5], [55].В настоящей работе, как можно видеть на фиг. 6 , водный экстракт листьев J. gossypiifolia , оба p.o. и i.p. маршрутов, смог снизить уровни КК у животных, которым вводили яд B. jararaca , что указывает на антимиотоксическое действие. Интересно, что автор i.p. При приеме внутрь антимиотоксический эффект достигал почти 100%, начиная с наименьшей дозы. Можно предположить ингибирующее действие против Lys49 PLA 2 . Другая гипотеза, возможно, наиболее вероятная согласно нашим результатам, заключается в том, что альтернативно или дополнительно к действию на Lys49 PLA 2 , экстракт, ингибируя геморрагическую активность, может снизить непрямую миотоксическую активность, продуцируемую геморрагическими SVMP.Фактически, животные из обработанных групп по сравнению с контрольными (получавшими PBS) показали в мышечной области, куда вводили яд, очень значительное уменьшение кровотечения (результаты не показаны), что может подтвердить идею о том, что ингибирование геморрагическая активность была важна для уменьшения повреждения мышц.

Фигура 6. Ингибирование миотоксической активности B. jararaca водным экстрактом листьев J. gossypiifolia.

Был введен яд B. jararaca (Bja) i.м. в левом бедре животных, получавших разные п.о. (A) или i.p. (B) дозы водного экстракта листьев J. gossypiifolia (Jg). Через 3 часа кровь собирали для определения креатинкиназы (КК). Группа, получившая Bja i.m. и PBS p.o. или i.p. использовался в качестве контроля яда (Bja). Другая группа, получившая PBS i.m. и п.о. или i.p. использовали в качестве отрицательного контроля (PBS). Процент активности рассчитывали как: [(CK от обработанных животных ÷ CK от контрольных животных Bja) × 100].Значения выражены как среднее ± SEM с n = 5. * p <0,05 и *** p <0,001 по сравнению с контролем Bja (100% активности) с помощью теста Тьюки (ANOVA).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0104952.g006

Таким образом, полученные результаты показывают эффективность водного экстракта листьев J. gossypiifolia при лечении системных, а также местных эффектов, вызываемых B. jararaca , который, в свою очередь, не эффективно подавляется традиционной терапией противоядной сывороткой. Таблица 3 суммирует процент ингибирования экстрактом геморрагической, отечной и миотоксической активности, вызванной инъекцией B. jararaca .

В целом механизм, с помощью которого лекарственные растения нейтрализуют токсическое действие ядов змей, до сих пор неизвестен, но было предложено множество гипотез, таких как осаждение белка, протеолитическая деградация, инактивация ферментов, хелатирование металлов, антиоксидантное действие или комбинация этих механизмов. [11].

Согласно нашим результатам, можно было наблюдать, что экстракт не оказывал протеолитического действия на белки, включая яд, поскольку не наблюдалось никаких изменений в электрофоретической картине этих белков, за исключением постепенного исчезновения полос с увеличением концентрации. экстракта, что может указывать на действие осаждения белка (результаты не показаны). Соответственно, был проведен анализ связывания красителя с белком Брэдфорда для анализа этого возможного действия экстракта по осаждению белка.Как можно увидеть в , Таблица 4 , водный экстракт листьев J. gossypiifolia был способен осаждать как альбумин, так и белки яда B. jararaca в обеих испытанных концентрациях. Достигнутый процент осаждения белков яда составил почти 100%. Таким образом, полученные результаты могут объяснить, по крайней мере частично, ингибирующие эффекты, представленные водным экстрактом листьев J. gossypiifolia .

Другая активность, исследованная в водном экстракте листьев J.gossypiifolia обладает антиоксидантным потенциалом. Змеиный яд вызывает сильное воспаление и локальное повреждение тканей, заставляя макрофаги и нейтрофилы генерировать активные формы кислорода, такие как супероксидные радикалы, которые действуют, образуя перекиси липидов, которые могут вызвать некроз [64]. В целом считается, что ингибирование перекисного окисления липидов может быть полезным против токсических эффектов, вызываемых змеиным ядом, и что антиоксидантный процесс может быть важным механизмом, с помощью которого могут действовать антиофидные молекулы [11], [64].В настоящей работе водный экстракт листьев J. gossypiifolia проявлял значительную антиоксидантную активность во всех протестированных моделях in vitro (, таблица 5, ). Экстракт был способен хелатировать ионы металлов (медь и железо), улавливать свободные радикалы (гидроксил и супероксид) и обладал восстанавливающей способностью. Следовательно, возможная гипотеза состоит в том, что антиофидная активность экстракта может быть связана, по крайней мере частично, с его способностью ингибировать окислительный стресс, вызванный отравлением, и, следовательно, косвенно ингибировать процесс некроза.Аналогичные наблюдения были сделаны другими авторами при оценке антиофидной и антиоксидантной активности экстракта растения Crinum jagus [65].

Хелатирующее действие, проявляемое экстрактом в антиоксидантных анализах, очень интересно, поскольку некоторые токсины нуждаются в металлах в качестве важных кофакторов для их ферментативной активности, как, например, SVMP, которые зависят от металлопротеиназ и цинка. Хелатирующие агенты с металлами, такие как ЭДТА или или -фенантролин, подавляют действие этих токсинов [66].Таким образом, можно указать на гипотезу, что одним из возможных механизмов ингибирования SVMP, представленных водным экстрактом листьев J. gossypiifolia , является хелатирование металлов. Фактически, недавнее исследование показало, что гликолевая кислота, мощный антиоксидант и хелатор металлов, способна ингибировать ферментативные и биологические эффекты SVMP BaP1, металлопротеиназы, выделенной из змеиного яда Bothrops asper [67].

Таким образом, результаты, представленные в этой статье, демонстрируют эффективность водного экстракта листьев J.gossypiifolia в качестве антиофидного средства с ингибирующим действием на кровоостанавливающие и воспалительные эффекты, вызванные ядом B. jararaca . Важно отметить, что используемый способ введения (пероральный путь) имитирует популярное использование растения в качестве чая, показывая, что этот продукт может быть, по крайней мере, хорошим паллиативом от укуса змеи, пока не будет начато конкретное лечение, учитывая, что противоядие во многих случаях может быть труднодоступным. Другая точка зрения состоит в том, что чай из листьев J.gossypiifolia может использоваться в качестве адъюванта к терапии противоядной сывороткой. В любом случае использование растения может быть выгодным с учетом его способности обращать вспять системные и местные эффекты, а также его легкой доступности и низкой стоимости, присущих его приготовлению. Обзор результатов, полученных в настоящей статье, представлен на рис. S2 .

Дальнейшие исследования, направленные на выделение биологически активных соединений сырого экстракта, особенно флавоноидов, продолжаются в нашей исследовательской группе.Кроме того, в качестве перспективы на будущее, чтобы лучше понять ингибирующий эффект, проявляемый водным экстрактом листьев J. gossypiifolia , мы намерены тщательно изучить взаимодействие между биологически активными соединениями, выделенными из экстракта, с токсинами, выделенными из яда B. jararaca , например SVMP и Lys49 PLA 2 .

В заключение, результаты демонстрируют потенциальную антиофидную активность водного экстракта листьев J. gossypiifolia , в том числе его значительное действие на местные эффекты, что позволяет предположить, что этот вид может быть использован в качестве нового источника биоактивных молекул против ботропного яда, особенно для яда ботропов. лечение ядовитыми местными эффектами.

А ЛЕГКАЯ БИБЛИОТЕКА ДЛЯ ИЗВЛЕЧЕНИЯ АУДИО ФУНКЦИЙ

5.1. Плагин Vamp libxtract API плагина анализа Vamp был разработан Крисом Каннэмом для программного обеспечения Sonic Visualiser 5. Звуковой визуализатор это приложение для визуализации функций, извлеченных из аудиофайлы, он был разработан в Университете Королевы Марии из Лондона и находит применение в музыковедении, исследованиях обработки сигналов и практике исполнения [4]. Соник Visualiser действует как хост плагинов Vamp с плагинами Vamp. предоставление ему данных анализа.libxtract используется для обеспечения функций анализа для Sonic Визуализатор с использованием плагина vamp-libxtract. Плагин vamplibxtract действует как оболочка для библиотеки libxtract, делая почти весь набор функций libxtract доступным для любого хоста-вампира. Это делается путем предоставления только минимальный набор комбинаций функций, значение в том, что возможность экспериментировать с различными каскадные функции теряются. 5.2. Внешний вид PD и Max / MSP Библиотека libxtract поставляется с внешним интерфейсом Pure Data (PD), который действует как оболочка для API библиотеки.Это идеальный вариант использования, поскольку он позволяет произвольно каскадировать функции извлечения функций и для непроверенных данных для передачи в качестве аргументов через объект [xtract ~] правый впуск. Недостаток такого подхода в том, что он требует, чтобы пользователь узнал, как работает библиотека, и ограниченно понимать, что делает каждая функция. Доступен внешний Max / MSP, который обеспечивает функциональность, аналогичную внешнему PD. 5.3. SC3 ugen Также существует оболочка Supercollider libxtract от Дэна. Стоуэлл.Это реализовано в виде ряда UGen SuperCollider, которые представляют собой объектно-ориентированные блоки DSP с множеством экземпляров 6. Основное внимание в работе Stowell над libxtract уделяется основанному на libxtract UGen MFCC, но несколько другие Ugens на основе libxtract находятся в стадии разработки. 6. ИЗВЛЕЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ВЫСОКОГО УРОВНЯ Основная задача библиотеки libxtract - извлечение относительно низкоуровневых функций. Однако один основными причинами его развития было то, что он мог служить основа для извлечения более семантически значимых функций.Они могут включать психоакустические особенности, такие как как грубость, резкость и громкость [10], некоторые из которых включены в библиотеку; выходы классификации приборов [3]; или произвольные определяемые пользователем дескрипторы, такие как «Danceability» [7]. Эти «высокоуровневые» функции можно извлечь с помощью используя libxtract для извлечения вектора признаков, который может быть построены с использованием результатов ряда экстракций функции. Затем этот вектор можно передать на отображение, которое влечет за собой дальнейшее уменьшение размерности 5http: // www.sonicvisualiser. org 6 http: // mcld. co.uk/supercollider данные. Возможные алгоритмы для задачи уменьшения размерности включают Neural Networks, k-NN и Multidimensional Gauss [11]. На рисунке 2 показана реализация уменьшения размерности в Pure Data с использованием [xtract ~] Оболочка libxtract и [ann-mlp] Fast Artificial Neural Оболочка библиотеки Network 7 (FANN) от Davide Morelli8. Расширенная версия этой системы недавно была использован в одном из авторских сочинений для фортепиано и Живая электроника.Для этой конкретной детали, патч PD был создан, чтобы определить, воспроизводился ли конкретный аккорд сыграно, и, соответственно, добавить к фортепиано эффект «резонанса». Для аспекта обнаружения патча набор звуковых функций, представленных в виде значений с плавающей запятой, «упаковывается» в список с использованием объекта PD [pack]. Эти данные используются для обучения нейронной сети (многослойной перцептрон), последовательно представляя его входными списками, за которым следует соответствующий ожидаемый результат. Однажды сеть была обучена (давая минимально возможный ошибка), он может работать в режиме "Выполнить", при этом он должен дать соответствующий результат при представлении новых данных, которые показывает сходство с данными обучения.С закрытым микрофоном студийная запись в сухой акустике, среднее детектирование Достигнута точность 92%. Это упало примерно до 70% в концертной среде. Исследование этих результаты выходят за рамки данной статьи. Другой возможный вариант использования библиотеки - в качестве источника для непрерывного сопоставления с выходным пространством признаков. С участием при непрерывном отображении классификатор дает в качестве выходных данных местоположение на карте малой размерности, а не дает дискретное «решение» классификации. Это было реализовано в одной из последних работ автора для флейты и живой электроники, где флейтист может управлять классификатором выход, изменяя их инструментальный тембр.Семантический дескрипторы использовались для обозначения определенных местоположений на карте, и близость к этим местам была измерена и использована в качестве источник управляющих данных в реальном времени. Система использовалась для Измерьте «дыхание» и «пронзительность» тембра флейты. Дальнейшая работа может включать в себя распознавание тембрального жесты в этом результирующем потоке данных. 7. ЭФФЕКТИВНОСТЬ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ Библиотека в ее нынешнем виде не дает никаких гарантий относительно сколько времени потребуется для выполнения функции. Для любой для данного размера блока нет определенного поведения, определяющего что произойдет, если функция не вернется в продолжительность блока.Большинство функций извлечения имеют алгоритмический эффективность 0 (n) или выше, что означает, что время вычисления обычно пропорционален размеру используемого аудиоблока. Однако из-за того, как была спроектирована библиотека (была предоставлена ​​гибкость комбинации функций приоритет), некоторые функции в конечном итоге вычисляются сравнительно неэффективно. Например, если только эксцесс функция требовалась в системе, показанной на рисунке 1, функции xtract ~ mean (), xtract ~ variance (), 7 http: // leenissen.dk / fann / 8 http: //www.davidemorelli. Это 27

ПРАЙМ PubMed | Водный экстракт листьев Jatropha gossypiifolia L. (Euphorbiaceae) подавляет ферментативное и биологическое действие змеиного яда Bothrops jararaca

Citation

Félix-Silva, Juliana, et al. «Водный экстракт листьев Jatropha Gossypiifolia L. (Euphorbiaceae) ингибирует ферментативные и биологические действия змеиного яда Bothrops Jararaca». PloS One, т. 9, вып. 8, 2014, стр. E104952.

Феликс-Силва Дж., Соуза Т., Менезес Ю.А. и др. Водный экстракт листьев Jatropha gossypiifolia L. (Euphorbiaceae) подавляет ферментативное и биологическое действие яда змеи Bothrops jararaca. PLoS One . 2014; 9 (8): e104952.

Феликс-Сильва, Дж., Соуза, Т., Менезес, Ю.А., Кабрал, Б., Камара, Р.Б., Сильва-Джуниор, А.А., Роча, HA, Ребекки, И.М., Зуколотто, С.М., и Фернандес-Педроса, MF (2014). Водный экстракт листьев Jatropha gossypiifolia L. (Euphorbiaceae) подавляет ферментативное и биологическое действие яда змеи Bothrops jararaca. PloS One , 9 (8), e104952. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0104952

Félix-Silva J, et al. Водный экстракт листьев Jatropha Gossypiifolia L. (Euphorbiaceae) ингибирует ферментативные и биологические действия змеиного яда Bothrops Jararaca. PLoS One. 2014; 9 (8): e104952. PubMed PMID: 25126759.

TY - JOUR T1 - Водный экстракт листьев Jatropha gossypiifolia L. (Euphorbiaceae) подавляет ферментативное и биологическое действие змеиного яда Bothrops jararaca.AU - Феликс-Сильва, Юлиана, AU - Соуза, Тьяго, AU - Menezes, Yamara A S, Австралия - Кабрал, Барбара, AU - Камара, Рафаэль Б.Г., AU - Сильва-Жуниор, Арнобио А, AU - Rocha, Hugo A O, AU - Ребекки, Иванис М М, AU - Zucolotto, Silvana M, AU - Фернандес-Педроса, Матеус Ф, 1-й год - 2014/08/15 / PY - 2014/05/21 / получено PY - 2014/07/16 / принято PY - 2014/8/16 / entrez PY - 2014/8/16 / pubmed PY - 2015/12/17 / medline SP - e104952 EP - e104952 JF - PloS one JO - PLoS One ВЛ - 9 ИС - 8 N2 - Змеиные укусы представляют собой серьезную проблему для общественного здравоохранения из-за их высокой смертности.Основным доступным специфическим лечением является терапия противоядной сывороткой, которая имеет некоторые недостатки, такие как плохая нейтрализация местных эффектов, риск иммунологических реакций, высокая стоимость и труднодоступность в некоторых регионах. В этом контексте актуален поиск альтернативных методов лечения. Таким образом, целью этого исследования было оценить антиофидные свойства Jatropha gossypiifolia, лекарственного растения, используемого в народной медицине для лечения укусов змей. Водный экстракт листьев растения получали отваром, и фитохимический анализ показал присутствие сахаров, алкалоидов, флавоноидов, дубильных веществ, терпенов и / или стероидов и белков.Экстракт был способен ингибировать ферментативную и биологическую активность, вызванную змеиным ядом Bothrops jararaca in vitro и in vivo. Несвертываемость крови эффективно подавлялась экстрактом при пероральном введении. Геморрагические и отечные местные эффекты также подавлялись, первое - на 56%, второе - на 100%, у животных, получавших экстракт перорально и внутрибрюшинно, соответственно. Подавление миотоксического действия B. jararaca достигало почти 100%. Согласно проведенным ферментативным тестам, можно предположить, что антиофидная активность может быть обусловлена ​​ингибирующим действием на металлопротеиназы змеиного яда (SVMP) и / или сериновые протеиназы (SVSP), включая фибриногенолитические ферменты, активаторы факторов свертывания и тромбиноподобные ферменты (SVTLEs). ), а также на каталитически неактивных фосфолипазах А2 (Lys49 PLA2).Противовоспалительная активность, по крайней мере частично, также может быть связана с подавлением местных эффектов. Кроме того, осаждение белка и антиоксидантная активность также могут быть важными характеристиками, способствующими представленной активности. В заключение, результаты демонстрируют потенциальную антиофидную активность экстракта J. gossypiifolia, включая его значительное действие на местные эффекты, что позволяет предположить, что он может быть использован в качестве нового источника биоактивных молекул против ботропного яда. СН - 1932-6203 UR - https: // neuro.unboundmedicine.com/medline/citation/25126759/a Water_leaf_extract_of_jatropha_gossypiifolia_l___euphorbiaceae__inhibits_enzymatic_and_biological_actions_of_bothrops_jararaca_snake_venom_ L2 - https://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0104952 БД - ПРЕМЬЕР DP - Unbound Medicine ER -

Путеводитель по карте Побег из Тарковского леса: все выдержки

Планируете экскурсию в лес? Беспокоитесь о плотной путанице деревьев и врагов? Знание того, что вы собираетесь делать, является ключом к получению максимальной отдачи от бега.Знание мест появления, добычи, местоположения и расстановки босса может сделать каждое прохождение более прибыльным.

Woods, вероятно, одна из наименее щадящих карт с ограниченным лутом, доступным для тех, кто не хочет сражаться за него, невероятно длинными линиями обзора и множеством листвы, чтобы скрыть врагов.

Выжить в любом рейде в этом хардкорном FPS может оказаться непростой задачей, если вы не готовы, поэтому ознакомьтесь с нашими руководствами по боеприпасам «Побег из Таркова», по добыче на таможне и нашими общими советами о том, как сбежать из Таркова.Тем не менее, это кажется более заметным в лесу, где смерть может прийти через карту в один выстрел, который вы никогда не слышали. Собираетесь ли вы за Штурманом, другими игроками или просто выполняете несколько задач, это руководство предоставит вам все инструменты, необходимые для того, чтобы пережить вашу сегодняшнюю поездку в лес, и выйдет с некоторыми редкими видами оружия, доспехами и предметами для обмена. через выдержки Вудса.

Появляется ЧВК в Вудсе

Позиции вставки на Лесу следуют обычному шаблону Escape From Tarkov.Группа точек на восточной стороне, возле блокпостов, и еще одна группа на западе, возле окраин. Игроки, прибывающие на эти точки возрождения, должны будут перейти на противоположную сторону. Это означает, что вы путешествуете параллельно с теми, кто появился рядом, и сталкиваетесь лицом к лицу с теми, кто этого не сделал.

Появляется в Вест-Вудсе

Появляются на западной стороне карты, начинаются в точке извлечения западной границы и чередуются вдоль западной стены, с некоторыми возле дорожного блока ООН возле северной стены.Эти точки возрождения находятся рядом с некоторыми из самых открытых частей карты, где каменистые траншеи расчищают деревья, оставляя длинные линии обзора и множество игроков, которые могут броситься вперед и совершить несколько ранних убийств на расстоянии. По возможности старайтесь держаться за деревья и сохраняйте маскировку, чтобы быть уверенным, что вы сделаете первый выстрел.

Восточный лес нерестится

Эти точки возрождения сосредоточены вокруг точки извлечения Окраины и простираются от Лодки до ZB-014. Если ваше возрождение близко к дому Scav и окраинам, имейте в виду, что игроки, вероятно, будут вращаться вокруг вашей позиции, однако густая листва может означать, что сражения будут происходить с близкого расстояния.Постарайтесь двигаться быстро, убедившись, что ваш путь свободен, или найдите место, где можно переночевать, и подождите, пока игроки пройдут мимо вас. Большинство врагов направляются к складу леса к востоку от этих мест возрождения, поэтому вы, скорее всего, встретите контакт с запада. Помните о Доме Диких, поскольку в нем обычно много ИИ Дикарей, с которым нужно бороться, но в первые минуты рейда, скорее всего, появятся немногие.

Точки извлечения карты Вудса

Есть много способов извлечь из леса, но некоторые требуют дополнительного планирования, чтобы убедиться, что они доступны.От ключей, дружелюбных дикарей и рублей у вас есть несколько способов обезопасить свою добычу. Менее популярные пути могут обеспечить вам более спокойный выход, но они не всегда доступны, и чем больше у вас информации, тем более гибким вы можете быть в своем подходе. Не забудьте дважды нажать O и убедиться, что вы движетесь в правильном направлении.

Выдержка из блокпоста RUAF на Вудс

Находятся в самом северо-западном углу Вудса, есть большие металлические ворота.Этот экстракт доступен только в том случае, если на ржавой бочке горит зеленая ракета. К нему можно подойти с воды или по дороге через северную стену.

Вытяжка Factory Gate по лесу

На полпути вдоль северной стены с западной стороны, между блокпостом RUAF и блокпостом ООН, есть ворота, ведущие к фабрике. Этот отрывок может быть сложным в использовании, потому что он требует, чтобы вы взяли с собой дружественного игрока Scav, а его трудно найти.

Выдержка из блокпоста ООН в лесу

Напротив блокпоста RUAF, в верхней части самой западной стены, есть еще один большой блокпост. Эта вытяжка окружена большими стенами, что делает ее безопасным местом для выхода. Он всегда доступен тем, кто появился на восточной стороне.

Выдержка при спуске со скалы в лесу

В середине южной части карты есть небольшая трещина в большой горе. На поддоне деревянная обрешетка.Если вы взяли дорогой ледоруб Red Rebel, у вас есть паракорд и нет жилета, то этот отрывок вам доступен. Этот отрывок требует некоторого планирования и финансовых вложений, но позволит вам быстро сбежать с ближайшего лесного склада.

Вытяжка South V-Ex на Вудс

К востоку от выхода Cliff Descent Extraction есть дорога, ведущая от склада пиломатериалов к южной внешней стене. Здесь есть красные ворота, в которых припаркован внедорожник.Если внедорожник есть, то можно потратить три тысячи рублей на человека и получить от рейда до четырех ЧВК. Водителю требуется минута, чтобы уехать, и как только он будет использован, никто больше не сможет уйти этим путем.

Экстракт окраин в лесу

На восточной стороне карты есть главная дорога, ведущая на север. Вверху этой дороги есть большая территория, обозначенная как выемка на окраине, сосредоточенная вокруг ворот, рядом с которой стоит ветхая машина. Эта большая зона позволяет вам продолжать движение на протяжении всего обратного отсчета экстракции и имеет много листвы, чтобы вы были спрятаны.

ZB-014 вытяжка по Вудсу

На восточной стене, к югу от Дома Scav, есть бункер, встроенный в землю. Если добыча доступна, то снаружи будет видна зеленая засветка. Не забывайте о скалах поблизости, так как они являются популярным местом для кемпинга. Как только вы войдете внутрь, вам понадобится ключ ZB-014, чтобы открыть внутреннюю дверь и сбежать.

ZB-016 вытяжка по Вудсу

К юго-западу, между разбившимся самолетом и Старой станцией, есть еще один бункер, встроенный в землю.Для этого не требуется ключ, но он доступен только при наличии зеленой вспышки.

Лут и Штурман, лесной босс

Woods - смертоносная карта с очень небольшим количеством добычи, чтобы компенсировать риск, с несколькими разбросанными ящиками и Scav в качестве единственных источников добычи за пределами Lumberyard. Если вы все же рискнете попасть на Лесной склад в надежде на крупный счет, то вы будете стрелять в Штурмана, и игроки тоже будут охотиться за ним. Он - босс Scav Вудса и вооружен СВДС.У него больше очков жизни, чем у большинства Дикарей, и он смертельно точен. За ним следуют двое последователей по фамилии Светлоозерский. Они вооружены дальнобойным оружием с высоким уроном и большим количеством гранат. Штурман и его последователи не носят шлемов, но могут иметь бронежилет высокого уровня, поэтому рекомендуется прицеливаться в голову. Снаряжение, полученное у этих врагов, обычно является ценным, и у Штурмана может быть даже редкий ледоруб Красный мятежник, который стоит миллионы на блошином рынке.

Уникальный предмет добычи Штурмана - его ключ, которым можно открыть ящик на лесном складе.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *